Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla...

Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

Dal Microscopio alla Biologia Molecolare

La Citologia Cervico-Vaginale: nuove tecnologie


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Human Papilloma Virus (HPV):- Papovavirus – Papilloma- DNA circolare con 8000 paia di basi- 2 capsidi proteici- Replica virale (nucleo cell. epit. squamose)- Trasmissione sessuale- Virus epiteliotrofico


Dal Microscopio alla Biologia MolecolareGENOMA VIRALE:- regione regolatoria - regione geni tardivi (L1, L2)- regione geni precoci (E1, E2, E4, E5, E6,

E7)- E6 – p53- E7 – p103, p107


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Regione REGOLATORIA regola la trascrizione dei

geni controllando la produzione di proteine virali e particelle infettive

Regione GENI TARDIVI con due unità trascrizionali, L1- L2 che codificano per le proteine del capside,rispettivamente per il capside maggiore e minore.

Regione GENI PRECOCI con 6 unità trascrizionali dette E1,E2,E4,E5,E6,E7,che codificano per le proteine necessarie alla replica virale.


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Sequenze di particolare interesse sono presenti

nella regione precoce E6 - E7 di alcuni genotipi oncogeni.

Infatti queste sequenze codificano proteine in grado di interferire con l’attività di proteine espresse da geni cellulari oncosoppressori e questo può portare ad una proliferazione cellulare incontrollata e quindi può contribuire ad innescare la progressione neoplastica



In uno striscio cervico vaginale, l’aspetto morfologico specifico e patognomonico della presenza di HPV, si basa sulla presenza di cellule, definite COILOCITI, che rappresentano l’effetto citopatico più eclatante di una infezione virale produttiva.



L’altro aspetto tipico di questa infezione è rappresentato dalla presenza di cellule definite DISCHERATOCITI orangiofile isolate o più spesso in gruppi, con nucleo picnotico ingrandito ed irregolare.


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Donne NON gravide

Eseguire il prelievo per il pap-test prima di quello per il DNA Rimuovere l’eccesso di muco dall’orifizio cervicale o dall’ectocervice

circostante usando un tampone in cotone o dracon. Eliminare il tampone.

Inserire la spazzolina nell’orifizio cervicale ad una profondità di 1 - 1,5 cm fino a che i peli terminali più lunghi della spazzola toccano l’ectocervice, ruotarla compiendo 3 giri completi.

Introdurre la spazzola nel fondo della provetta da trasporto. Far

scattare il perno nel punto segnato e tappare ermeticamente. Prelevare il campione per il DNA prima di applicare acido acetico o

iodio.


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Donne gravide

Eseguire il prelievo per il pap-test prima di quello per il DNA Rimuovere il muco in eccesso dall’orifizio esterno del collo dell’utero,

usando uno dei due tamponi dracon forniti. Eliminare il tampone. Introdurre il tampone nel canale endocervicale e ruotarlo di 180° per 5

volte in direzione alternativamente opposta Ritirare il tampone delicatamente, evitando il contatto con la mucosa

vaginale. Introdurre il tampone nel fondo della provetta da trasporto. Far

scattare il perno nel punto segnato e tappare ermeticamente.



TRASPORTO DEI CAMPIONI

I campioni possono essere conservati fino a 2 settimane a temperatura ambiente


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Test: ibridazione in soluzione

Hybrid Capture II (HC II)

HPV basso rischio oncogeno: 6, 11, 42, 43, 44

HPV intermedio – alto rischio oncogeno: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68.


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare La tecnologia adottata utilizza una

micropiastra di ibridazione con segnale amplificato che utilizza la chemioluminiscenza per la rilevazione qualitativa.

La luce prodotta dalla reazione viene misurata mediante luminometro in unità di luce relativa (RLUs).


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare n. 341 donne con Pap-test anomalo:

- n. 145 HPV-DNA - (43%)

- n. 196 HPV-DNA + (57%)

- n. 129 Alto Rischio (66%)- n. 50 Alto/Basso R. (25%)- n. 17 Basso Rischio ( 9%)



- Pap-test anomalo

HPV-DNA+ HPV-DNA-

Ascus n.179 n. 84 (47%) n. 95 (53%)

L-SIL n.150 n.104(70%) n. 46 (30%)

H-SIL n. 12 n.12(100%) n. 0



n. 207 donne:

n. 100 follow-up (48%)

n. 61 casi clinici (30%)

n. 46 citologia negativa (22%)



n. 207 donne HPV-DNA+ HPV-DNA-

Follow-up

n.100

n. 26 (26%) n.74 (74%)

Casi clinici

n.61

n. 19 (31%) n. 42 (69%)

Citologia neg. n. 46

n. 4 ( 9%) n. 42 (91%)


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Citologia su strato sottile L’uso di metodiche di allestimento di

preparati citologici su strato sottile si sta diffondendo anche in Italia.

È importante verificare se questa nuova modalità di preparazione possa aumentare la sensibilità e specificità rispetto all’allestimento tradizionale.



Permette di ottenere preparati in strato sottile con un processo di filtrazione o sedimentazione

Riduce la percentuale di inadeguati rispetto al convenzionale

Migliora l’accuratezza Può essere successivamente utilizzata per

metodiche molecolari ( HPV)



Prelievo convenzionale

Oltre l’80% del campione viene scartato Cellule oscurate da sangue, muco e detriti Qualità variabile



Prelievo in fase liquida Il 100% del campione raccolto viene

trasferito nel flacone Il campione viene omogeneizzato e si

randomizzano le cellule Riduzione al minimo di elementi oscuranti Vetrino chiaro, uniforme e riproducibile


Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Nei primi anni 90 si è affermato in Europa

ed in Italia il primo sistema di lettura computer-assistita il cui principio di lettura, definito a “reti neurali”, si basava sulla selezione dal vetrino di una serie di immagini che erano presentate al lettore su uno schermo video. Tali immagini identificavano per ogni vetrino i campi più “atipici” che erano stati selezionati in base ad un confronto morfologico tra la memoria dello strumento ed i campioni esaminati.



Successivamente si è allestito uno strumento formato da un corpo centrale con obbiettivi e telecamere, per digitalizzare le immagini, che una serie di computer, e relativi software, analizzano con algoritmi.



Il sistema utilizza un microscopio ad alta velocità e un software che immagazzina e interpreta le immagini dello striscio in base a dei parametri (densità ottica, rapporto nucleo/citoplastico, ecc.) predeterminati. Ha lo scopo di individuare il carcinoma squamoso, l’adenocarcinoma e tutte le lesioni precancerose.



Recupero di falsi negativi nel controllo di qualità

Screening primario



1)Apertura di carico: tiene fino a 288 per 30 ore di lavoro

2)Sensore di contatto: verifica la presenza del vetrino

3)Lettore codice a barre: identifica il vetrino 4)Videomicroscopio ad alta velocità:

acquisisce rapidamente le immagini dal vetrino


SLIDE PROCESSOR

200 VETRINI IN 24 ORE


Copy service applicationCopy service application

PREP or Conventional SlidePREP or Conventional Slide

Slide ProcessorSlide Processor

SlideWizard FieldSlideWizard FieldRelocation and ReviewRelocation and Review

The AutoPap Primary Screening System


Slide wizard field relocation and review

Microscopio e computer. Rilettura dei Review. Mappatura di 15 campi più significativi.



No further review 25%



Review: 5 Ranks

Classificazione basata sul grado di probabilità di anormalità citologiche



5 (ranks) quintili

1-2 le categorie con maggiore probabilità di anomalia

3-4-5 minore rischio di anomalia

Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla...

Documents

Transcript of Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla...