INTRODUZIONECD200 (precedentemente chiamato OX-2) è una glico-proteina di membrana con funzione immunosoppresso-ria. La sua porzione extramembrana possiede due domi-ni della superfamiglia delle immunoglobuline in grado dimediare interazioni cellula-cellula. CD200 è espresso sulinfociti B, linfociti T, cellule dendritiche e vari tessutisolidi [1]. Contrariamente all’ampio pattern di espressio-ne di CD200, l’espressione del suo recettore (CD200R) èristretta esclusivamente ai leucociti. Esso è stato, infatti,individuato solamente su macrofagi, cellule dendritiche,mast-cells, linfociti B e linfociti T [2]. In modelli sperimentali, l’interazione tra CD200 eCD200R causa (a) una riduzione della sintesi delle cito-chine Th1-like, come l’interleuchina (IL)-2 e l’interefe-rone (IFN)-γ, (b) un aumento della produzione di citochi-ne Th2-like come l’IL-4 e l’IL-10 [3] e (c) un aumento,in vitro, del differenziamento dei linfociti T verso il com-partimento Treg CD4+CD25+Foxp3+ [4]. In base a questielementi, risulta chiaro come CD200 determini una ridu-zione della risposta citotossica mediata da cellule T. Unaneoplasia esprimente CD200 potrebbe sfruttare l’intera-zione CD200-CD200R per evadere la risposta citotossi-ca antitumorale dell’ospite. La positività per questamolecola è, infatti, considerata un fattore prognosticosfavorevole nella leucemia mieloide acuta (LAM) [5] enel mieloma multiplo (MM) [6], e la sua espressione èstata descritta anche su alcune cancer stem cells [1]. McWhirter, dopo aver dimostrato che CD200 è costante-mente overespresso nella leucemia linfatica cronica, hagenerato un anticorpo monoclonale umanizzato (Anti-CD200 MAb) in grado di inibire l’interazione tra CD200e il suo recettore [7]. Partendo da questi dati abbiamo deciso di estendere lostudio dell’espressione di CD200 ad un’altra malattialinfoproliferativa a cellule B: la leucemia a cellule capel-lute (HCL). La HCL è una patologia linfoproliferativa cronica a cel-lule B che tipicamente si manifesta con pancitopenia,splenomegalia e infezioni ricorrenti. E’ un’entità nosolo-

gica distinta nella classificazione della World HealthOrganization (WHO), poiché mostra specifiche caratteri-stiche clinico-patologiche e biologiche [8]. Dato che lecellule capellute possiedono un immunofenotipo caratte-ristico, la citometria a flusso è, ad oggi, la migliore meto-dologia di laboratorio per la diagnosi di HCL.

MATERIALI E METODIDurante il 2008 abbiamo studiato un totale di dieci casidi HCL di nuova diagnosi. Sette casi sono stati diagno-sticati come HCL classica, uno è stato definito HCLvariante e due sono stai classificati come HCL classicacon espressione aberrante di CD10. Sono stati analizzatisei campioni di sangue venoso periferico (PB) e quattroaspirati midollari (BM). Come controllo abbiamo studia-to dieci campioni di PB e due BM prelevati da donatorisani.L’analisi è stata condotta utilizzando il citometro FACSCanto II (Becton Dickinson, BD, San Jose, CA, USA).In breve, 50 µL di campione sono stati incubati per 30minuti con una quantità appropriata di anticorpo. Inseguito il campione è stato lisato con una soluzione dicloruro di ammonio per 10 minuti, poi lavato e risospesoin 300 µL di PBS e successivamente acquisito per l’ana-lisi citometrica. Complessivamente, abbiamo studiato i seguenti antigeni:CD200, SmIg-kappa, SmIg-lambda, CD45, CD19, CD5,CD23, CD20, CD22, CD103, CD11c, CD25, CD43,CD10, CD3, CD56 e CD81. Le cellule capellute sonostate selezionate applicando un gate sugli eventiCD45+CD19+ con aspetto “monocitoide” (ossia concaratteristiche di light scatter tipiche dei monociti). In seicasi su dieci abbiamo allestito un’analisi multiparametri-ca in grado di selezionare le cellule patologiche comeCD45+CD103+CD11c+CD19+ (figura 1a e 1b). I linfoci-ti B dei controlli sani sono stati studiati applicando ungate sulle cellule CD45+CD19+ (figura 2a). Su questepopolazioni sono state calcolate le percentuali di cellulepositive (PPC) per CD200 e l’intensità mediana di fluo-rescenza (MFI) dello stesso antigene.

9ATTIVITÀ SCIENTIFICALettere GIC Vol. 17, Num. 3 - Dicembre 2008

Espressione di CD200/OX-2nella leucemia a cellule capellute:

implicazioni per l’analisi cellulare clinica e perl’immunoterapia con anticorpi monoclonali

1Lorenzo Brunetti, 1Rosa Di Noto, 1Giovanna Abate, 1Marisa Gorrese, 1Maddalena Raia, 1Caterina Pascariello, 1Angela Gravetti, 2Andrea Camera, 1Giulia Scalia e 1Luigi Del Vecchio

1CEINGE-Biotecnologie Avanzate e DBBM, “Università Federico II”, Napoli2Divisione di Ematologia, Università “Federico II”, Napoli

e-mail: lorebrun@gmail.com

Per stabilire il cut-off tra cellule CD200positive e cellule CD200 negative abbiamoutilizzato la tecnica detta “FluorescenceMinus One”, descritta da Perfetto et al. [9].

RISULTATITutti i campioni di HCL sono risultati posi-tivi per CD200 (figura 3), con valoremediano di PPC e MFI pari rispettivamen-te a 99 (25°-75° percentile 92-99) e 3016(25°-75° percentile 1382-5430).Nonostante il 100% dei controlli eraCD200 positivo, la PPC e la MFI eranosignificativamente inferiori (p<0.001)rispetto ai casi di HCL, in particolare laPPC era pari a 71 (25°-75° percentile 64-83) mentre la MFI era pari a 582 (25°-75°percentile 406-725) (figura 3 e tabella).Anche le distribuzioni dei picchi di fluore-scenza è risultata diversa. Infatti, mentrenei casi di HCL è stata osservata una fluo-rescenza forte e omogenea, nei controlli èstata registrata una distribuzione costante-mente bimodale (figure 1c e 2b).

DISCUSSIONELa positività di CD103, CD11c e CD25 inuna popolazione B CD19+ permette di dia-gnosticare agevolmente la HCL nella mag-gioranza dei casi. Non mancano, però, casiin cui il fenotipo delle cellule patologichenon corrisponda a quello classico. In lette-ratura sono ripetutamente descritti casi conridotta o assente espressione di CD103,casi con CD25 negativo come anche casicon positività di CD10 [10]. Dato che nellanostra serie tutti i casi, varianti incluse,erano francamente positivi per CD200,questo antigene si propone come potenziale nuovo marker ingrado di supportare una diagnosi di HCL. Uno studio su unnumero di campioni più ampio è però richiesto per confer-mare questa ipotesi.Agli inizi degli anni ’90 è stata descritta l’importanza dellecitochine Th2-like nella promozione della sintesi del DNAnelle cellule capellute [11]. In più, è stata documentata, siain vitro che in vivo, una riduzione della risposta antitumora-le in presenza di un incremento della produzione di IL-4 eIL-10 [7]. Come detto precedentemente, sembra che CD200sia in grado di promuovere un incremento della quota Treg,cellule in grado di inibire la risposta immunitaria antitumo-rale [12], e di giocare un ruolo nella prognosi delle LAM edel MM. Questi dati, nel loro insieme, depongono a favoredell’importanza di CD200 nella sopravvivenza delle cellulecapellute e nell’evasione della risposta citotossica antitumo-rale da parte delle stesse.Quattro linee di terapia vengono attualmente considerate

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Fig. 1: (a, b) Presenza nel campione di una popolazione di cellulecapellute (in azzurro) con fenotipo classico (CD19+CD103+CD11c+

CD5-). (c) Espressione di CD200 nella popolazione patologica. Si notil’omogeneità della fluorescenza.

Fig. 2: Espressione di CD200 su linfociti B (CD45+CD19+) in un con-trollo normale. In tutti i controlli è stata riscontrata una bimodalità nelladistribuzione della fluorescenza.

Fig. 3: Confronto tra l’espressione di CD200 nei campioni di HCL enei controlli (CTR). MFI=Intensità mediana di fluorescenza.

efficaci nella HCL: l’IFN-γ, la pentostatina, la cladribina(2-clorodesossi-adenosina) e il rituximab. Questi farma-ci hanno drasticamente migliorato la sopravvivenza e laqualità di vita dei pazienti con HCL. Purtroppo, però,questa patologia è considerata incurabile e non mancanocasi primariamente refrattari alla terapia come ancherecidive a breve distanza dalla prima linea [13]. Un anticorpo monocolonale umanizzato in grado di ini-bire l’interazione CD200-CD200R è già disponibile(Anti-CD200 MAb, Alexion Pharmaceuticals, Cheshire,CT, USA). Relativamente all’efficacia di questo anticor-po, Kretz-Rommel ha ottenuto risultati incoraggianti intopi NOD/SCID. Linee cellulari di linfoma di BurkittCD200+ insieme a cellule mononucleate umane sonostate co-iniettate nel topo assistendo inesorabilmenteall’attecchimento della neoplasia. Quando lo stesso espe-rimento è stato ripetuto iniettando anche l’anticorpo anti-CD200, l’attecchimento del linfoma è stato completa-mente inibito [14]Vista la costante positività di CD200 nella HCL e lagrande quantità di antigene presente sulla superficiedelle cellule capellute nei campioni studiati, Anti-CD200MAb, ristabilendo una normale secrezione citochinica epromuovendo la risposta immunitaria antitumorale,potrebbe essere una nuova interessante molecola da uti-lizzare nel contesto di uno schema di immunoterapia perla leucemia a cellule capellute.Tabella

Paziente PPC MFI1 92 47612 93 13593 99 13904 99 78905 92 31076 99 29247 99 74388 99 14919 85 133410 99 3617

Totale (Mediana) 99 3016

Tabella riassuntiva dei valori di percentuale di cellule positive (PPC) edi fluorescenza mediana di intensità (MFI) nei 10 campioni di HCLstudiati.

REFERENZE1. Kawasaki, B.T. and W.L. Farrar, Cancer stem cells, CD200

and immunoevasion. Trends Immunol, 2008. 29(10): p.464-8.

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3. Gorczynski, R.M., Transplant tolerance modifying antibodyto CD200 receptor, but not CD200, alters cytokine produc-tion profile from stimulated macrophages. Eur J Immunol,2001. 31(8): p. 2331-7.

4. Gorczynski, R., et al., An interaction between CD200 andmonoclonal antibody agonists to CD200R2 in developmentof dendritic cells that preferentially induce populations ofCD4+CD25+ T regulatory cells. J Immunol, 2008. 180(9):p. 5946-55.

5. Tonks, A., et al., CD200 as a prognostic factor in acute mye-loid leukaemia. Leukemia, 2007. 21(3): p. 566-8.

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7. McWhirter, J.R., et al., Antibodies selected from combinato-rial libraries block a tumor antigen that plays a key role inimmunomodulation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006.103(4): p. 1041-6.

8. Tiacci, E., et al., Evolving concepts in the pathogenesis ofhairy-cell leukaemia. Nat Rev Cancer, 2006. 6(6): p. 437-48.

9. Perfetto, S.P., P.K. Chattopadhyay, and M. Roederer,Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immunesystem. Nat Rev Immunol, 2004. 4(8): p. 648-55.

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