Di Bonaventura - CI MED LAB - Lezioni 1-2 Diagnosi Inf Batt

MEDICINA DI LABORATORIO:

MICROBIOLOGIA CLINICA

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. D’Annunzio” di Chieti-Pescara

tel 0871 541519 (541509)

e-mail: [email protected]

LABORATORIO DI

MICROBIOLOGIA CLINICA

Compito principale della Microbiologia Clinica, nell’ambito

della Medicina di Laboratorio, è quello di porre diagnosi

eziologica, ossia identificare l’agente patogeno

responsabile di una malattia infettiva allo scopo di

suggerire un appropriato trattamento terapeutico.

Altri obiettivi sono:

- valutare l’efficacia della terapia

- valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte

di contagio in comunità)

Il Laboratorio di Microbiologia fornisce:

sostanziale supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione

della patologia da infezione, sia quella sostenuta da patogeni primari (in

soggetti normoreattivi) che quella sostenuta da patogeni opportunisti o

condizionati (in soggetti con difese compromesse)

Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive

Esigenza di utilizzare metodologie

scientificamente valide ed eseguibili in tempi

accettabili

Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla

terapia

La Qualità del servizio diagnostico dipenderà

dall’equilibrio:

Consapevolezza delle urgenti

necessità cliniche

Capacità tecniche

Risorse finanziarie disponibili

FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA

• Rappresenta un momento cruciale nell’ambito del

processo di Laboratorio, durante la quale si compie il

46% degli errori

• Rappresenta un fondamentale momento di

interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate

al processo

• Significa occuparsi di come il laboratorio è in grado di

rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge

FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA

1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami)

2. Informazione e Preparazione del Paziente

3. Raccolta del campione

4. Identificazione del campione

5. Trasporto del campione

FASE ANALITICA

Quali strumenti ci possono aiutare a gestire la qualità nella fase pre-analitica?

• Una richiesta congua rispetto al quesito diagnostico (scheda ottica, informazioni varie…..)

• Un campione appropriato alla richiesta e rappresentativo della patologia sulla quale si indaga

• La conformità del prodotto in entrata che si realizza attraverso l’uso di protocolli (istruzioni su esami effettuati, modalità di prelievo, trasporto e conservazione)

Appropriatezza della fase pre-analitica

L’appropriatezza di tutta la fase preanalitica si traduce in maggiore

qualità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell’operatore

Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diverso titolo

nell’indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato con la

decisione di richiedere le indagini fino al momento dell’utilizzo dei

referti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può

assicurare la piena valorizzazione dell’indagine microbiologica.

Responsabilità del Clinico

• Raccogliere il campione in maniera “corretta”

• Identificare adeguatamente il campione

• Compilare in maniera adeguata il modulo di richiesta

• Inoltrare tempestivamente il campione al Laboratorio o, qualora

non fosse possibile, conservarlo con modalità idonee

Responsabilità del Microbiologo Clinico

• Definire precise linee guida sulle modalità di prelievo,

conservazione e trasporto specifiche per ogni tipo di campione

• Monitorare la loro osservanza e applicazione

• Le tabelle di prelievo e di conservazione dei campioni per

indagini batteriologiche", devono essere utili ai fini di assicurare

la "qualità" dei campioni destinati ad indagini microbiologiche,

con l’obiettivo di qualificare l’indagine microbiologica e il suo

contributo alla cura del paziente.

• Tutti gli operatori assicurano comunque la loro disponibilità a

fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di volta in volta,

si dovessero rendere necessarie, in particolare per:

– indicazioni nella scelta delle indagini,

– modalità di raccolta,

– interpretazione dei risultati,

– informazioni epidemiologiche.

FASE PRE-ANALITICA

1. Richiesta degli esami di laboratorio

• Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica clinica.

• Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato.

• Nella pratica clinica è indispensabile procedere alla:

– inquadramento clinico-epidemiologico dell’infezione

– individuazione dell’organo o degli organi interessati

– formulazione del sospetto diagnostico

– scelta del materiale patologico da inviare al laboratorio

• La limitazione delle risorse economiche già condiziona e condizionerà sempre più in futuro gli interventi medici. Dunque, la valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere tenuta in sempre maggiore considerazione dal medico in ogni sua scelta ivi inclusa quella concernente il ricorso all’ausilio laboratoristico.

FASE PRE-ANALITICA

1. Richiesta degli esami di laboratorio

La richiesta di accertamenti microbiologici è giustificata:

• nella patologia infettiva ad etiologia definita, per diagnosi di forme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione della sensibilità ai farmaci.

• nelle sindromi polietiologiche, per indicazioni terapeutiche (sempre, se in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche).

• nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie).

• in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lo studio della circolazione dei microrganismi e la identificazione dei fattori di rischio, l’adozione di idonee misure preventive, la definizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.

Lo studio della Microbiologia Clinica deve

essere pertanto finalizzato alla:

• Acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialità diagnostiche del laboratorio di microbiologia e sulla possibilità che esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate strategie di prevenzione.

• Valutazione del ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella eziopatogenesi delle diverse malattie da infezione, della loro circolazione in situazioni ambientali differenti, della loro capacità di esibire resistenze ai farmaci antimicrobici, della circolazione - nelle popolazioni microbiche -dei determinanti genetici di resistenza, con acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una terapia ragionata che eviti, quando non richiesto, il ricorso al laboratorio diagnostico di microbiologia, o che comunque possa essere adottata in attesa delle sue risposte.

FASE PRE-ANALITICA

2. Informazione e preparazione del Paziente

Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette

modalità di prelievo, conservazione e trasporto del campione

biologico

Esempio:

Prelievo urine – tecnica del “mitto intermedio”

Prelievo dell’espettorato

FASE PRE-ANALITICA

3. Raccolta del campione clinico

Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare

la presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni

• Può essere prelevato da:

– siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor),

liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie

inferiori, urine, tessuti profondi)

• ogni isolamento ha significato eziologico

– siti “contaminati” da flora autoctona (bocca, naso, vie

respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale,

tratto genitale femminile, terzo distale dell’uretra, cute)

• i risultati vanno interpretati a seconda del caso

• necessaria una richiesta “mirata” del clinico, volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell’abbondante flora contaminante

• Ad ogni campione è associato un potenziale rischio biologico

per la salute degli operatori sanitari

Flora microbica “residente”

Tutte le superfici corporee “esposte” (a contatto con l’ambiente

circostante) (bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili,

uretra) sono colonizzate da una flora “autoctona”

• Svantaggi

– può contaminare i campioni

– può causare malattia

• Vantaggi

– è in grado di proteggere dalle

infezioni prevenendo la

colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni

(resistenza alla colonizzazione)

– la riduzione (o rimozione) della flora “normale” mediante impiego di

antibiotici può causare superinfezioni, generalmente sostenute da

microrganismi resistenti

Tipologie di campione clinico

• Campione prelevato da una zona in cui

coesistono patogeni e flora residente

(tampone)

• Campione INDIRETTO: prelevato previo

passaggio in una zona con flora residente

(lavaggio bronco-alveolare)

• Campione DIRETTO: il patogeno è

localizzato in un sito normalmente sterile

ed una barriera (la cute, generalmente)

deve essere superata per la sua raccolta

(liquor, ago-aspirato)

• Campioni INUTILI a fini diagnostici: non

vanno prelevati in quanto non forniscono

alcuna indicazione (vomito, aspirato

gastrico, contenuto intestinale, etc.)

INSERIRE FIG 1/TAB 3 PAG 41 (CEVENINI)

FASE PRE-ANALITICA


L’attendibilità dell’esame batteriologico dipende da vari fattori, tra i

quali molto importante è l’adeguata raccolta (appropriatezza)

del campione.

In particolare, il campione dovrebbe essere:

A. raccolto nel momento giusto;

B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della

patologia infettiva;

C. prelevato in quantità sufficiente da poter effettuare i tests

diagnostici necessari;

D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.

FASE PRE-ANALITICA


APPROPRIATEZZA del campione: “QUANDO”

A. Il campione dovrebbe essere prelevato nel momento giusto

– nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore)

– prima dell’inizio di una terapia antimicrobica, quando

possibile, o a distanza di almeno 48 h dalla sua sospensione

• gli antibiotici interferiscono con la crescita microbica e

influiscono sull’esito dei test di laboratorio per cui se non

è possibile interrompere il trattamento è necessario

segnalarlo al laboratorio, indicando anche lo schema

terapeutico.

FASE PRE-ANALITICA


APPROPRIATEZZA del campione: “DOVE”

B. Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo

rappresentativo dell’area infetta.

Esempio: La febbre tifoide ha un caratteristico decorso bimodale:

una fase precoce (1° e 2° settimana), caratterizzata da febbre e

costipazione, durante la quale la emocoltura è positiva nel 90-

100% dei casi, mentre la coprocoltura è frequentemente negativa;

una seconda fase (3° settimana), spesso diarroica, durante la

quale Salmonella typhi può essere isolata più frequentemente dalle

feci e con minore frequenza dal sangue.

Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia

naturale di questa malattia infettiva, suggerisce, pertanto, la ricerca

del microrganismo nel sangue durante la 1° e 2° settimana e nelle feci

nella 3° e 4° settimana.

FASE PRE-ANALITICA


APPROPRIATEZZA del campione: “QUANTO”

C. Il campione deve essere prelevato in quantità sufficiente per

poter effettuare i tests diagnostici necessari.

Esempio:

Le batteriemie sono generalmente pauciparassitemiche. La

sensibilità dell’esame emocolturale è, quindi, influenzata dalla

quantità del campione prelevato e dalla frequenza di prelievo (max

3 prelievi/die)

“… Two blood culture sets (10 mL in both aerobic and anerobic

bottles) before administration of antibiotics is 98% sensitive …”

(J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 657-661)

Nel tifo e nella brucellosi la batteriemia è continua e, quindi, il

momento del prelievo è meno critico

FASE PRE-ANALITICA


APPROPRIATEZZA del campione: “COME”

D. Il campione deve essere raccolto in maniera da evitare

contaminazioni

Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente

asettiche, altri microorganismi (flora “autoctona”) non responsabili della

patologia potrebbero contaminare i campioni e “falsare” così il risultato

delle indagini microbiologiche

Esempi:

- La ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un

tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l’orofaringe.

- Nella raccolta di un campione endometriale, si deve cercare di limitare la

contaminazione con la flora vaginale.

FASE PRE-ANALITICA

4. Identificazione del campione

Il contenitore deve essere opportunamente contrassegnato e

confezionato prima del suo trasporto.

I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con

l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnati

da un foglio di richiesta indicante:

– Identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso)

– Provenienza anatomica del campione

– Nominativo del prelevatore

– Data ed ora di campionamento (informazione critica !)

– Diagnosi clinica presuntiva

– (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso

FASE PRE-ANALITICA


Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il

campione deve essere trasportato:

in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle

indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal

campione;

rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione

della vitalità dei microrganismi in esso presenti;

in adeguati terreni di trasporto, se necessario (es. tamponi), al fine di

mantenere inalterata la “facies” microbica del campione, conservandone le

caratteristiche possedute al momento del prelievo;

Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati)

a temperatura “controllata”:generalmente a +4 C, occasionalmente a

temperatura ambiente

Trasporto in sistemi “dedicati”, come nel caso della ricerca di

germi anaerobi

FASE PRE-ANALITICA


L’invio deve inoltre avvenire garantendo la sicurezza nel trasporto

e l’isolamento del campione, per evitare dispersione del materiale

biologico e l’eventuale contaminazione di altri materiali, di

attrezzature e del personale che dovrà manipolare il campione

stesso

– trasportare il campione nelle apposite buste di plastica a due

scomparti: uno per il campione biologico, l’altro per il modulo di

richiesta debitamente compilato

Nel caso in cui fosse impossibile inviare immediatamente il

campione al Laboratorio, la conservazione dello stesso deve

avvenire secondo le indicazioni fornite dal Microbiologo:

– Ad esempio: feci e urine (+4°C per max 6-8 ore)

Qualora ci fosse la necessità di inviare campioni in orario diverso,

è bene prendere accordi con il Laboratorio prima della sua raccolta

ed invio

Criteri per definire un campione “non

idoneo” per una diagnosi microbiologica (non conformità nella fase pre-analitica)

Campione non identificabile:

Modulo di richiesta esame mancante od incompleto

Contenitore impropriamente identificato od anonimo

Campione contaminato da flora orofaringea

Impropria conservazione e/o trasporto (tempo, temperatura,

contenitore)

contenitore non sterile

contenitore non perfettamente chiuso o danneggiato (rischio

biologico per tutti gli operatori: per chi preleva, chi trasporta e chi

analizza il materiale)

trasporto ritardato (urine: > 1h a RT; campioni per gonorrea: >1h

non in terreno di trasporto)

Campione inviato in quantità insufficiente (ricerca micobatteri) o non

idoneo (prelevato in paziente antibiotizzato; saliva vs escreato)

Riflessioni … sulla fase pre-analitica

Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami

di laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che

nella capacità di attenersi a quella serie di norme che permettono di

ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle

analisi.

Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del

microorganismo responsabile dell’infezione.

Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie

quelli resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente

ad incrementare l'incidenza delle infezioni nosocomiali.

Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e più

rapido.

In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica

sono responsabili della qualità del percorso diagnostico del

paziente … almeno fino all’arrivo del campione in Laboratorio !

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA


DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agentepatogeno mediante:

A. Esame microscopico (batterioscopico)

B. Esame colturale (isolamento)

C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico

• Campioni “a fresco” oppure fissati (al calore o chimicamente)

• La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente:

– microscopia in campo oscuro • il condensatore illumina obliquamente l’oggetto in modo che le

strutture cellulari riflettano la luce verso l’occhio dell’operatore, a differenza dell’ambiente circostante. Ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide.

– microscopia in contrasto di fase • Le differenze nell’indice di rifrazione nei campioni sono convertite in

differenze nella intensità della luce nell’immagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni non colorati (funghi e parassiti, ma anche batteri).

– microscopia in fluorescenza• le molecole fluorescenti assorbono luce ad una e la riemettono ad

una più lunga. Tale differenza viene rilevata dall’impiego di filtri. Utile per l’identificazione di batteri e funghi.

• Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate”

– Gram, alcool-acido resistenza (Ziehl Nielsen)

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico (“a fresco”)

Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente

colorabili con le tecniche disponibili, evidenziabili invece in

campo oscuro:

– ricerca di Spirochete (Treponema, Borrelia)

– ricerca di Leptospire

Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico (previa colorazione)

• Campioni fissati (al calore o chimicamente)

• Fornisce indicazioni riguardo:

– Idoneità del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose)

– Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili

– Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)

• Colorazione del campione con tecnica di Gram:

– morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata)

– disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)

– quantità assoluta di batteri presenti

– percentuale relativa di Gram+ e Gram-

– localizzazione in sede intra- od extra-cellulare

• Specifiche colorazioni:

• colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)

• verde malachite (endospore batteriche)

• colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina)

• colorazione di Leifson (flagelli)

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico previa colorazione

Colorazioni SEMPLICI, che prevedono l’impiego di un solocolorante:

– cristalvioletto

– fucsina basica

– blu di metilene

Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono l’impiego dipiù di un colorante:

– Colorazione di Gram

– Colorazione di Ziehl-Neelsen

Le colorazioni in microbiologiaAllestimento di un preparato (fissazione) (1 di 2)

Partendo da una sospensione batterica (brodocoltura) centro di un vetrino pulito

Se si preleva il materiale (colonie) da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di soluzione tampone (PBS) al campione

La fissazione garantisce che: i) il materiale venga

disteso ed essiccato non venga allontanato dal

vetrino nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule

vengano uccise per coagulazione (sicurezza

biologica e maggiore penetrazione ai coloranti)

Le colorazioni in microbiologiaAllestimento di un preparato (fissazione) (2 di 2)

Aiutandosi con un’ansa, stemperare il campione nel tampone/brodo e stenderlo fino a coprire circa la metà della superficie del vetrino (preparazione dello smear)

Lasciare essiccare il preparato all’aria o forzatamente (bunsen).

Fissare il preparato esponendo il vetrino (lato non contenente il campione) per 4-5 volte direttamente alla fiamma

Hans Christian Joachim Gram

Nato a Copenhagen il

13 Settembre1853.

Batteriologo danese. Nel

1884 mise a punto la

colorazione omonima nel

tentativo di differenziare

Klebsiella pneumoniae

dagli pneumococchi

Colorazione di GramTecnica

1. Fissare gli strisci al calore

2. Coprire con cristalvioletto per 1-2 min

3. Lavare con acqua. Non asciugare

4. Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min


6. Decolorare per 10 sec con alcool-acetone


8. Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min

9. Lavare con acqua e lasciare asciugare

Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all’interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene “catturato” dalla parete cellulare.

Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

Colorazione di GramPrincipio

I batteri Gram+ (Staphylococcusspp, Streptococcus spp, etc) appaiono colorati in blu

(Staphylococcus epidermidis)

I batteri Gram- (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) appaiono colorati in rosso

(Escherichia coli)

Colorazione di GramOsservazione microscopica

Batteri Gram+ possono apparire come Gram- in presenza di colture vecchie, quando morti, od in presenza di danni alla parete per azione di antibiotici

Trichomonas vaginalis (protozoo) è Gram+

Candida albicans (lievito), Aspergillus fumigatus (muffa) sono Gram+

Occasionalmente, anche Mycobacterium tuberculosis è Gram+ (oppure Gram-variabile)

Colorazione di GramCasi particolari

Idoneità del campione da sottoporre a coltura

Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)

meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene

Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione “non routinarie”

anaerobi, funghi

Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale

angina di Vincent (spirochete, fusobatteri)

paziente antibiotizzato

Informazioni sulla natura dell’infezione

infezioni poli/mono-microbiche

Colorazione di GramUtilità clinica (1 di 2)

Quindi:

La conoscenza del risultato di una colorazione di Gram può salvare una vita !

Tuttavia:

La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quella commensale

La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:

Legionella spp. (immunofluorescenza)

bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-Neelsen)

Colorazione di GramUtilità clinica (2 di 2)

Colorazione di GramL’eccezione

La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i

batteri.

Mycobacterium tuberculosis, M. leprae

incapacità di colorare la cellula per la natura

“cerosa” dell’involucro esterno, altamente

impermeabile ai coloranti

colorazione di Ziehl-Nielsen

Mycobacterium spp.Parete cellulare

Composizione: Grosse quantità di glicolipidi:

acido micolico (60%)

complessi lipidi-arabinogalattani

lipoarabinomannani

Scarso petidoglicano

Funzioni: Condiziona la forma e previene la lisi osmotica

(peptidoglicano)

Inibisce ingresso composti chimici crescita lenta

maggiore resistenza agli agenti chimici

maggiore resistenza alla fagocitosi

Mediante l’acido micolico, induce la sintesi di citochine (TNF- )

Colorazioni:

Ziehl-Neelsen, Kinyoun

Step 1:

versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo)

Step 2:

fare evaporare il colorante

alla fiamma per 5 min

lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2)

Step 3:

Decolorare (2 min, circa) con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante

Lavare con acqua

Step 4:

Contrastare con blu di metileneper 1-2 min

Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2)

Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono

colorati in rosso

Gli organismi non acido-resistenti risulteranno

colorati in blu

Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione microscopica

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazioni speciali

La colorazione negativa consiste nella

colorazione di sottofondo con un colorante acido

(nero nigrosina). Viene usata quando un

organismo od una sua struttura non viene colorata

facilmente (esempio, la capsula).

La colorazione delle spore richiede calore per

facilitare la penetrazione del colorante (verde di

malachite, fucsina fenicata) attraverso gli

involucri sporali.

La colorazione dei flagelli impiega un

mordenzante (precipitazione dei sali dell’acido

tannico) per evidenziare la struttura flagellare

altrimenti invisibile (d: 12-30 nm)

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di flagelli

Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori

(da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)

Diagnosi DIRETTA

A. Esame microscopico

Le informazioni desunte dall’esame microscopico possono

consentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultano

importanti per orientare l’iter diagnostico (es. scelta dei terreni

colturali per l’isolamento)

TUTTAVIA:

L’esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche

qualora si esamini:

– un materiale normalmente sterile o comunque proveniente

da zone non in comunicazione con l’esterno (liquido cefalo-

rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale

purulento proveniente da raccolte chiuse)

– un materiale nella cui popolazione batterica “normale” non

siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o

tintoriali del batterio osservato


DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agentepatogeno mediante:

A. Esame microscopico (batterioscopico)


C. Ricerca di antigeni

D. Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi DIRETTA


Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in

sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura.

I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico:

• LIQUIDI (brodo). Composizione del brodo “normale”:

• peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5%

• estratto di carne 0,3%

• NaCl (per rendere isotonico il terreno)

• tampone fosfato (PBS; pH 7,0)

• H2O

• SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). L’agar:

• polisaccaride acido (70% agarosio, 30% agaropectina) estratto da

alghe rosse del genere Gelidium

• addizionato al brodo in quantità pari a 1,5-2%

• liquido a temperature 80 C, gelifica a 42-47 C

• non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri

Diagnosi DIRETTA


I terreni di coltura si distinguono in base allo stato chimico:

• Composizione DEFINITA:

• molto costosi, utilizzati esclusivamente per l’identificazione

di batteri con particolari esigenze nutrizionali

• Composizione INDEFINITA:

• contengono sostanze naturali quali peptone, siero, liquido

ascitico, sangue, estratto di lievito etc.

TERRENI DI COLTURA

Terreni minimi

Contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali

inorganici, aggiunti in concentrazione nota

Terreni di arricchimento

Caratterizzati dall’aggiunta di:

• sangue

• siero

• estratto di lievito

• infusi di cuore e cervello

• carboidrati

• amminoacidi

Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeniparticolarmente “esigenti” dal punto di vista nutritivo

TERRENI DI COLTURA

Terreni selettivi

Contengono agenti selettivi quali:

• coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica)

• antibiotici, con attività batteriostatica/battericida nei confronti dei

microrganismi “contaminanti” (flora autoctona)

Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si

isolano in campioni contaminati da flora microbica residente

(cute, faringe, naso, intestino, vagina)

TERRENI DI COLTURA

Terreni differenziali

• Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH (rosso fenolo, blu

di bromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado

di fermentare specifici carboidrati, in base alla colorazione delle colonie

e alla loro morfologia. Esempio: agar sale mannite o terreno di Chapman.

• Contengono sangue (5%, di montone o di cavallo) utilizzato perevidenziare la capacità emolitica di alcuni batteri:

α-emolisi = emolisi parziale, con formazione di un alone verdeintorno alla colonia (degradazione di bilirubina a biliverdina)

β-emolisi = emolisi completa, con formazione di un alonetrasparente intorno alla colonia

γ-emolisi = mancanza di emolisi

TERRENI DI COLTURA

Terreni differenziali

Mannitol Salt Agar (agar sale-mannite, Chapman

agar): terreno selettivo (per gli stafilococchi) e

differenziale (S. aureus fermentante vs

Staphylococcus spp non fermentanti).

Agar sangue (5% sangue di montone) (sheep

blood agar, SBA): evidente β-emolisi.

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica; R. Cevenini, V.Sambri ; Piccin

FATTORI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA BATTERICA

TEMPERATURA

• Psicrofili -10°C a +20°C (L. monocytogenes, 5-8°C)

• Mesofili +10 a +50 C

• Termofili +40 a +70 C


CRESCITA BATTERICA

OSSIGENO

Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico

Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie

Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico

Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di

ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO2

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA

BATTERICA

Aerobiobbligati

Aerobi facoltativi

Anaerobi obbligati

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

OSSIGENO

CRESCITA IN ANAEROBIOSI

I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,

depositandosi sul fondo come sedimento.

Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali.

Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici

(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno

atmosferico fino ad esaurirlo.

Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche

(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono

umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa

dell’ossigeno.

Crescita in anaerobiosi

Figure 6.5

Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara per anaerobiosi


CRESCITA BATTERICA

pH

– Acidofili:

• crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)

• funghi e lieviti (pH 5 - 6)

– Neutrofili:

• crescono tra pH 6 – 8

• maggior parte dei batteri

– Alcalofili:

• crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)


CRESCITA BATTERICA

PRESSIONE OSMOTICA

I microrganismi replicano generalmente meglio in un

terreno con concentrazione osmotica più bassa della

propria, in quanto questa condizione permette la

penetrazione dell’acqua all’interno della cellula.

La pressione osmotica del terreno può essere modificata in

base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio

Alofili: crescono ad elevate [saline]

(generalmente 1 M), tollerando elevate

pressioni osmotiche (es. stafilococchi)

CRESCITA BATTERICA

IN TERRENO LIQUIDO

Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione

nell’ordine dei 40-60 min. In particolare:

• Escherichia coli (in vitro) 20-30 min

• Escherichia coli (in vivo) 12 ore

• Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 ore

• Treponema pallidum (in vitro) 33 ore

ISOLAMENTO BATTERICO

E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del campione:

• pus

• liquido cefalo rachidiano

• sangue

generalmente contengono un solo tipo di microrganismo

• materiale fecale

• tamponi oro-faringei

• altri materiali biologici

generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al

patogeno o ai patogeni responsabili dell’infezione

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE

TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN

SUPERFICIE

• Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri

• Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare

al margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo

con soluzione fisiologica o brodo sterile)

• Mediante l’utilizzo di una spatola o di un’ansa, distribuire il

materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la

formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e

colonie isolate nell’ultimo tratto

• Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una colonia

isolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed

allestire una coltura pura

Tecnica di semina per isolamento

Semina per isolamento


DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terrenisolidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate siprocede alla identificazione:

• ID PRESUNTIVA

– caratteri microscopici» colorazioni (forma, organizzazione)

– caratteri macroscopici» aspetto coloniale

• ID FINALE (DEFINITIVA)

– biochimica

– immunologica

– molecolare

ID “presuntiva” dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)

Forma Rilievo

piatto

sopraelevato

convesso

umbonato

sottile, allungatoeffusopuntiforme

circolare

filamentosa

rizoide

irregolare

d < 1 mm

irregolare, a filo intrecciato

irregolare, ramificata

ID “presuntiva” dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)

Superficie Margine

intero

ondulato

eroso

filamentoso

arricciato

liscia

radiata

rugosa

concentrica

rilevata ondulata

anelli concentrici

raggrinzita

Aspetto macroscopico coloniale:

diversi fenotipi

DIAGNOSI DIRETTA

Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram

Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale

emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.

crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche

4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)

5. Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

La determinazione di “specie” si basa sulla capacità delmicrorganismo in esame di:

– metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per viafermentativa (via anaerobica)

– produrre specifici enzimi

– produrre specifici prodotti metabolici

Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.

Identificazione possibile in tempi rapidi (4 - 6 h).

ID BIOCHIMICAMetodo manuale: API (BioMérieux) Identification System

Anaerobes (Rapid ID 32 A)

Enterobacteriaceae (ID 32 E)

Gram Negative Rods (ID32 GN)

Staphylococci (ID32 STAPH )

Streptococci (Rapid ID32 STREP)

Yeasts (ID32 C)

La fermentazione degli zuccheri e l’utilizzazione di

altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.) viene

evidenziata da un indicatore di pH responsabile

della reazione colorimetrica.

ID BIOCHIMICAMetodo automatizzato: VITEK (BioMérieux)

Gram-positives (GP)

Gram-negatives (GN)

Yeasts (YST)

Bacillus spp. (BCL)

Anaerobes, Corynebacterium (ANC)

Neisseria, Haemophilus (NH)

Due tipologie di card: per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati biochimici in

forma disidratata) e l’antibiogramma.

Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di omissione o di errore.

Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale.

Possibilità di generare reports statistici epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze)

Identificazione batterica:Flow charts contenenti dati derivanti dall’osservazione

Gram e dai tests biochimici importanti nella

identificazione di specie.


1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram

Colorazione di Ziehl-Neelsen







IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA

Ha come obiettivo finale quello di ricerca ANTIGENI microbicidirettamente nel campione biologico esaminato.

Le tecniche di identificazione sierologica che prevedono l’impiego dianticorpi comprendono:

A. Reazione di agglutinazione

B. Reazione di immunofluorescenza

C. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA)

D. Western blot

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICAA. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE

Agglutinazione su vetrino

Prevede l’impiego di anticorpi, ottenuti in un animale

immunizzato, messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni

solubili

Agglutinazione al lattice (AL)

Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della

capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in

grado di legare gli anticorpi in più punti. Per il test si utilizzano

anticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in

fase solida).

Tecniche immunologiche rapide vengono frequentemente

utilizzate per la ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H.

influenzae, E. coli, N. meningitidis) nel liquor (o sul suo

centrifugato).

Un campione di fluido cerebrospinale viene

sottoposto a ricerca di Haemophilus

influenzae. Il campione viene mescolato con

una sospensione di particelle di lattice

ricoperte di anticorpi specifici, diretti contro la

capsula di H. influenzae. L’interazione tra

antigene e anticorpi causa un’immediata

agglutinazione di particelle (epifenomeno)

visibile ad occhio nudo.negativo positivo

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

Il fluorocromo (ad es. fluoresceina) che quando viene eccitato da una

luce ad una certa lunghezza d’onda (UV) emette una luce ad una

lunghezza d’onda maggiore (nel visibile).

I fluorocromi possono essere legati ad anticorpi modificando la loro capacità di legarsi ad uno specifico antigene:

• Anticorpi monoclonali (MAb)

– Prodotti da cellule di ibridoma

– Riconoscono un singolo epitopo

• Due tipi di immunofluorescenza: diretta e indiretta

Il limite della tecnica è rappresentato dalla

necessità di una adeguata consistenza

(concentrazione) del batterio ricercato.

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, che

sia specifico per l’antigene in esame.

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma non

coniugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugato

e diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della specie

in cui è stato prodotto il primo anticorpo.

Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpi

diretti contro entrambi. Nel test diretto, l’anticorpo marcato con colorante fluorescente è applicato su una

sezione di tessuto contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in eccesso viene lavato e l’anticorpo rimasto

legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto, l’antigene è rilevato

mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con una

sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è umano, il secondo anticorpo sarà un

anticorpo contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana).

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

A) Treponema pallidum; B) Chlamydia trachomatis; C) Helicobacter pylori

A B

C

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA C. TEST IMMUNOENZIMATICO

(ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay)

Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpispecifici contro l’antigene.

Si aggiunge l’antigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anch’essicontro l’antigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima(perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi) (sandwich ELISA)

La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso lavalutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversioneenzimatica del relativo substrato cromogeno.

La reale concentrazione dell’antigene viene determinata per confronto condiluizioni standard dell’antigene stesso.

ELISA test

Saggio immunologico su fase solida (test immunoenzimatico, ELISA).

(a) L’antigene test e’ aggiunto all’anticorpo-1 in fase solida ed il legame e’ evidenziato

aggiungendo un secondo anticorpo marcato con l’enzima e valutando l’enzima legato (ad

esempio perossidasi o fosfatasi alcalina) attraverso una reazione colorimetrica o

luminometrica. (b) L’anticorpo da saggiare viene aggiunto all’antigene in fase solida ed e’

rilevato aggiungendo un’anti-immunoglobulina marcata con enzima che usa un’anti-

immunoglobulina fluorescente per rilevare l’anticorpo legato.

Il marcatore nei saggi ELISA può essere una sonda fluorescente piuttosto che un enzima.

ELISA test

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA D. WESTERN BLOT

– Separazione degli antigeni su gel di poliacrilammide in

base al peso molecolare (elettroforesi)

– Trasferimento degli antigeni (bande elettroforetiche) su

membrana di nitrocellulosa

– Incubazione degli antigeni con l’anticorpo specifico

– Esposizione ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo

primario) marcato con un enzima (perossidasi)

– La formazione di immunocomplessi (e quindi la

presenza dell’antigene ricercato) viene evidenziata

dall’aggiunta di un substrato sul quale agisce l’enzima,

che provoca la precipitazione di colorante

Western blot


1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) colorazione di Gram

colorazione di Ziehl-Neelsen







Tests molecolari

• Le biotecnologie hanno fornito strumenti diagnostici

molto potenti per:

– la ricerca rapida e l’identificazione di patogeni

umani

– la tipizzazione dei microrganismi a fini

epidemiologici

– la ricerca di microrganismi non coltivabili oppure a

lenta crescita

– la determinazione dell’antibiotico-sensibilità

– l’indagine diagnostica su campioni negativi

all’esame colturale

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:

SONDE MOLECOLARI

Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico

patogeno

Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione

(ibridazione), indicando la presenza del patogeno

Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi nucleici (elevata sensibilità)

La reazione di ibridazione può essere condotta su diverse tipologie di campioni:

– colonie batteriche

– preparazioni di DNA purificato

– campioni clinici

<La digestione del DNA per mezzo di

enzimi di restrizione, seguita da

ibridazione con differenti sonde

geniche genera patterns specie-

specifici (ossia caratteristici di una

specie microbica).

Principali tecniche di ibridazione

degli acidi nucleici

Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un

supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica

sonda a DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione

(dot blot). In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono

essere separati attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti

su membrane per l’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si

utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla di Northern blot.


DIAGNOSI DIRETTA: ANTIBIOGRAMMA

Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, siprocede alla determinazione della sensibilità/resistenzadell’isolato agli antibiotici (antibiogramma).

Tests di antibiotico-sensibilità

Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.

I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.

I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati.

I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza professionale.

• MIC (Concentrazione Minima Inibente) è unamisura quantitativa dell’attività di un antibioticoverso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in gradodi inibire la crescita batterica visibile.

• NCCLS (National Committee for ClinicalLaboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative).

• Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)

Tests di antibiotico-sensibilità Definizioni

Interpretazione dei risultati

BREAKPOINTS

I breakpoints vengono individuati dalla NCCLS in base a:

– Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti)

dall’antibiotico

– Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in

vivo (risoluzione del caso clinico)

Sensibilità

Una infezione sostenuta dal ceppo batterico isolato può essere

trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell’antibiotico

testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica.

Sensibilità Intermedia

Gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e

tessutali di antibiotico per i quali l’efficacia potrebbe essere più

bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. Questa

categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli

antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinoloni nelle

urine) o quando l’antibiotico può essere utilizzato a

concentrazioni più alte di quelle normali ( -lattamici).

Resistenza

Questa categoria predice il possibile fallimento dell’antibiotico

testato. I ceppi resistenti non sono inibiti dalle normali

concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo dall’antibiotico in

seguito a somministrazione di dosi normali.

Tecniche per la determinazione

in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)

• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

• Agar diluizione

• Sistemi Automatizzati

ANTIBIOGRAMMAMetodo della brodo diluizione

• Preparare una soluzione madre di antibiotico

• Allestire diluizioni seriali 2-fold dell’antibiotico in brodo Mueller-Hinton

• Preparare un inoculo a DO uguale a 0.125 (0.5 McFarland)

• Seminare ogni diluizione di antibiotico con l’inoculostandardizzato

• Incubare a 37 C per 16-18 ore

• Seminare un pozzetto “controllo” (senza antibiotico)

MC-FARLAND

STANDARDS

• La scala degli standards di Mc-Farland è rappresentata da una serie

di fiale contenenti BaSO4, di opacità differenti, che permettono la

valutazione della densità delle sospensioni batteriche

• La densità di una sospensione batterica è valutata per confronto con

una sospensione di opacità nota contenuta in una fiala dello stesso

diametro

MC-FARLAND

STANDARD

1 La concentrazione batterica varia secondo le dimensioni dei

microrganismi2 I valori corrispondono alle densità ottiche delle sospensioni batteriche

e non a quelle delle particelle di BaSO4

Standard

Concentrazione

batterica 1

x 106

Densità ottica

teorica 2

a 550 nm

0.5

1

2

3

4

5

150

300

600

900

1200

1500

0.125

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Minima Concentrazione Inibente (MIC)

Minima Concentrazione Battericida (MBC).

Brodo diluizioneNCCLS-breakpoints

Piperacillina 16 32-64 128

Cefazolina 8 16 32

Cefotaxime 8 16-32 64

Cefpodoxime 2 4 8

Imipenem 4 8 16

Vancomicina 4 8-16 32

Gentamicina 4 8 16

ANTIBIOTICO S I R

S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza

Tecniche per la determinazione

in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)

• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

• Agar diluizione

• Sistemi Automatizzati

ANTIBIOGRAMMATecnica di Kirby-Bauer

• Sospendere 4-5 colonie in 4 ml di brodo

• Incubare a 37 C per 18 ore

• Immergere un tampone nella brodocoltura e scaricarlo contro la paretedella provetta

• Strisciare il tampone sulla piastra in modo uniforme ruotando la piastradi 60

• Applicare i dischi a distanza maggiore di 25 mm dal bordo della piastrae ad distanza tra i centri dei dischi non inferiore a 24 mm

• Capovolgere la piastra ed incubarla a 37 C per 16-18 ore

• Misurare gli aloni di inibizione

Diffusione in agar

(Kirby-Bauer)

1. Allestimento brodocoltura

da coltura pura

2. Semina brodocoltura

3. Apposizione dischetti

antibiotizzati

4. Incubazione (37°C, 18-24h)

5. Misurazione diametro alone

di inibizione

1

2

3

4

5

Diffusione in agar Risultati

Attività battericida di un antibiotico

• Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi

• Focolaio di infezione situato in distretti anatomici

difficilmente accessibili all’antibiotico

• Concentrazione Minima Battericida (MBC):

La più bassa concentrazione di antibiotico in grado di

inibire la crescita batterica di almeno il 99.9% (1

germe su 1.000 elude l’azione antibiotica) della

popolazione iniziale.

Minima Concentrazione Inibente (MIC)

Minima Concentrazione Battericida (MBC).

MIC/MBC test

(Brodo diluizione)

MBC/MIC – killing quotient

Tasso di uccisione = MBC / MIC

1-4 per antibiotici battericidi

(beta-lattamici, chinoloni)

>4 per antibiotici batteriostatici

(sulfamidici, tetracicline)


DIAGNOSI INDIRETTA = volta a rilevare una risposta immuneumorale specifica dell’ospite all’agente infettivo:

A. Reazione di fissazione del Complemento

B. Reazione di agglutinazione

C. Test immunoenzimatico (ELISA)

D. Saggio in immunofluorescenza

E. Saggio radioimmunologico

Diagnosi INDIRETTA

• La diagnosi INDIRETTA è, ovviamente, più tardiva di quella

DIRETTA in quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando

si sia sviluppata già la reattività immunitaria dell’ospite. Ciò

non è sempre possibile, come nel caso di pazienti anergici.

• Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico,

pertanto, soltanto quando l’isolamento del microrganismo

sia difficoltoso, fallito, o non possibile.

• L’accertamento indiretto non comportando l’isolamento del

germe, preclude la possibilità di saggiare la sensibilità

dell’agente etiologico verso i farmaci antimicrobici.

Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

PRINCIPIO: capacità del Complemento di legarsi agli immunocomplessi

METODICA:

- il siero del paziente viene “scomplementato” (privato del Complemento) (30 min, 56 C)

- il siero (diluizioni del-) inattivato viene cimentato con l’antigene , in presenza di Complemento “fresco” (di coniglio) aggiunto in quantità nota

- se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all’antigene ed il Complemento si lega all’immunocomplesso.

- si aggiunge, quindi, un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-eritrociti di montone):

• se il siero del paziente è positivo (cioè contiene anticorpi control’antigene) gli eritrociti rimangono integri, in quanto il Complemento siè legato al primo immunocomplesso

• se il siero del paziente è negativo (cioè non contiene anticorpi control’antigene) gli eritrociti vengono lisati, in quanto il Complemento si legaall’immunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita

La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina

Un classico esempio applicativo della FC è la reazione di Wassermann, per la diagnosi di sifilide

Nella reazione FC la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa, l’assenza di lisi e’ un

test positivo per la presenza di anticorpi.

Questa figura mostra una reazione FC per evidenziare anticorpi verso Coxiella burnetii (agente

eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase

acuta, il complemento e’ stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dell’anticorpo e’ 1/32),

mentre con il siero convalescente nella seconda linea non c’e’ lisi dei globuli rossi per tutte le

diluizioni di siero e quindi il titolo dell’anticorpo e’ uguale o maggiore di 1/512. Questo dimostra

che un aumento di 4 volte nel titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza e’ indicativo

dell’infezione da Coxiella burnetii.


Diagnosi INDIRETTA

B. TEST DI AGGLUTINAZIONE

• L’antigene corpuscolato consiste di una sospensione

di microrganismi, celule (emazie) o particelle uniformi

(lattice) sulle quali siano adsorbiti gli antigeni

• Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono cimentate

con una quantità fissa di antigene

• In presenza di siero positivo, ossia contenete gli

anticorpi specifici, si formano aggregati di complessi

immuni che risultano visibili

Diagnosi INDIRETTA

B. TEST DI AGGLUTINAZIONE

Titolo anticorpale = reciproco della più

alta diluizione positiva all’agglutinazione

Diagnosi INDIRETTA

C. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IF INDIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto ed il siero,

opportunamente diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.

Successivamente si aggiungono anticorpi anti-immunoglobuline umane,

prodotti in animali e coniugati con isotiocianato di fluoresceina.

IF DIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto marcato con un

fluorocromo (isotiocianato di fluorescina) ed il siero, opportunamente

diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.

Se il campione è positivo, all’osservazione al microscopia a fluorescenza

esso risulterà fluorescente grazie alla formazione dell’immunocomplesso

marcato (fluorocromo associato all’antigene).

D. Test immunoenzimatico (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)

Si impiega l’antigene fissato su una superficie di plastica (piastra)per catturare e separare l’anticorpo specifico dagli altri anticorpipresenti nel siero del paziente.

L’anticorpo fissato viene poi evidenziato da un anticorpo anti-IgGumane legato covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasialcalina, -galattosidasi).

La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche,attraverso la valutazione dell’intensità del colore prodotto inrisposta alla conversione enzimatica del relativo substratocromogeno.

La reale concentrazione dell’anticorpo viene determinata perconfronto con diluizioni standard dell’anticorpo stesso

E. SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO

(Radioimmunoassay, RIA)

• Marcatura dell’anticorpo (antigene)

• Rivelazione del corrispondente antigene

(anticorpo)

• Competizione tra molecole marcate e non-

– Un antigene purificato marcato con un

radioisotopo compete con un antigene

standard non marcato per il legame con

l’anticorpo

• Viene misurata la quantità di radioattività

associata all’anticorpo

Di Bonaventura - CI MED LAB - Lezioni 1-2 Diagnosi Inf Batt

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