Attilio Olivieri, Erika MorsiaDipartimento di Scienze Cliniche e Molecolari, Clinica di EmatologiaFacoltà di Medicina e Chirurgia, Università Politecnica delle Marche

Indagini qualitative sulle cellule del sangue periferico

Lo striscio di sangue permette di ottenere una sorta di fotografia, un'istantanea della popolazionecellulare presente in una goccia di sangue. Tramite lo striscio su vetrino è infatti possibile valutare ilnumero, la morfologia, lo stadio di maturazione e le percentuali numeriche di globuli rossi, leucocitie piastrine.

Per l’esecuzione dello striscio può essere utilizzato sangue intero o contenente anticoagulante dellaprovetta; la colorazione si effettua con la metodica di May-Grunwald-Giemsa nei paesi europei,mentre negli Stati Uniti si utilizza la colorazione di Wright.

L’esame microscopico si effettua inizialmente a piccolo ingrandimento per una valutazione globaledel preparato, che ci indica la leggibilità e la distribuzione dei leucociti e delle piastrine. Poi con unmaggiore ingrandimento è possibile individuare le modificazioni di forma e di dimensioni dei globulirossi, la morfologia dei leucociti con la valutazione della formula leucocitaria e la eventuale presenzadi cellule anomale. Inoltre è possibile valutare la presenza di piastrine, la morfologia di queste e lapossibile presenza di aggregati.

In passato lo striscio di sangue periferico veniva effettuato quasi a tutti coloro che eseguivano unesame emocromocitometrico; esso rappresentava il metodo standard per valutare dimensioni, formae struttura dei globuli rossi, l’identificazione del tipo e delle percentuali di globuli bianchi nonchéper verificare una presenza di piastrine entro i range di normalità. Questo tipo di valutazione è stataormai quasi del tutto sostituita dalle conte automatizzate. Quando, però, alla conta automatizzata oquando lo specialista sospetti anomalie a carico di globuli rossi, globuli bianchi o piastrine, lostriscio di sangue analizzato da un laboratorista esperto è ritenuto ancora oggi il miglior modo pervalutare e identificare in modo corretto anormalità e immaturità delle cellule del sangue. In genere,l'esecuzione dello striscio segue un esame di prima linea, come l'emocromo, considerato sospetto.

Ad esempio, lo striscio di un soggetto affetto da anemia falciforme mostra la tipica conformazione afalce dei globuli rossi, che risultano invece troppo piccoli in caso di anemia microcitica e troppograndi in presenza di anemia macrocitica. Grazie allo striscio di sangue è altresì possibileevidenziare la presenza di parassiti, come ad esempio quelli responsabili di malaria, filaria e malattiadel sonno.

Lo studio della morfologia eritrocitaria permette di riconoscere la presenza di alterazionimorfologiche e tintoriali che la citometria in automazione non evidenzia perché valuta solo volumi ecromia corpuscolare. Le principali alterazioni sono: macrocitosi (diametro cellulare >8 um : anemiemegaloblastiche, epatopatie gravi, ipotiroidismo); microcitosi ( diametro cellulare <6 um: anemiaferrocarenziale, talassemie, anemia da malattia cronica); ipocromia (area pallida centraleaumentata: contenuto di Hb diminuito); policromatofilia (presenza di globuli rossi noncompletamente emoglobinizzati : reticolocitosi); poichilocitosi (variabilità nella forma cellulare:anemia falcicorme, emolisi microangiopatica, leucemie, emopoiesi extramidollare, stress midollare),anisocitosi (variabilità nelle dimensioni cellulari: reticolocitosi, trasfusioni di sangue normale ioncondizioni di popolazioni cellulari micro o macrocitiche); leptocitosi (cellule a bersaglio: talassemie,ittero ostruttivo); sferocitosi (cellule prive dell’area pallida centrale: perdita di membrana,sferocitosi ereditaria, accellerata distruzione dei globuli rossi da parte del sistema reticoloendoteliale); schistocitosi (cellule frammentate: traumi meccanici intravascolari, emolisimicroangiopatica); acantocitosi (superficie irregolarmente spinosa: anomalie del contenuto lipidico,

elevate concentrazioni di acidi grassi liberi, , epatopatie; abetalipoproteinemia); echinocitosi(superficie regolarmente spinosa: uso di farmaci come barbiturici, salicilati, ecc, anomalie delcontenuto lipidico, elevate concentrazioni di acidi grassi liberi, anormalità degli acidi biliari);stomatociti (area pallida centrale allungata a fessura: difetti ereditari di trasporto di membrana disodio, gravi epatopatie); ellissociti (cellule ovali: anomalie ereditarie).

Fig1. Striscio di sangue periferico normale ad alto ingrandimento, visibile nel campo un neutrofilo,normali globuli rossi e alcune piastrine (From Hillman at al.) .

Fig 2. Anemia severa sideropenica. Globuli rossi microcitici e ipocromici, più piccoli del nucleo di unlinfocita con marcata anisocitosi e poichilocitosi (From Hillman et al.) .

Fig.3.Macrocitosi delle emazie. Globuli rossi più grandi dei piccoli linfociti. Spesso i macrociti sonodi forma ovale (macro-ovalociti). (from Harrison’s principles of internal medicine)

Fig.4. Alterazioni dei globuli rossi nella mielofibrosi. A sinistra si vedono i dacriociti, a destra unglobulo rosso nucleolato. (From Harrison’s principles of internal medicine) .

Fig. 5. Cellule a bersaglio. Si riconoscono èer la tiica colorazione concentrica. Se le cellule sonopiccole è tipico di epatopatia e talassemia, se i globuli rossi sono di grandi dimensioni è tipicodell’emoglobinopatia C. (From Harrison’s principles of internal medicine) .

Fig 6. Sferocitosi. Si notano piccole cellule ipercromatiche senza l’area centrale tipicamente piùchiara. (From Harrison’s principles of internal medicine)

Con l’esame dello striscio si possono valutare anche il numero, le dimensioni, la morfologia ed ilfenomeno degli aggregati piastrinici. I megatrombociti si riscontrano in diverse patologiecongenite o non, che riguardano sia le piastrine (sindrome di Bernard-Soulier, piastrinopeniaautoimmune, sindrome di Moschowitz, etc.) che il sistema emopoietico (sindromi mielodisplastiche,sindromi mieloproliferative croniche, etc.). Gli aggregati piastrinici possono essere espressione diun’alterazione legata all’anticoagulante presente nelle provette (EDTA), che causa una falsariduzione del numero delle piastrine.

La determinazione microscopica della conta differenziale dei leucociti permette sia ilriconoscimento di alterazioni di forma e di dimensione, sia la valutazione quantitativa (valorerelativo in %) delle singole classi leucocitarie. In un campione di sangue la partecipazionepercentuale nella norma è la seguente: neutrofili 40-75%, linfociti 20-45%, monociti 0-8%, eosinofili0-7% e basofili <1%.

Nei moderni citometri “a flusso” elettro-ottici il riconoscimento delle sottoclassi leucocitarie si fondasull’analisi di due parametri cellulari: il volume corpuscolare misurato con light-scattering e ilcontenuto mieloperossidasi dei singoli leucociti.

In base al criterio dimensionale le cellule sono raggruppate in due classi: grandi cellule (linfocitiattivati, grandi linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili e basofili) e piccole cellule (piccoli linfociti),mentre il criterio citochimico le divide in perossidasi positive (neutrofili e eosinofili) e perossidasinegative (linfociti, monociti). I basofili sono riconosciuti per la loro tangibilità con l’alcian-blue o conla tecnica di decitoplasmazione con acido ftalico di Cremis-Orlik.

La conta dei neutrofili alterata viene definita neutropenia se < a 1.000/mmc e riconosce diversecause tra cui infezioni gravi e diffuse, malattie autoimmuni, reazioni da farmaci, immunodeficienza,mielodisplasia, danno midollare e mieloftosi; quando la conta è > a 7.700/mmc si definisceneutrofilia e può essere dovuta a infezioni batteriche acute, infiammazione, necrosi tissutale,condizioni fisiologiche come stress e esercizio fisico intenso o emopatie come leucemia mieloidecronica.

Alterazioni della conta dei linfociti in difetto (linfopenia) si hanno nel caso di malattie autoimmuni(come lupus eritematoso sistemico, infezioni come HIV, epatiti, febbre tifica, danni midollari e uso dicorticosteroidi); invece può risultare aumentata (linfocitosi) in caso di infezioni virali acute (CMV,EBV, HSV, rosolia,..), alcuni tipi di infezioni batteriche (pertosse, TBC), toxoplasmosi, infiammazionicroniche (come RCU) e emopatie come la leucemia linfatica cronica.

La monocitosi può essere dovuta a infezioni croniche (come TBC, infezioni fungine, endocarditibatteriche), patologie vascolari immunitarie (LES, sclerodermia, vasculiti, artrite reumatoide) edemopatie come leucemia monocitico o mielomonocitica. Una bassa conta dei monociti di solito non èrilevante, se ripetuta nel tempo può essere indice di danno midollare o leucemia a cellule capellute.

L’iperosinofilia si può associare a condizioni allergiche come asma, febbre da fieno, reazioni afarmaci, infezioni parassitarie, malattie infiammatorie croniche e alcuni tipi di tumori; una elevataconta di basofili si può associare raramente a reazioni allergiche, infiammazione (come artritereumatoide, rettocolite ulcerosa) e alcuni tipi di leucemia.

Fig 7. LLC. Proliferazione di linfociti con nucleo densamente strutturato. Sono frequenti ombrenucleari, segno della fragilità delle cellule. (from H. Theml – Color Atlas of Hematology)

Fig 8. LAL. Si possono vedere blasti (1) e linfociti (2) tipici della LAL. Per la classificazione ènecessario l’utilizzo di metodi immunologici. (nella immagine common ALL). (from H. Theml – ColorAtlas of Hematology)

Fig.9. LAM. Striscio periferico di leucemia monoblastica M5a con basti caratterizzati da nuclei concromatina finemente strutturata e ampio citoplasma. (from H. Theml – Color Atlas of Hematology)

Fig 10. LMC. Striscio periferico in fase cronica: neutrofili segmentati (1), neutrofili a banda (simili ametamielociti dopo la processazione nucleare, 2), mielociti con granulazione difettiva (3) epromielociti (4). (from H. Theml – Color Atlas of Hematology)

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Fonti delle immagini riprodotte

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