Espressione di CD200/OX-2 nella leucemia a cellule ...gic. FAD/FAD 2013/Modulo-La Citometria...

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INTRODUZIONECD200 (precedentemente chiamato OX-2) una glico-proteina di membrana con funzione immunosoppresso-ria. La sua porzione extramembrana possiede due domi-ni della superfamiglia delle immunoglobuline in grado dimediare interazioni cellula-cellula. CD200 espresso sulinfociti B, linfociti T, cellule dendritiche e vari tessutisolidi [1]. Contrariamente allampio pattern di espressio-ne di CD200, lespressione del suo recettore (CD200R) ristretta esclusivamente ai leucociti. Esso stato, infatti,individuato solamente su macrofagi, cellule dendritiche,mast-cells, linfociti B e linfociti T [2]. In modelli sperimentali, linterazione tra CD200 eCD200R causa (a) una riduzione della sintesi delle cito-chine Th1-like, come linterleuchina (IL)-2 e linterefe-rone (IFN)-, (b) un aumento della produzione di citochi-ne Th2-like come lIL-4 e lIL-10 [3] e (c) un aumento,in vitro, del differenziamento dei linfociti T verso il com-partimento Treg CD4+CD25+Foxp3+ [4]. In base a questielementi, risulta chiaro come CD200 determini una ridu-zione della risposta citotossica mediata da cellule T. Unaneoplasia esprimente CD200 potrebbe sfruttare lintera-zione CD200-CD200R per evadere la risposta citotossi-ca antitumorale dellospite. La positivit per questamolecola , infatti, considerata un fattore prognosticosfavorevole nella leucemia mieloide acuta (LAM) [5] enel mieloma multiplo (MM) [6], e la sua espressione stata descritta anche su alcune cancer stem cells [1]. McWhirter, dopo aver dimostrato che CD200 costante-mente overespresso nella leucemia linfatica cronica, hagenerato un anticorpo monoclonale umanizzato (Anti-CD200 MAb) in grado di inibire linterazione tra CD200e il suo recettore [7]. Partendo da questi dati abbiamo deciso di estendere lostudio dellespressione di CD200 ad unaltra malattialinfoproliferativa a cellule B: la leucemia a cellule capel-lute (HCL). La HCL una patologia linfoproliferativa cronica a cel-lule B che tipicamente si manifesta con pancitopenia,splenomegalia e infezioni ricorrenti. E unentit nosolo-

gica distinta nella classificazione della World HealthOrganization (WHO), poich mostra specifiche caratteri-stiche clinico-patologiche e biologiche [8]. Dato che lecellule capellute possiedono un immunofenotipo caratte-ristico, la citometria a flusso , ad oggi, la migliore meto-dologia di laboratorio per la diagnosi di HCL.

MATERIALI E METODIDurante il 2008 abbiamo studiato un totale di dieci casidi HCL di nuova diagnosi. Sette casi sono stati diagno-sticati come HCL classica, uno stato definito HCLvariante e due sono stai classificati come HCL classicacon espressione aberrante di CD10. Sono stati analizzatisei campioni di sangue venoso periferico (PB) e quattroaspirati midollari (BM). Come controllo abbiamo studia-to dieci campioni di PB e due BM prelevati da donatorisani.Lanalisi stata condotta utilizzando il citometro FACSCanto II (Becton Dickinson, BD, San Jose, CA, USA).In breve, 50 L di campione sono stati incubati per 30minuti con una quantit appropriata di anticorpo. Inseguito il campione stato lisato con una soluzione dicloruro di ammonio per 10 minuti, poi lavato e risospesoin 300 L di PBS e successivamente acquisito per lana-lisi citometrica. Complessivamente, abbiamo studiato i seguenti antigeni:CD200, SmIg-kappa, SmIg-lambda, CD45, CD19, CD5,CD23, CD20, CD22, CD103, CD11c, CD25, CD43,CD10, CD3, CD56 e CD81. Le cellule capellute sonostate selezionate applicando un gate sugli eventiCD45+CD19+ con aspetto monocitoide (ossia concaratteristiche di light scatter tipiche dei monociti). In seicasi su dieci abbiamo allestito unanalisi multiparametri-ca in grado di selezionare le cellule patologiche comeCD45+CD103+CD11c+CD19+ (figura 1a e 1b). I linfoci-ti B dei controlli sani sono stati studiati applicando ungate sulle cellule CD45+CD19+ (figura 2a). Su questepopolazioni sono state calcolate le percentuali di cellulepositive (PPC) per CD200 e lintensit mediana di fluo-rescenza (MFI) dello stesso antigene.

9ATTIVIT SCIENTIFICALettere GIC Vol. 17, Num. 3 - Dicembre 2008

Espressione di CD200/OX-2nella leucemia a cellule capellute:

implicazioni per lanalisi cellulare clinica e perlimmunoterapia con anticorpi monoclonali

1Lorenzo Brunetti, 1Rosa Di Noto, 1Giovanna Abate, 1Marisa Gorrese, 1Maddalena Raia, 1Caterina Pascariello, 1Angela Gravetti, 2Andrea Camera, 1Giulia Scalia e 1Luigi Del Vecchio

1CEINGE-Biotecnologie Avanzate e DBBM, Universit Federico II, Napoli2Divisione di Ematologia, Universit Federico II, Napoli

e-mail: lorebrun@gmail.com

Per stabilire il cut-off tra cellule CD200positive e cellule CD200 negative abbiamoutilizzato la tecnica detta FluorescenceMinus One, descritta da Perfetto et al. [9].

RISULTATITutti i campioni di HCL sono risultati posi-tivi per CD200 (figura 3), con valoremediano di PPC e MFI pari rispettivamen-te a 99 (25-75 percentile 92-99) e 3016(25-75 percentile 1382-5430).Nonostante il 100% dei controlli eraCD200 positivo, la PPC e la MFI eranosignificativamente inferiori (p

efficaci nella HCL: lIFN-, la pentostatina, la cladribina(2-clorodesossi-adenosina) e il rituximab. Questi farma-ci hanno drasticamente migliorato la sopravvivenza e laqualit di vita dei pazienti con HCL. Purtroppo, per,questa patologia considerata incurabile e non mancanocasi primariamente refrattari alla terapia come ancherecidive a breve distanza dalla prima linea [13]. Un anticorpo monocolonale umanizzato in grado di ini-bire linterazione CD200-CD200R gi disponibile(Anti-CD200 MAb, Alexion Pharmaceuticals, Cheshire,CT, USA). Relativamente allefficacia di questo anticor-po, Kretz-Rommel ha ottenuto risultati incoraggianti intopi NOD/SCID. Linee cellulari di linfoma di BurkittCD200+ insieme a cellule mononucleate umane sonostate co-iniettate nel topo assistendo inesorabilmenteallattecchimento della neoplasia. Quando lo stesso espe-rimento stato ripetuto iniettando anche lanticorpo anti-CD200, lattecchimento del linfoma stato completa-mente inibito [14]Vista la costante positivit di CD200 nella HCL e lagrande quantit di antigene presente sulla superficiedelle cellule capellute nei campioni studiati, Anti-CD200MAb, ristabilendo una normale secrezione citochinica epromuovendo la risposta immunitaria antitumorale,potrebbe essere una nuova interessante molecola da uti-lizzare nel contesto di uno schema di immunoterapia perla leucemia a cellule capellute.Tabella

Paziente PPC MFI1 92 47612 93 13593 99 13904 99 78905 92 31076 99 29247 99 74388 99 14919 85 133410 99 3617

Totale (Mediana) 99 3016

Tabella riassuntiva dei valori di percentuale di cellule positive (PPC) edi fluorescenza mediana di intensit (MFI) nei 10 campioni di HCLstudiati.

REFERENZE1. Kawasaki, B.T. and W.L. Farrar, Cancer stem cells, CD200

and immunoevasion. Trends Immunol, 2008. 29(10): p.464-8.

2. Wright, G.J., et al., Characterization of the CD200 receptorfamily in mice and humans and their interactions withCD200. J Immunol, 2003. 171(6): p. 3034-46.

3. Gorczynski, R.M., Transplant tolerance modifying antibodyto CD200 receptor, but not CD200, alters cytokine produc-tion profile from stimulated macrophages. Eur J Immunol,2001. 31(8): p. 2331-7.

4. Gorczynski, R., et al., An interaction between CD200 andmonoclonal antibody agonists to CD200R2 in developmentof dendritic cells that preferentially induce populations ofCD4+CD25+ T regulatory cells. J Immunol, 2008. 180(9):p. 5946-55.

5. Tonks, A., et al., CD200 as a prognostic factor in acute mye-loid leukaemia. Leukemia, 2007. 21(3): p. 566-8.

6. Moreaux, J., et al., CD200 is a new prognostic factor inmultiple myeloma. Blood, 2006. 108(13): p. 4194-7.

7. McWhirter, J.R., et al., Antibodies selected from combinato-rial libraries block a tumor antigen that plays a key role inimmunomodulation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006.103(4): p. 1041-6.

8. Tiacci, E., et al., Evolving concepts in the pathogenesis ofhairy-cell leukaemia. Nat Rev Cancer, 2006. 6(6): p. 437-48.

9. Perfetto, S.P., P.K. Chattopadhyay, and M. Roederer,Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immunesystem. Nat Rev Immunol, 2004. 4(8): p. 648-55.

10. Chen, Y.H., et al., Immunophenotypic variations in hairycell leukemia. Am J Clin Pathol, 2006. 125(2): p. 251-9.

11. Barut, B.A., et al., Response patterns of hairy cell leuke-mia to B-cell mitogens and growth factors. Blood, 1990.76(10): p. 2091-7.

12. Wang, H.Y. and R.F. Wang, Regulatory T cells and cancer.Curr Opin Immunol, 2007. 19(2): p. 217-23.

13. Golomb, H.M., Hairy cell leukemia: treatment successesin the past 25 years. J Clin Oncol, 2008. 26(16): p. 2607-9.

14. Kretz-Rommel, A., et al., CD200 expression on tumor cellssuppresses antitumor immunity: new approaches to cancerimmunotherapy. J Immunol, 2007. 178(9): p. 5595-605.

11ATTIVIT SCIENTIFICALettere GIC Vol. 17, Num. 3 - Dicembre 2008