ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su...

$: ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo.$
ESAME ISTOLOGICO :

• esame estemporaneo mediante uso del criostato

• biopsie mirate su tessuti e\o su organi

• prelievi autoptici

ESAME ISTOLOGICO :

• esame estemporaneo mediante uso del criostato

• biopsie mirate su tessuti e\o su organi

• prelievi autoptici

ESAME CITOLOGICO :

• esame su versamento interstiziale

• esame su urine

• esame su striscio vaginale

• agoaspirato

ESAME CITOLOGICO :

• esame su versamento interstiziale

• esame su urine

• esame su striscio vaginale

• agoaspirato

ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA

ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA

• 1 FASE PROPEDEUTICA

• 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

• 3 FASE PRE-ANALITICA

• 4 FASE ANALITICA

• 5 FASE POST-ANALITICA

• 6 FASE INTERPRETATIVA

• 7 REFERTAZIONE

• 1 FASE PROPEDEUTICA

• 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

• 3 FASE PRE-ANALITICA

• 4 FASE ANALITICA

• 5 FASE POST-ANALITICA

• 6 FASE INTERPRETATIVA

• 7 REFERTAZIONE

ISTOLOGIA :

• richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno

• allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame

• contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza)

• esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo

ISTOLOGIA :



• contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza)

• esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo

CITOLOGIA :



• contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo

• (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)

CITOLOGIA :



• contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo

• (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)

1 FASE PROPEDEUTICA1 FASE PROPEDEUTICA

ISTOLOGIA :

• ricezione biopsie e reperti

• classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo

• compilazione apposito modulo di profilo mirato

• riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia

• procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.)

• (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)

ISTOLOGIA :

• ricezione biopsie e reperti

• classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo

• compilazione apposito modulo di profilo mirato

• riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia

• procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.)

• (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)

2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

ISTOLOGIA :

• inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati

• preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni

• raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi

• (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)

ISTOLOGIA :

• inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati

• preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni

• raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi

• (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)

3 FASE PRE - ANALITICA3 FASE PRE - ANALITICA

ISTOLOGIA :

• colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino

• colorazione di routine E.-E.

• colorazioni speciali

• reazioni specifiche di immuno-isto-chimica

• montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo

• (colorazione esame criostato)

• Controllo di qualità :

• uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo

• controlli inter-laboratorio

ISTOLOGIA :

• colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino

• colorazione di routine E.-E.

• colorazioni speciali

• reazioni specifiche di immuno-isto-chimica

• montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo

• (colorazione esame criostato)


• uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo

• controlli inter-laboratorio

4 FASE ANALITICA4 FASE ANALITICA

ISTOLOGIA :

• apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate

• archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina

• consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista

• archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche

ISTOLOGIA :

• apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate

• archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina

• consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista

• archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche

5 FASE POST - ANALITICA5 FASE POST - ANALITICA

ISTOLOGIA :

• osservazione dei vetrini al microscopio ottico

• interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista

• refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa


• lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore

• lettura alla cieca inter-laboratorio

ISTOLOGIA :

• osservazione dei vetrini al microscopio ottico

• interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista

• refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa


• lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore

• lettura alla cieca inter-laboratorio

6 FASE INTERPRETATIVA6 FASE INTERPRETATIVA

7 REFERTAZIONE7 REFERTAZIONE

• refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa

• archiviazione documentazione cartacea

• inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia)

• archiviazione documentazione informatica

• consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente

• refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa

• archiviazione documentazione cartacea

• inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia)

• archiviazione documentazione informatica

• consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente

DOPO IL PRELIEVODOPO IL PRELIEVO

• -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come.

• -Tessuti sotto vuoto

• Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.

• -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come.

• -Tessuti sotto vuoto

• Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.

• La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile.

Requisiti fondamentali del fissativo ideale :

• sicura preservazione della morfologia di base

• integrità della struttura antigenica

• impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche

• opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.

• La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile.

Requisiti fondamentali del fissativo ideale :

• sicura preservazione della morfologia di base

• integrità della struttura antigenica

• impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche

• opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.

FISSAZIONE DEI TESSUTIFISSAZIONE DEI TESSUTI

FissazioneFissazione

Definizione

Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla

stabilizzazione di componenti tessutali con minima

dislocazione ed estrazione dei composti nativi

La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il

più possibile simile alla condizione vitale

Definizione

Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla

stabilizzazione di componenti tessutali con minima

dislocazione ed estrazione dei composti nativi

La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il

più possibile simile alla condizione vitale

FissazioneFissazioneUna fissazione ideale prevede:• Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da

trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina

• Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo

( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )

• Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto

• Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native

• Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi )• Assenza di “sovra-fissazione”

Una fissazione ideale prevede:• Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da

trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina

• Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo

( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )

• Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto

• Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native

• Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi )• Assenza di “sovra-fissazione”

Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti

• Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo.

• Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende:- dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione

• In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.

• Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo.

• Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende:- dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione

• In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.

FissazioneFissazione Classificazione

I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:

1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con

nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine

che reagiscono una con l’altra formando aggregati

MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria

3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura

secondaria e terziaria (calore)

repulsione elettrostatica tra parti diverse di una

stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)

rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link

ClassificazioneI fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:

1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con

nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine

che reagiscono una con l’altra formando aggregati

MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria

3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura

secondaria e terziaria (calore)

repulsione elettrostatica tra parti diverse di una

stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)

rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link

FissazioneFissazione

2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati

tra

polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine

vicine

STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile

Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE

Utile anche in ME, Istochimica

2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati

tra

polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine

vicine

STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile

Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE

Utile anche in ME, Istochimica

Tecniche di fissazione :

• per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1

• per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri

• per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

Tecniche di fissazione :

• per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1

• per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri

• per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

FISSAZIONE DEI TESSUTIFISSAZIONE DEI TESSUTI

Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti La Formalina:

E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking)

• Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%)

• Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare

• Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.

La Formalina:

E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking)

• Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%)

• Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare

• Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.

Modi di Applicazione ( 1 )Modi di Applicazione ( 1 ) Immersione

Il campione deve essere immerso in almeno

20 volte volume di fissativo

Ottima fissazione se:

• dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)

• minimo intervallo tra asportazione e immersione

(< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo,

non sono più ossigenate e muoiono in un tempo

variabile)

Immersione

Il campione deve essere immerso in almeno

20 volte volume di fissativo

Ottima fissazione se:

• dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)

• minimo intervallo tra asportazione e immersione

(< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo,

non sono più ossigenate e muoiono in un tempo

variabile)

Modi di ApplicazioneModi di Applicazione Immersione

Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )

e le dimensioni.

Importanti le indicazioni sul recipiente

(non sul coperchio)

Nome, data, Numero; provenienza

Immersione

Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )

e le dimensioni.

Importanti le indicazioni sul recipiente

(non sul coperchio)

Nome, data, Numero; provenienza

Modi di Applicazione ( 2 )Modi di Applicazione ( 2 )Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida

(aldeidi)

Distanza tra vasi e cellule: max. 100 micronsDiffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della

adeguata concentrazione nel tessuto.

Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta

dipende da:• Concentrazione• Temperatura• Natura dl fissativo• Topografia del tessuto in rapporto al fissativo• Tipo di tessuto• Cross Link o coagulazione

Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi)

Distanza tra vasi e cellule: max. 100 micronsDiffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della

adeguata concentrazione nel tessuto.

Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta

dipende da:• Concentrazione• Temperatura• Natura dl fissativo• Topografia del tessuto in rapporto al fissativo• Tipo di tessuto• Cross Link o coagulazione

Modi di Applicazione ( 3 )Modi di Applicazione ( 3 )

Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad

elevata temperatura ( 80°c )

Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)

Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad

elevata temperatura ( 80°c )

Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)


Fissativi alcolici• Alcool etilico 95°• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti• Alcool metilico• Alcool metilico ed acetone anaparti

L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.

Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.

Fissativi alcolici• Alcool etilico 95°• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti• Alcool metilico• Alcool metilico ed acetone anaparti

L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.

Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.


Miscele fissatrici a base di alcool:• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool

etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale

• Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale

• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale

• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%

Miscele fissatrici a base di alcool:• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool

etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale

• Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale

• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale

• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%

Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti Miscele fissatrici a base di acido picrico:

•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale

•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico

Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

Miscele fissatrici a base di acido picrico:

•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale

•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico

Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi

Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi

Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per

inalazione e contatto.

Uso di cappe aspiranti.

Alcool : Rischio incendi

Glutaraldeide

Ac. Picrico

Sali di Mercurio

Tetrossido di Osmio

Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.

Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per

inalazione e contatto.

Uso di cappe aspiranti.

Alcool : Rischio incendi

Glutaraldeide

Ac. Picrico

Sali di Mercurio

Tetrossido di Osmio

Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.

Tempi d’uso per i fissativiTempi d’uso per i fissativi

Formaldeide 4% (= Formalina 10% )

Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24

Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da

3h a 24h

Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi

Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti

piccoli ( diam 1-2 mm)

Formaldeide 4% (= Formalina 10% )

Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24

Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da

3h a 24h

Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi

Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti

piccoli ( diam 1-2 mm)

Tecnica di inclusione in paraffina :

• Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi.

• La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti.

• In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.

Tecnica di inclusione in paraffina :

• Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi.

• La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti.

• In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.

INCLUSIONE DEI TESSUTIINCLUSIONE DEI TESSUTI

DisidratazioneDisidratazioneETANOLO

METANOLO

ACETONE

PROPANEDIOLO

ETANOLO

METANOLO

ACETONE

PROPANEDIOLO

ChiarificazioneChiarificazione

XILOLO

BENZOLO

CLOROFORMIO

XILOLO

BENZOLO

CLOROFORMIO

InclusioneInclusioneParaffina

Gelatina / Agar

Celloidina

Resine

Paraffina

Gelatina / Agar

Celloidina

Resine

• Idrosolubili (Metacrilati)• Idrosolubili (Metacrilati)

• Epossidiche• Epossidiche

Congelamento dei tessutiCongelamento dei tessuti

• Effetti del congelamento

• Metodi di congelamento

• Effetti del congelamento

• Metodi di congelamento

• Blocchi di metallo

• Produzione di “Neve CO2”

• Ghiaccio secco

• Appar. Termo-elettrici

• Gas liquidi (N2)

• Blocchi di metallo

• Produzione di “Neve CO2”

• Ghiaccio secco

• Appar. Termo-elettrici

• Gas liquidi (N2)

Sostanze “Protettive”• Glicerolo / DMSOSostanze “Protettive”• Glicerolo / DMSO

METODO IDEALE

FREON

ISOPENTANO

METODO IDEALE

FREON

ISOPENTANOConservazione di tessuti e cellule

Conservazione di tessuti e cellule

METODI RAPIDIMETODI RAPIDI Metodo T (°C) Efficienza Metodo T (°C) Efficienza

Tessuti in liquidi refrigerati

Tessuti in liquidi refrigerati

Tessuti in contatto dimetalli refrigerati

Tessuti in contatto dimetalli refrigerati

Fluido organicoIn gas liquido (N2)

Fluido organicoIn gas liquido (N2)

Fluido organicoIn ghiaccio secco Liquido organico

Fluido organicoIn ghiaccio secco Liquido organico

RaffreddamentoTermo-elettricoRaffreddamentoTermo-elettrico

Supporto metallicoRaffreddato per conduzione

Supporto metallicoRaffreddato per conduzione

aa

aa

bb

- 196- 196

- 79- 79

- 30- 30

- 40- 40

Il più veloceIl più veloce

Ottimale per lamaggior parte delleapplicazioni in M.O

Ottimale per lamaggior parte delleapplicazioni in M.O

scarsascarsa

scarsascarsa

a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano

b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone

a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano

b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone

SezionamentoSezionamento

• Microtomo

• Criostato

• Ultra-microtomia M.E.

• Microtomo

• Criostato

• Ultra-microtomia M.E.

• Temp. ideali per i vari tipi di tessuto

• Lama

• Tratt. delle sezioni1) Essicamento (+

fissazione) 2) Freeze drying o altri

metodi

• Temp. ideali per i vari tipi di tessuto

• Lama

• Tratt. delle sezioni1) Essicamento (+

fissazione) 2) Freeze drying o altri

metodi

Rischio

ambientale

Rischio

ambientale

Freeze – Drying (Liofilizzazione)

Freeze – Drying (Liofilizzazione)

• Principi

• Applicazione ai tessuti

• Trattamento successivo

• Principi

• Applicazione ai tessuti

• Trattamento successivo

Freeze – SobstitutionFreeze – Sobstitution

• Condiz. di congelamento

• Condiz. di liofilizzazione

Temp. Tempo

Trappola di N2O

• Condiz. di congelamento

• Condiz. di liofilizzazione

Temp. Tempo

Trappola di N2O

Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina

Fissazione in vapori Fissazione in vapori

Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate :

E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°.

Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate :

E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°.

SPARAFFINATURA DELLE SEZIONISPARAFFINATURA DELLE SEZIONI

• xilolo 5 ’

• xilolo 5 ’

• xilolo 5 ’

• etanolo 100° 5 ’

• etanolo 100° 5 ’

• etanolo 100° 5 ’

• etanolo 95° 5 ’



• H2O distillata ––›

• ––› colorazione

• xilolo 5 ’

• xilolo 5 ’

• xilolo 5 ’

• etanolo 100° 5 ’

• etanolo 100° 5 ’

• etanolo 100° 5 ’




• H2O distillata ––›

• ––› colorazione

Colorazione dei tessutiColorazione dei tessuti• Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3)

• Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi

• Tipo di legame

• Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3)

• Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi

• Tipo di legametra colorante e tessutotra colorante e tessuto

• Ionico (Salino – elettrostatico)

• Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi)

• Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina

• Intermolecolari (van der Waal)

• Ionico (Salino – elettrostatico)

• Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi)

• Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina

• Intermolecolari (van der Waal)

Colorazione dei tessutiColorazione dei tessuti

• Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)

• Componenti tissutali

• Coloranti

• Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)

• Componenti tissutali

• Coloranti

• Basofile

• Acidofile

• Neutrofile

• Basofile

• Acidofile

• Neutrofile

• Cationici (basici)

• Anionici (acidi)

• Cationici (basici)

• Anionici (acidi)

COLORANTICOLORANTI : DEFINIZIONE : DEFINIZIONECROMOGENO ( CROMOGENO ( Luce visibileLuce visibile 400- 400-800 800

mm)mm)

Criteri di purezzaCriteri di purezza SpettroSpettro

Gruppi cromoforiGruppi cromofori-N -N -N -N azoazo c=cc=c alkenealkene N = O N = O nitrosonitroso c=oc=o oxooxo N - O2N - O2 nitronitro (gruppi auxocromi)(gruppi auxocromi)

es: -SHes: -SH

NOMENCLATURANOMENCLATURAcoloranticoloranti

COLORANTICOLORANTI : DEFINIZIONE : DEFINIZIONECROMOGENO ( CROMOGENO ( Luce visibileLuce visibile 400- 400-800 800

mm)mm)

Criteri di purezzaCriteri di purezza SpettroSpettro

Gruppi cromoforiGruppi cromofori-N -N -N -N azoazo c=cc=c alkenealkene N = O N = O nitrosonitroso c=oc=o oxooxo N - O2N - O2 nitronitro (gruppi auxocromi)(gruppi auxocromi)

es: -SHes: -SH

NOMENCLATURANOMENCLATURAcoloranticoloranti

NITRONITROAZOAZOCHINONICICHINONICI

NITRONITROAZOAZOCHINONICICHINONICI

Pratica di colorazione dei tessutiPratica di colorazione dei tessuti

Reattivi Reattivi PurezzaPurezza

AcquaAcqua

Etichetta sui reattiviEtichetta sui reattivi

ConservazioneConservazione

Scarto /Scarto / ScaricamentoScaricamento

Reattivi Reattivi PurezzaPurezza

AcquaAcqua

Etichetta sui reattiviEtichetta sui reattivi

ConservazioneConservazione

Scarto /Scarto / ScaricamentoScaricamento

Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade

Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade

Coloranti(Assorbimento colore osservato)

Coloranti(Assorbimento colore osservato)

Coloranti cationici Nuclei / Batteri

pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di

fosfato DNA / RNA (selettivo)

es. col. GRAM

Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali

Coloranti cationici Nuclei / Batteri

pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di

fosfato DNA / RNA (selettivo)

es. col. GRAM

Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali

+ Cresyl-violetto + I2

- col. Rosso = Fucsina

+ Cresyl-violetto + I2

- col. Rosso = Fucsina

ZIEL-NIELSENZIEL-NIELSEN

· EMATEINAEMATEINA ossidazione di ematossilinaossidazione di ematossilina

Compl. con ALCompl. con AL EMALLUME EMALLUME (Mayer - (Mayer -

Carazzi)Carazzi)

FeFe EMAT. HARRIS - Lillie EMAT. HARRIS - Lillie

· EMATEINAEMATEINA ossidazione di ematossilinaossidazione di ematossilina

Compl. con ALCompl. con AL EMALLUME EMALLUME (Mayer - (Mayer -

Carazzi)Carazzi)

FeFe EMAT. HARRIS - Lillie EMAT. HARRIS - Lillie

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)

progressiveprogressive - Differenziazione- DifferenziazioneEmatossilineEmatossiline

regressiveregressive - pH- pH

progressiveprogressive - Differenziazione- DifferenziazioneEmatossilineEmatossiline

regressiveregressive - pH- pH

Colorazione dei tessutiColorazione dei tessuti Reazione di Blocco Reazione di Blocco

• Ossidazione - Ossidanti

• Riduzione

• Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi)

• Saponificazione (idrolisi di derivati acidi

• Deaminazione

• Ossidazione - Ossidanti

• Riduzione

• Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi)

• Saponificazione (idrolisi di derivati acidi

• Deaminazione

Deboli

Medi

Forti

Deboli

Medi

Forti

H2O2 / I2

Ac. Perform.

Permanganato

H2O2 / I2

Ac. Perform.

Permanganato

• sezioni in H2O distillata

• Emallume acido di Mayer,

filtrato, 7’

• lavare H2O di fonte 10’

• soluzione satura Li2CO3 15”



• Emallume acido di Mayer,

filtrato, 7’




• Eosina [0.25 %], acidificata con

qualche goccia di CH3COOH

1’

• lavare in H2O distillata 2’

• disidratare in etanolo 95° 4’

• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)

• chiarificare in xilolo (3 cambi)

• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)



1’






COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina

COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rossoRisultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso

Colorazione con coloranti basiciColorazione con coloranti basici

La colorabilità dipende da vari fattori:La colorabilità dipende da vari fattori:

• pH

• disidratazione

• fissazione

• temperatura

• pH

• disidratazione

• fissazione

• temperatura

Colorazione con coloranti basiciColorazione con coloranti basici

Dipende da:Dipende da:

• pH della soluzione

• Tipo di colorante

• Tempo e temperatura

• Tampone

• Trattamento dopo la colorazione

• pH della soluzione

• Tipo di colorante

• Tempo e temperatura

• Tampone

• Trattamento dopo la colorazione

Meccanismo:Meccanismo:

• Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi

• Legame ionico + f. van der Waal

es. Blu di Toluidina

• Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi

• Legame ionico + f. van der Waal

es. Blu di Toluidina

MetacromasiaMetacromasia Visibile

U.V.

Visibile

U.V.

Alcool

resist.

Alcool

resist.

+

-

+

-

PASPAS

H C OH

H C OH

H C OH

H C OH

H C

H C

H C

H C

OO


• soluzione Alcian blu 8 GX

[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’

• lavare in H2O distillata 5 ’

• contrasto nucleare con NFR

(rosso nucleare neutro [1 %]

in solfato di alluminio [5 %]

a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’



[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’


• contrasto nucleare con NFR

(rosso nucleare neutro [1 %]

in solfato di alluminio [5 %]

a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’


• disidratare in etanolo 95°

4’


4’ (3 cambi)


• montare in mezzo d’inclusione

(Entellan o balsamo Canada)



4’


4’ (3 cambi)




COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN BLU pH 2.5”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN BLU pH 2.5”

Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue

Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue


• alcune sezioni possono essere pre-trattate con -amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 ’

• HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’


• reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’

• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’

• lavare in H2O di fonte 15’


• alcune sezioni possono essere pre-trattate con -amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 ’






• contrasto nucleare con

emallume 5 ’

• lavare in H2O di fonte 15 ’


4’


4’ (3 cambi)





emallume 5 ’



4’


4’ (3 cambi)




COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PAS (acido periodico di Schiff) e PAS

Diastasi”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PAS (acido periodico di Schiff) e PAS

Diastasi”

Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico-proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora

Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico-proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora



[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’








[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’








ematossilina Carazzi 5 ’



4’


4’ (3 cambi)






ematossilina Carazzi 5 ’



4’


4’ (3 cambi)




COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN - PAS (VIALLI)”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN - PAS (VIALLI)”

Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo

Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo


• immergere in alcool isopropilico 60 % 5’

• soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20’

• differenziare in alcool isopropilico 60° 20”


• eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5’


• montare in glicerina e lutare


• immergere in alcool isopropilico 60 % 5’

• soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20’

• differenziare in alcool isopropilico 60° 20”


• eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5’



COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”

Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuroRisultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro


• immergere in alcool etilico 55 ° 5’

• soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40’

• differenziare in alcool etilico 55° 20”





• soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40’




COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”

Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi

Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi



• soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10’



• Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’





• soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10’






COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”

Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuroRisultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuro


• immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 °] 24 h

• lavare l’ eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2’

• lavare H2O distillata 10’

• colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10’



• immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 °] 24 h

• lavare l’ eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2’


• colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10’


• soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20’


• soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10’


• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)



• soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20’


• soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10’





COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”

Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro

Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro

• sezioni in H2O distillata• ossidare in permanganato di

K ( KMnO4 ) 5’• lavare in H2O di fonte 5’• soluzione di acido ossalico

(C2H2O4) 1’• lavare in H2O di fonte 5’• mordenzare in Allume ferrico

[2 %] 5’• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• soluzione di Argento nitrato

(AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8’

• lavare in H2O distillata• sviluppare in soluzione di

formalina [10 %] 3’

• sezioni in H2O distillata• ossidare in permanganato di

K ( KMnO4 ) 5’• lavare in H2O di fonte 5’• soluzione di acido ossalico

(C2H2O4) 1’• lavare in H2O di fonte 5’• mordenzare in Allume ferrico

[2 %] 5’• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• soluzione di Argento nitrato

(AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8’

• lavare in H2O distillata• sviluppare in soluzione di

formalina [10 %] 3’

• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• differenziare in Cloruro oro

(HAuCl4) [1 %] 8 - 10’• lavare in sodio tiosolfato

(Na2SO2O3) [5 %] 5’• lavare H2O di fonte 5’• contrasto nucleare con NFR

(rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

• lavare H2O di fonte 5’• disidratare in etanolo 95°

4’• disidratare in etanolo 100°

4’ (3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in mezzo d’inclusione


• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• differenziare in Cloruro oro

(HAuCl4) [1 %] 8 - 10’• lavare in sodio tiosolfato

(Na2SO2O3) [5 %] 5’• lavare H2O di fonte 5’• contrasto nucleare con NFR

(rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

• lavare H2O di fonte 5’• disidratare in etanolo 95°

4’• disidratare in etanolo 100°

4’ (3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in mezzo d’inclusione


COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”

Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)


• ossidare con soluzione di KMnO4 (permanganato di K) 5’


• soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1’


• soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C

120’




• ossidare con soluzione di KMnO4 (permanganato di K) 5’


• soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1’


• soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C

120’






• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’


• disidratare in etanolo 95°4’







• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’






COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ELASTIC - VAN GIESON”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ELASTIC - VAN GIESON”

Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro

Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro

• La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.

• M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.

• M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a 100.000 x.

• Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.

• La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.

• M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.

• M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a 100.000 x.

• Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.

MICROSCOPIA ELETTRONICAMICROSCOPIA ELETTRONICA

MICROSCOPIA ELETTRONICA“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”

MICROSCOPIA ELETTRONICA“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”

• taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante

• le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø

• colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10’

• lavare in H2O distillata

• colorare con citrato di piombo

10’


• far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali

• osservare al M.E.

• taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante

• le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø

• colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10’


• colorare con citrato di piombo

10’


• far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali

• osservare al M.E.

• fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h

• lavare in PBS (3 cambi) 10’

• post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h

• lavare in PBS 20’

• disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h

• chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h

• resina epossidica EPON + toluene [1 : 1] RT 12 h

• resina epossidica EPON RT 12 h• inclusione in capsule di gelatina o di

plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h

• fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h

• lavare in PBS (3 cambi) 10’

• post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h

• lavare in PBS 20’

• disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h

• chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h

• resina epossidica EPON + toluene [1 : 1] RT 12 h

• resina epossidica EPON RT 12 h• inclusione in capsule di gelatina o di

plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h

Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.

Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.

Citologia

Finalità

Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti

Modalità di preparazione

Citologia

Finalità

Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti

Modalità di preparazione

Preparati citologiciPreparati citologici

• Cervice uterina

• Urine • Versamenti

• Bronchi

• Vie bilari

• Polmone• Mammella• Tiroide• Linfonodi

• Cervice uterina

• Urine • Versamenti

• Bronchi

• Vie bilari

• Polmone• Mammella• Tiroide• Linfonodi

• Striscio - Spatole• Citocentrifugati

• Striscio - Spatole• Citocentrifugati

• Spazzolati• Spazzolati

• Agoaspirati• Agoaspirati

• Microbiopsie• Microbiopsie

CitologiaCitologia

• Automatica

• Strisci

• Citocentrifuga Filtri Millipore

• Centrifugazione liquidi

• Inclusione di sedimenti

• Automatica

• Strisci

• Citocentrifuga Filtri Millipore

• Centrifugazione liquidi

• Inclusione di sedimenti

• Analisi d’immagine• Citometria di flusso

• Analisi d’immagine• Citometria di flusso

• Ago• Spatole• Anse

• Ago• Spatole• Anse

Agoaspirati

Sedimenti Fissazione Inclusione

Principali Fissativi

Agoaspirati

Sedimenti Fissazione Inclusione

Principali FissativiAlcool

Formalina

Alcool

Formalina O

H- C H

OH- C

H


• Ematossilina di Harris, filtrata, 3’


• soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10”




• soluzione di etanolo 70° 2’



• Ematossilina di Harris, filtrata, 3’


• soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10”






• Colorare in Orange G 6 3’

• etanolo 95° (2 cambi) 20”

• Colorare in EA 50 3’






• Colorare in Orange G 6 3’


• Colorare in EA 50 3’






COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “PAPANICOLAOU”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “PAPANICOLAOU”

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa-arancione\rosso chiaro (eosinofilia)

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa-arancione\rosso chiaro (eosinofilia)

Col. PapanicolauVantaggi ed eventi determinanti

• -Definizione dei dettagli nucleari

• -Trasparenza citoplasmatica

• -Differenziaione dei vari tipi cellulari

• -Corretta fissazione

• -Buona col. Nucleare

• -Coloranti con sol. altamente alcooliche

• -Adeguata diafanizzazione

• -Colorazione policromatica

Problemi di colorazione con Papanicolau

1)Coloraz. Nucleare pallida

-Insufficente rimozione di “fissativi a pellicola” (polietilen-

glicole + alcool etilico)-azione decolorante di HCl

-striscio parzialmente asciugato prima della fissazione


1)Coloraz. Nucleare pallida

-Insufficente rimozione di “fissativi a pellicola” (polietilen-

glicole + alcool etilico)-azione decolorante di HCl

-striscio parzialmente asciugato prima della fissazione


1)Coloraz. Nucleare pallida (2)

-pH dell’acqua corrente poco alcalino

-colorante troppo vecchio


1)Coloraz. Nucleare pallida (2)

-pH dell’acqua corrente poco alcalino

-colorante troppo vecchio


2)Coloraz. Nucleare troppo intensa

-fissazione con alcool >95%-tempo di immersione in HCl

troppo breve-striscio troppo spesso

che trattiene il colore

(N.B. è possibile decolorare)


2)Coloraz. Nucleare troppo intensa

-fissazione con alcool >95%-tempo di immersione in HCl

troppo breve-striscio troppo spesso

che trattiene il colore

(N.B. è possibile decolorare)


3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente

-permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione

-asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa



-permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione

-asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa



-striscio di alterno spessore-tempo di coloraz. scarso o non

scuotimento del cestello-scarsa col. con verde luce =

sostituire o pH non 4,5-5



-striscio di alterno spessore-tempo di coloraz. scarso o non

scuotimento del cestello-scarsa col. con verde luce =

sostituire o pH non 4,5-5


4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule

-filtrare i coloranti


4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule

-filtrare i coloranti


• Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60’

• differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10”


• differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio

10”

• arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2’

(3 cambi)


• Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60’

• differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10”


• differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio

10”

• arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2’

(3 cambi)



effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell’ eosinato di Azur.La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti.



effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell’ eosinato di Azur.La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti.

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA”

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto* specialmente elettiva per le cellule del sangue *

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto* specialmente elettiva per le cellule del sangue *

• sezioni fatte essiccare all’aria

• post-fissazione in metanolo

15’


• soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15’

• sezioni fatte essiccare all’aria

• post-fissazione in metanolo

15’


• soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15’


(3 cambi)

• fare asciugare a secco

• chiarificare in xilolo (3

cambi)

• montare in mezzo

d’inclusione (Entellan o

balsamo Canada)


(3 cambi)

• fare asciugare a secco

• chiarificare in xilolo (3

cambi)

• montare in mezzo

d’inclusione (Entellan o

balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA modificato”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA modificato”

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto(eseguito specie su strisci)

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto(eseguito specie su strisci)


• cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2’

• scolare eccesso di colorante

• soluzione di Lugol 3 0”

• lavare in H2O di fonte

• differenziare in soluzione di alcool - acetone 20”


• fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2’

• lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula


• cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2’

• scolare eccesso di colorante

• soluzione di Lugol 3 0”


• differenziare in soluzione di alcool - acetone 20”


• fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2’

• lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula


(3 cambi)





(3 cambi)




COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GRAM”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GRAM”

Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione

Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione


• fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare


• differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore



• fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare


• differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore


• blu di metilene [1 % in H2O

distillata] 5 - 10 ’


• disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2’

(3 cambi)



• blu di metilene [1 % in H2O

distillata] 5 - 10 ’


• disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2’

(3 cambi)



COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”

Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari bluN. B. : porre attenzione alla differenziazione

Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari bluN. B. : porre attenzione alla differenziazione

Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :

E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili.

• celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato)

• riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)

• riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso

• riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare

• allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.

Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :

E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili.

• celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato)

• riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)

• riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso

• riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare

• allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.

INCLUSIONE DELLE CELLULEINCLUSIONE DELLE CELLULE


• Ematossilina di Harris, filtrata,

3’


• soluzione alcool - acida a pH 3

(alcool 70° + HCl) 10”





• Ematossilina di Harris, filtrata,

3’


• soluzione alcool - acida a pH 3

(alcool 70° + HCl) 10”






1’








1’






COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina

COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina

Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.


• ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’


• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’

• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’

• HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’




• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’



• sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’


• verde di metile [1 %] 5 - 10 ’

• disidratare in etanolo 95° 4 ’


(3 cambi)






• verde di metile [1 %] 5 - 10 ’



(3 cambi)




COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”

Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso


• soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight



• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre-riscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio

30’ - 40 ’


• HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2 - 3 ’



• soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight



• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre-riscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio

30’ - 40 ’


• HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2 - 3 ’




• liquido di Bouin a 60 °C 30’



• soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2’


• soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 ’




(3 cambi)


• montare in mezzo d’inclusione neutro



• liquido di Bouin a 60 °C 30’



• soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2’


• soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 ’




(3 cambi)


• montare in mezzo d’inclusione neutro

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA - PAS”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA - PAS”

Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso


• soluzione di Lugol 5’

• decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2’



• soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15’




• soluzione di Lugol 5’

• decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2’



• soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15’



• soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3’

• lavare in H2O di fonte3’

• differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa



(3 cambi)



• soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3’

• lavare in H2O di fonte3’

• differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa



(3 cambi)



COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI MANN - DOMINICI”

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI MANN - DOMINICI”

Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili bluelettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli

Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili bluelettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli


• soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g

orceina + 100 ml H2O distillata 30’

• lavare in CH3COOH [45 %] 1’

• lavare in alcool butilico terziario 2’

• soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2’




• soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g

orceina + 100 ml H2O distillata 30’

• lavare in CH3COOH [45 %] 1’

• lavare in alcool butilico terziario 2’

• soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2’



COLORAZIONE IN CITO-GENETICA “METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”COLORAZIONE IN CITO-GENETICA

“METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”

Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porporauna variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.

Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porporauna variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.

Microscopia a fluorescenzaMicroscopia a fluorescenza

Fluorescenza Fluorescenza Illuminazione con luce a breve

Emissione nel visibile

Illuminazione con luce a breve

Emissione nel visibile

Filtri

Fluoroforo (Fluorocromo)

Fosforescenza

Filtri

Fluoroforo (Fluorocromo)

Fosforescenza

Eccitazione / SbarramentoEccitazione / Sbarramento

Caratt. Spettro di Assorbimento

Caratt. Spettro di Emissione

Caratt. Spettro di Assorbimento

Caratt. Spettro di Emissione

Piccole quantitàPiccole quantità

Tipi di FluorescenzaTipi di Fluorescenza

• Autofluorescenza

O• Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline

H N

• Fluorocromi - effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici

DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso

METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore

A.O. Citologia METACROMASIA MASCHERATA

• Autofluorescenza

O• Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline

H N

• Fluorocromi - effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici

DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso

METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore

A.O. Citologia METACROMASIA MASCHERATA

- fibre elastiche - LIPOFUSCINE

- NADH2 - Porfirine- Vit. A

- Farmaci

- fibre elastiche - LIPOFUSCINE

- NADH2 - Porfirine- Vit. A

- Farmaci

TetraciclineAdriamicinaChinacrineBenzopirene

TetraciclineAdriamicinaChinacrineBenzopirene

Reagenti di SCHIFF Fluorescenti ALDEIDI

FUCSINA BASICA (para-rosanilina)

Tioflarina T AMILOIDE PROCION yellow cellule (neuroni)

BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting

Reagenti di SCHIFF Fluorescenti ALDEIDI

FUCSINA BASICA (para-rosanilina)

Tioflarina T AMILOIDE PROCION yellow cellule (neuroni)

BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting

IMMUNOFLUORESCENZA Lampade

Problemi di DECADENZA FOTOGRAFIA

Liq. di montaggio VETRI

IMMUNOFLUORESCENZA Lampade

Problemi di DECADENZA FOTOGRAFIA

Liq. di montaggio VETRI

XENONMERCURIOXENONMERCURIO

Gruppi reattivi dimostrabili su sezioniGruppi reattivi dimostrabili su sezioni

• Importanza in patologia diagnostica • Importanza in patologia diagnostica

Acidi Nucleici Acidi Nucleici

• Coloraz. con coloranti basici

• Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)

• Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)

• Reaz. Di FEULGEN

• Coloraz. con coloranti basici

• Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)

• Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)

• Reaz. Di FEULGEN

•M.O. Ordinaria

•M. Fluorescenza

(Acridina Orange)

Metacromasia

•M.O. Ordinaria

•M. Fluorescenza

(Acridina Orange)

Metacromasia

Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici


· Metodi qualitativiMetodi qualitativi

quantitativiquantitativi

· Interesse in patologiaInteresse in patologia

VIRUSVIRUS

· Distribuzione del DNADistribuzione del DNA

· Met. FeulgenMet. Feulgen




VIRUSVIRUS



• CROMO-GALLOCIANINACROMO-GALLOCIANINA

• Reaz. di FEULGEN Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiribosoper legame purina - Desossiriboso

Idrolisi acidaIdrolisi acida Formaz. di gr. aldeidiciFormaz. di gr. aldeidiciFrammentazione del DNAFrammentazione del DNA

ConcentrazioneConcentrazioneHClHCl

TemperaturaTemperatura

• CROMO-GALLOCIANINACROMO-GALLOCIANINA

• Reaz. di FEULGEN Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiribosoper legame purina - Desossiriboso

Idrolisi acidaIdrolisi acida Formaz. di gr. aldeidiciFormaz. di gr. aldeidiciFrammentazione del DNAFrammentazione del DNA

ConcentrazioneConcentrazioneHClHCl

TemperaturaTemperatura

SensibilitàSensibilitàSpecificità diSpecificità di

- reazione- reazione- localizzazione- localizzazione

SensibilitàSensibilitàSpecificità diSpecificità di

- reazione- reazione- localizzazione- localizzazione

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)


• idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato

da 4’ a 25’

(usare anche HCl 5 N a RT) (10’)

• lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata

• reattivo di Schiff 40’ - 60’

• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2’



• idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato

da 4’ a 25’

(usare anche HCl 5 N a RT) (10’)

• lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata

• reattivo di Schiff 40’ - 60’

• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2’


• contrasto citoplasmatico con

verde luce [1 %] 1’



4’


4’ (3 cambi)




• contrasto citoplasmatico con

verde luce [1 %] 1’



4’


4’ (3 cambi)




COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “FEULGEN reazione”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “FEULGEN reazione”

Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verdeRisultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verde






VIRUSVIRUS






VIRUSVIRUS



Valutazione quantitativaValutazione quantitativa

Principi

Variazione di assorbimento

Lunghezza d’onda

Principi

Variazione di assorbimento

Lunghezza d’onda

CellCell

LuceLuce

Metodi alternativiMetodi alternativi

BRDUBRDU

TIMIDINA TRITIMIDINA TRIZZIATAIATA

- Ibridizzazione in - Ibridizzazione in situsitu

- Immunocitochimica- Immunocitochimica

- Autoradiografia- Autoradiografia

- Citofluorimetria- Citofluorimetria cell sortercell sorter

BRDUBRDU

TIMIDINA TRITIMIDINA TRIZZIATAIATA

- Ibridizzazione in - Ibridizzazione in situsitu

- Immunocitochimica- Immunocitochimica

- Autoradiografia- Autoradiografia

- Citofluorimetria- Citofluorimetria cell sortercell sorter

LaserLaser

AutoradiografiaAutoradiografia• Principi

• Potere di risoluzione

• Stripping

• Emulsione

• Marcatori H3 / P4 / S

• Principi

• Potere di risoluzione

• Stripping

• Emulsione

• Marcatori H3 / P4 / S

Tempo di EsposizioneTempo di Esposizione

• Principi

(Conteggio granuli / fondo)

• Principi

(Conteggio granuli / fondo)

• Timidina H3

• Ibridizzazione in situ

• Legame di affinità

• Timidina H3

• Ibridizzazione in situ

• Legame di affinità

Ibridizzazione in situ (ISH) Ibridizzazione in situ (ISH)

• Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)

• mRNA specifico - gene espressione(vantaggi rispetto a ICC)

• RNA / DNA virale

• Metodi - Sonde

• Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)

• mRNA specifico - gene espressione(vantaggi rispetto a ICC)

• RNA / DNA virale

• Metodi - SondeRiboprobes

Oligos

Riboprobes

Oligos

Marcatura - Raidoatt.

Auto-radiografia

Non radioatt.

Marcatura - Raidoatt.

Auto-radiografia

Non radioatt.

• Biotina

• Digoxiganina

• Fluorescina

• Biotina

• Digoxiganina

• Fluorescina

ICCICC

- S- H - pH

- S- H - pH

• Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse.

• La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE].

• Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l’ avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari.

• La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).

• Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.

• Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse.

• La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE].

• Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l’ avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari.

• La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).

• Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.

IBRIDIZZAZIONE IN SITUI S H

IBRIDIZZAZIONE IN SITUI S H

Ibridizzazione in situ (ISH) Ibridizzazione in situ (ISH)

• Problemi

• Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni

(necessità di identificazione del tipo di cellule)

• Problemi

• Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni

(necessità di identificazione del tipo di cellule)

• Sensibilità

• Localizzazione (Definizione)

• Conservazione strutturale

• Sensibilità

• Localizzazione (Definizione)

• Conservazione strutturale

• Sistemi laser / catapulta• Sistemi laser / catapulta


• trattare in soluzione di Lugol 10’


• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT




• trattare in soluzione di Lugol 10’


• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT





• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’



(3 cambi)








(3 cambi)



COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”

Risultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intensoRisultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intenso


• soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5’

• soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25’


• lavare H2O distillata



• soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5’

• soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25’




• lavare H2O di fonte

5’


4’


4’ (3 cambi)




• lavare H2O di fonte

5’


4’


4’ (3 cambi)




COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PERLS x IL FERRO”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PERLS x IL FERRO”

Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)


• soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H2O

distillata) a 60° C 120 - 180’



• contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1’



• soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H2O

distillata) a 60° C 120 - 180’



• contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1’


• lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2’






• lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2’






COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PER IL RAME”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PER IL RAME”

Risultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuroRisultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuro


• soluzione acquosa di AgNO3

(nitrato Argento) [3 %] 60’

• sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3’


• fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3’




• soluzione acquosa di AgNO3

(nitrato Argento) [3 %] 60’

• sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3’


• fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3’















COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”

Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)


• soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro

ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml)

5 - 10 ’


• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml)

3’


• soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro

ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml)

5 - 10 ’


• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml)

3’



• disidratare in etanolo 100° 4’ (3

cambi)


• montare in mezzo d’inclusione (Entellan

o balsamo Canada)



• disidratare in etanolo 100° 4’ (3

cambi)


• montare in mezzo d’inclusione (Entellan

o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “DI FOUCHET x LA BILE”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “DI FOUCHET x LA BILE”

Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo


• soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60’

• disidratare in alcool isopropilico assoluto 5’

(3 cambi)




• soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60’

• disidratare in alcool isopropilico assoluto 5’

(3 cambi)



Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann).

Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann).

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “LUXOL FAST BLUE”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “LUXOL FAST BLUE”

Risultati : la mielina appare in bluRisultati : la mielina appare in blu

• PREPARAZIONE SOLUZIONI• sol. A : Naftolo AS-D

Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.]

• sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.]

• sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare)

• sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.]

• sol. E : “working” Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]

• PREPARAZIONE SOLUZIONI• sol. A : Naftolo AS-D

Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.]

• sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.]

• sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare)

• sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.]

• sol. E : “working” Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]

• sezioni in H2O distillata• soluzione substrato : ( 0.8 ml.

sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1’ - 2’

• lavare con H2O distillata 5’• Emallume acido di Mayer,

filtrato, 5’• lavare H2O di fonte 10’



• disidratare in etanolo 95° 4’• disidratare in etanolo 100° 4’

(3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in resina sintetica

• sezioni in H2O distillata• soluzione substrato : ( 0.8 ml.

sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1’ - 2’

• lavare con H2O distillata 5’• Emallume acido di Mayer,

filtrato, 5’• lavare H2O di fonte 10’



• disidratare in etanolo 95° 4’• disidratare in etanolo 100° 4’

(3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in resina sintetica

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :

“CLORO - ACETATO ESTERASI”

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :

“CLORO - ACETATO ESTERASI”

Risultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuroRisultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro

• CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO

• SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI

• USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE

• USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO

• USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO

• USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE

• USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE

• USARE MASSIMA CAUTELA NELL’ IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE

• EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE

• CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA

• OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI

• NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO

• CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO

• SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI

• USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE

• USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO

• USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO

• USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE

• USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE

• USARE MASSIMA CAUTELA NELL’ IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE

• EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE

• CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA

• OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI

• NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO

SICUREZZA IN LABORATORIOSICUREZZA IN LABORATORIO

• RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.

• RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE.

• RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I).

• RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.

• RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.

• RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE.

• RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I).

• RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.

RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIORISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO

ARTEFATTI ISTOLOGICI

Definizione

Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di

materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini.

E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o

una malattia del paziente.

Definizione

Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di

materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini.

E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o

una malattia del paziente.


1)Artefatti causati prima del prelievo:

1.1. Polvere di talco

1.2. Materiale di sutura

1.3. Effetto da termocauterio

1.4. Effetto da agenti chimici

1.5. Particelle di carbone

6. Garza

1.7. Essicamento

1)Artefatti causati prima del prelievo:

1.1. Polvere di talco

1.2. Materiale di sutura

1.3. Effetto da termocauterio

1.4. Effetto da agenti chimici

1.5. Particelle di carbone

6. Garza

1.7. Essicamento


2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico

2.1. Effetti di schiacciamento

2.2. Essiccazione

2.3. Congelamento

2.4. Chinatura

2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere

2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico

2.1. Effetti di schiacciamento

2.2. Essiccazione

2.3. Congelamento

2.4. Chinatura

2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere


3) Artefatti durante la fissazione

3.1. Autolisi durante la fissazione

3.2. Fissazione inadeguata o incompleta

3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker

(coartazione)

3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico

3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina

3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina

3) Artefatti durante la fissazione

3.1. Autolisi durante la fissazione

3.2. Fissazione inadeguata o incompleta

3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker

(coartazione)

3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico

3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina

3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina


4)Artefatti legati a procedure di inclusione

4.1. Inadeguata fissazione

4.2. Inadeguata disidratazione

4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti

4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina

4.5. Uso di paraffina troppo calda

4)Artefatti legati a procedure di inclusione

4.1. Inadeguata fissazione

4.2. Inadeguata disidratazione

4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti

4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina

4.5. Uso di paraffina troppo calda


5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione

5.1. Inclusione di frammenti multipli di

diversa durezza

5.2. Orientamento scorretto dei frammenti

5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta

5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione

5.1. Inclusione di frammenti multipli di

diversa durezza

5.2. Orientamento scorretto dei frammenti

5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta


6)Artefatti da sezionamento erroneo

6.1. Angolo di taglio sbagliato

6.2. Lama o blocchetto mal fissati

(effetto “tende alla veneziana”)

6.3. Lame poco affilate

6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo

“pesci”

6)Artefatti da sezionamento erroneo

6.1. Angolo di taglio sbagliato

6.2. Lama o blocchetto mal fissati

(effetto “tende alla veneziana”)

6.3. Lame poco affilate

6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo

“pesci”


7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini

7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini

7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo

7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti

7.4. Pieghe nelle sezioni

7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni

7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni

7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini

7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini

7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo

7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti

7.4. Pieghe nelle sezioni

7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni

7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni


8) Artefatti da colorazione I

8.1. Mancata sparaffinatura

8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro

8.3. Sbagli nella colorazione con:

8.4. Ematossilina di Harris

8.5. Emallume di Mayer

8.6. Eosina

8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio

8) Artefatti da colorazione I

8.1. Mancata sparaffinatura

8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro

8.3. Sbagli nella colorazione con:

8.4. Ematossilina di Harris

8.5. Emallume di Mayer

8.6. Eosina

8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio


8) Artefatti da colorazione II

Sbagli nelle colorazioni speciali:

8.5. PAS

8.6. PAS-diastasi

8.7. Rosso Congo

8.8. Giemsa

8.9. Feulgen

8.10. Metenamina-argento per i funghi

8) Artefatti da colorazione II

Sbagli nelle colorazioni speciali:

8.5. PAS

8.6. PAS-diastasi

8.7. Rosso Congo

8.8. Giemsa

8.9. Feulgen

8.10. Metenamina-argento per i funghi


9) Errori nel montaggio con coprioggetto

9.1. Contaminazione del liquido di montaggio

9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli

9.3. Erroneo posizionamento del vetrino

9.4. Intrappolamento di bolle d’aria

9.5. Montante troppo abbondante

9.6. Montante troppo scarso

9) Errori nel montaggio con coprioggetto

9.1. Contaminazione del liquido di montaggio

9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli

9.3. Erroneo posizionamento del vetrino

9.4. Intrappolamento di bolle d’aria

9.5. Montante troppo abbondante

9.6. Montante troppo scarso

ARTEFATTI IN CITOLOGIA

c.1.) Errori nella raccolta delle cellule

c.1.1. Cellule sovrapposte

c.1.2. Cellule troppo rade

c.1.3. Eccessiva quantità di sangue

c.1.4. Mancato uso di adesivo

c.1.5. Effetto da citocentrifuga

c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine)

c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione

c.1.) Errori nella raccolta delle cellule

c.1.1. Cellule sovrapposte

c.1.2. Cellule troppo rade

c.1.3. Eccessiva quantità di sangue

c.1.4. Mancato uso di adesivo

c.1.5. Effetto da citocentrifuga

c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine)

c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione


c.2.) Errori nella fissazione delle cellule

c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione

(nella col. di Papanicolau)

c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento

(nella col. di Giemsa)

c.2.) Errori nella fissazione delle cellule

c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione

(nella col. di Papanicolau)

c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento

(nella col. di Giemsa)


c.3) Errori nella colorazione delle cellule

con la col. di Papanicolau

c.3.1. Col. Nucleare troppo debole

c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa

c.3.3. Col. con Orange G troppo debole

c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa

c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole

c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa

c.3) Errori nella colorazione delle cellule

con la col. di Papanicolau

c.3.1. Col. Nucleare troppo debole

c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa

c.3.3. Col. con Orange G troppo debole

c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa

c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole

c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa


c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto

c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio

c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli

c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino

c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria

c.4.5. Montante troppo abbondante

c.4.6. Montante troppo scarso

c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto

c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio

c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli

c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino

c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria

c.4.5. Montante troppo abbondante

c.4.6. Montante troppo scarso

ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su...

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