EPATITE E: UNA ZOONOSI EMERGENTE. IDENTIFICAZIONE E · PDF file 2014. 4. 30. ·...

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  • 1

    UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI

    “FEDERICO II”

    FACOLTA’ DI MEDICINA VETERINARIA

    DIPARTIMENTO DI SCIENZE ZOOTECNICHE E

    ISPEZIONE DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE

    SEZIONE DI ISPEZIONE

    TESI DI DOTTORATO IN

    Produzione e Sanità degli alimenti di origine animale

    - XXII ciclo -

    EPATITE E: UNA ZOONOSI EMERGENTE. IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE

    DEL VIRUS IN ALLEVAMENTI SUINICOLI DEL SUD ITALIA

    TUTOR

    Prof.ssa Teresa Sarli CANDIDATA Prof. Adriano Santoro Dott.ssa Ester Maione

    COORDINATORE

    Prof.ssa M.L.Cortesi

    ANNI ACCADEMICI 2006- 2009

  • 2

    a Teresa Sarli

  • 3

  • 4

    INDICE

    Riassunto………………………………………….12

    Abstract……………………………………………………….15

    INTRODUZIONE……………………………………………18

    CAPITOLO 1: EZIOLOGIA…………………………….22

    Cenni storici……………….……………………….22

    Classificazione tassonomica.……………………....26

    Caratteri del virus……..…………………………..28

    � Organizzazione

    genomica………………………………………30

    � Genotipi virali………………………………………..34 � Ciclo replicativo……………………………………..38

    -Spettro d’ospite invitro………………………………..42

    -Spettro d’ospite in vivo………………………………..43

    CAPITOLO 2: EPIDEMIOLOGIA………………………46

    EPIDEMIOLOGIA NELL'UOMO ……………………………46

    Caratteristiche dell'infezione nei Paesi in via di

    sviluppo……………………………………………50

  • 5

    -Vie di trasmissione dell’infezione nei Paesi in via di

    sviluppo………………………………………………….50

    -Fattori di rischio correlati all’infezione nei paesi

    in via di sviluppo……………………………………53

    Caratteristiche dell’infezione nei paesi

    industrializzati……………………… ……..………51

    -Modalità d’acquisizione dell’infezione nei paesi

    industrializzati…………………………………….……59

    -Fattori di rischio correlati all'infezione nei Paesi

    industrializzati…………………………………………61

    EPIDEMIOLOGIA NELLE SPECIE ANIMALI

    RECETTIVE ALL’IFEZIONE………………… 63

    L’infezione negli animali…………………...63

    HEV nel suino……………………………………67

    Altre specie recettive………………………..74

    Roditori…………………………………………...74

    Pollame……………………………………..……76

  • 6

    CAPITOLO 3: PATOLOGIA E

    SINTOMATOLOGIA……………… ………..78

    MALATTIA NELL’UOMO …………..…..78

    Patogenesi nell’uomo……………………78

    Caratteristiche cliniche………………..86

    Aspetti istopatologici……………………………93

    Prognosi e profilassi……………………………95

    MALATTIA NEL SUINO…………… ……99

    Patogenesi nel suino…………………….99

    Aspetti clinici………………………104

    CAPITOLO 4: DIAGNOSI DI

    INFEZIONE DA HEV……… …………...109

    Diagnosi clinica……………………109

  • 7

    Tecniche di diagnostica diretta:

    Microscopia elettronica………………...111

    Polymerase Chain Reaction(PCR)…….…112

    PCR qualitativa……………………………112

    PCR quantitativa……………………………116

    Coltivazione in culture cellulari………118

    Tecniche istopatologiche…………...…120

    Tecniche di diagnostica indiretta………121

    CAPITOLO 5: HEV COME ZOONOSI… 124

    Possibilità di infezione interspecifica……128

    Il rischio zoonotico………………………134

    Casi di trasmissione alimentare nel

    mondo…144

  • 8

    Contatto con animali e reflui

    infetti …………………………………147

    SEZIONE SPERIMENTALE

    CAPITOLO 6: SCOPO DELLA TESI…………150

    CAPITOLO 7: MATERIALI E METODI…… 154

    Raccolta dei campioni……………...154

    -Prelievo campioni fecali………………..…156

    -Prelievo campioni di fegato e siero……..156

    - Ripartizione sul territorio degli allevamenti

    sottoposti ad analisi…………………….157

  • 9

    Preparazione dei campioni…………162

    Estrazione dell’RNA virale…………164

    Retrotrascrizione dell’RNA virale…167

    Amplificazione del cDNA………….170

    RT-PCR one-tube e nested-PCR…174

    SEQUENZIAMENTO E ANALISI FILOGENETICA…. 178

    SEPARAZIONE ELETTROFORETICA SU GEL

    DI POLIACRILAMMIDE (SDS-PAGE) E

    WESTERN BLOTTING …………………180

    CAPITOLO 8 : RISULTATI………………182

    Risultati campioni fecali………………182

    Risultati fegati analizzati………………189

  • 10

    Ricerca di anticorpi anti-HEV in sieri suini…191

    SEQUENZIAMENTO ED ANALISI FILOGENETICA ..193

    CAPITOLO 9 : DISCUSSIONE DEI RISULTATI

    E CONCLUSIONI…… ………………………….197

    Bibliografia………………………………… 211

    Ringraziamenti………………………………244

  • 11

  • 12

    RIASSUNTO

    Il virus HEV è l’agente eziologico dell’epatite E, una

    forma acuta di epatite infettiva diffusa un po’ in tutto il

    mondo. La malattia è causata da un piccolo RNA virus

    a singolo filamento privo di envelope, classificato in un

    genere separato come Hepevirus. L’infezione da HEV

    rappresenta un serio problema di sanità pubblica nei

    paesi in via di sviluppo dove ha carattere endemico ed

    è primariamente trasmesso per via oro-fecale. Negli

    ultimi anni, un certo numero di casi sporadici è stato

    descritto anche nei paesi industrializzati, Italia inclusa.

    L’ HEV nel suino fu identificato per la prima volta nel

    1997 ed ora è considerato un virus ubiquitario. In

    Italia, HEV umano è stato isolato per la prima volta nel

    1999, mentre l'infezione nel suino è stata riportata nel

    2006. L'infezione da HEV nel suino è asintomatica;

    nell’uomo il virus provoca epatite acuta epidemica nei

    Paesi in via di sviluppo e casi sporadici in Paesi

    industrializzati. Le caratteristiche cliniche dell’ epatite

    E sono simili a quelle dell’epatite A .La malattia

    presenta un periodo di incubazione variabile tra le tre

    e le nove settimane, e ciò ne rende, talvolta, difficile

    l’identificazione. I sintomi sono simil influenzali ed

    includono: febbre, stanchezza, ittero, e disordini

    gastrointestinali. La diagnosi è basata sui segni clinici

    ed è poi confermata sierologicamente. L’infezione non

    cronicizza e non vi è nessuna evidenza di trasmissione

  • 13

    sessuale. La mortalità complessiva è dal 0.5-4% ,

    quindi lievemente più elevata rispetto all’epatite A.

    Tuttavia, la malattia può essere molto pericolosa per le

    donne in gravidanza, in cui la mortalità è talvolta più

    elevata del 25%. E’ stata dimostrata un’elevata

    sieroprevalenza in persone che vivono a stretto

    contatto con animali infetti rispetto alla popolazione di

    controllo. Molti autori ipotizzano che il virus abbia

    tendenza ad endemizzare modificandosi geneticamente

    ed adattandosi all’ambiente in cui vive. Le sequenze

    umane e suine isolate nella stessa area geografica

    presentano un’elevata omologia nucleotidica ed

    infezioni sperimentali dimostrano la possibilità di

    trasmissione crociata di ceppi suini all’uomo e di

    ceppi umani a primati non-umani. Il virus è stato

    isolato in vari animali selvatici e domestici, inclusi

    pollo, suino, ratto cervo, cinghiale ed altri. La

    trasmissione di HEV da suino all’uomo tramite

    l'ingestione di carne infetta è stata già dimostrata.

    Perciò si presume che il suino posso rappresentare una

    fonte di infezione