Determinación de la Ig E Específica en el Laboratorio

Carlos Artaza ÁlvarezMIR 1 F.H.Alcorcón

INTRODUCCION

• El sistema inmunológico se caracteriza por reconocer sustancias extrañas (Ag) y generar una respuesta para eliminarlas.

• En las alergias esta respuesta es excesiva y finalmente produce daño en los tejidos.

• Intervienen elementos genéticos, celulares y moleculares

SISTEMA INMUNOLOGICO

• Contacto inicial con el alergeno en un individuo predispuesto: producción de IgE que se fija a mastocitos y basófilos (sensibilización).

• Un segundo contacto con alergeno produce degranulación y liberación de sustancias vasoactivas

REACCIREACCIÓÓN DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO IN DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO I1ª EXPOSICIÓN A UN ALERGENO

FIJACIÓN A RECEPTORES DE MEMBRANA DE MASTOCITO

UNIÓN DE ALERGENO A IgE ESPECIFICA EN LA SUPERFICIE DEL MASTOCITO

LIBERACIÓN DE HISTAMINA Y OTROS MEDIADORES

MANIFESTACIONES CLMANIFESTACIONES CLÍÍNICASNICAS

PRODUCCIÓN DE GRAN CANTIDAD DE IgE ESPECIFICA

PREDISPOSICIÓN GENETICA

2ª EXPOSICIÓN A ALERGENO

. HISTORIACLINICA- Exploración física

. Pruebas objetivas de sensibilidad a la IgE:- Pruebas cutáneas- Determinación SIgE

Diagnóstico de la Alergia mediada por IgE

Peculiaridades de la IgE

-Permite detectar la sensibilización de un paciente frente a un alergeno determinado

-Baja concentración sérica: aguja en un pajar

Propiedades Inmunológicas de las Inmunoglobulinas

225621Vida Media (días)

0,40,0026,72433Cantidad sintetizada (mg/Kg/día)

0,050,0590170820Concentración Sérica (mg/dl)

IgDIgEIgMIgAIgG

Detección de IgE: ensayo óptimo

- Capacidad de detectar bajas concentraciones (UI = 2.4 ng)

- Ausencia de reactividad cruzada:ni con otras Igs (IgG, IgM, IgA,…)ni con otros alergenos no homólogos

- No interferencia con bilirrubina, Hb, lípidos…

- Calibración estable, con amplio rango de medida

- Precisión: CV intras. <10%, CV inters. <15%

Detección de IgE: ensayo óptimo

• Altamente Sensible: “Detectar” pacientes con niveles IgE ↑

• Altamente Especifico: Excluir los no sensibilizados

• Calidad analítica: fiabilidad, estabilidad, reproducibilidad• Estandarización (OMS)• Reproducible (baja variación en la repetición de una

medida)• Automatización: flexible, fácil manipulación.• Amplio menú de alergenos

INMUNOENSAYOS

Inmunoensayo: reacción Ag-Ac

Alergeno IgE

Pilar del diagnóstico “in vitro” en el laboratorio de alergia: detección de IgE específica.

INMUNOENSAYOS:CONCEPTOSBASICOS

• Complejo Ag-Ac: Sistema en equilibrio• Ag + Ac Ag-Ac• Afinidad• Heterogeneidad de la respuesta• Avidez• Reactividad cruzada

INMUNOENSAYOS MARCADOS: GENERALIDADES

• Inmunoensayos en los que el Ag o Ac están marcados

• Rápidos, menos de 24 h.• Alta sensibilidad, de microgramos a

nanogramos.• Automatizables, aplicaciones• Clasificación:

» Homogéneos» Heterogéneos» Competitivos» No competitivos

Inmunoensayos Marcados

Tipos

Inmunoensayos Marcados

Fasesólida

Alergeno IgE

Conjugado marcado*:RIA

EIA

FIA

QIA

RADIOINMUNOENSAYOS

• Inmunoensayo marcaje radiactivo– Radiacion beta: Tritio, carbono 14, etc.– Radiación gamma: Iodo 125, Iodo 135, etc.

• Ensayos esencialmente competitivos– Ensayos secuénciales– Ensayos en equilibrio

• Contadores

FLUOROINMUNOENSAYO• Determinación de proteínas, drogas y

hormonas.• Ac se une covalentemente a una molécula

fluorescente.• Absorben la luz de baja longitud de onda (200 a

400 nm)• Emisión a longitud de onda mayor (400-700 nm)• Método directo:

– Ac marcado directamente proporcional al Ag presente• Método indirecto:

– Menor Ac fluorescente fijado, mayor será el Ag presente

Primer Paso

Ac. Fase Sólida Ag a medir del paciente

Incubación 37ºC

Eliminación por lavado

Ag del paciente ligado al Ac

Fluoroinmunoensayo

Ag a medir del paciente

Segundo Paso

Reactivo anti-Agfluorescente

37ºC

Incubación

Medición de la fluorescencia relativa sobre la fase sólida

Fluoroinmunoensayo

ENZIMOINMUNOENSAYO

• Ensayo marcado por una enzima.• Heterogéneos. Paso intermedio o

separación:• Competitivo. Ag Marcado• No competitivo (Sándwich). Ac marcado• Indirecto. Medición niveles de Ac

• Homogéneos. No paso intermedio• Enzimas

• Bajo coste, alto nivel de pureza y interferencia

METODOLOGIAS

UniCap ®(Pharmacia)

Advia Centaur ®(Bayer)

Immulite 2000 ®(DPC)

Sistema UniCAP (Phadia)• Alta capacidad de fijación del alergeno sobre una matriz.

• Gran versatilidad, panel más amplio de alergenos (más de 450), y permite un cribado múltiple de alergenos (Phadiatop, que combina los neumoalergenos, o los alimentos más frecuentes encontrados en clínica), e investigar aquellos pacientes con resultado positivo (> 0.35 kU/L).

• Diseño : se trata de un Fluoroenzimoinmunoensayo clásico de tipo sandwich, alergeno fijado a fase sólida (matriz) y la anti-IgEmarcada con enzima beta-galactosidasa que hidroliza la 4-metil-umbeliferil-beta-D-galactosa, liberando el producto fluorescente, la 4-metil-umbeliferona.

• Curva de calibración obtenida con 6 calibradores de IgE total. Válida durante un mes en el que se controla con 2 puntos.

• Tiempo de realización del ensayo : 2.5 horas.

ImmunoCAP 250 (Phadia)

Curva 6 IgE totaltotalmenteautomatizado

60 test/hora

Técnica dereferencia en la detección in vitrode IgE específica.

> 450 alergenos.

Fluoro-Inmunoanálisis: β-galactosidasa libera 4 metil-umbeliferona fluorescente.

Sistema AlaSTAT - Immulite 2000 (Diagnostic Products Corporation)

• Incorpora la tecnología de alergenos en fase líquida, están fijados a polímeros solubles.

• La unión a la fase sólida a través de la elevada afinidad de la biotina (fijada también al polímero que porta al alergeno) por la estreptavidina (que recubre la bola de poliestireno).

• Tecnología de lavado patentada por centrifugación a 10.000 rpm : mínimas uniones inespecíficas debido a la óptima separación entre las fases ligada y no ligada.

• Diseño : Se trata de un enzimo-quimioinmunoanálisis.

• Conjugado anti-IgE marcado con fosfatasa alcalina y sustrato es el ester fosfato de admantil-dioxetano que origina un producto luminiscente.

• Velocidad de trabajo del analizador : 100 determinaciones/hora. Con un tiempo para el primer resultado de 65 minutos.

Immulite 2000 (DPC): sistema AlaSTAT

IgEEnzima ALP

Anti-IgE

Bola de poliestirenorecubierta de

Estreptavidina

Alergeno en fase líquidaunido a un polímero solubleque también lleva fijado biotina.

Biotina

AlergenoAlergeno

Sustrato

Luminiscencia, CPS

Sustrato:

Ester fosfato deadamantil-dioxetano(señal prolongada)

Enzimo-quimioinmunoanálisis

IMMULITE 2000 ® - EL TUBO DE REACCIÓN

Un elemento esencial es el tubo de Reacción, que junto con la bola recubierta de estreptavidina, esta diseñado especialmente para llevar a cabo

1. La reacción inmunológica

2. El lavado por centrifugación

3. El desarrollo de la señal quimioluminiscente

Mediante esta tecnología se genera una señal prolongada permitiendo aumentar el rango y por tanto el número de lecturas precisas (12, separando las 2 extremas) frente a la quimioluminiscencia tradicional.

LA SEÑAL QUIMIOLUMINISCENTE

Velocidad de trabajo del autoanalizador: 100 det/h (1º en 65´)Plataforma que permite determinar otros analitos

Curva master de calibración:7 puntos IgE total

(códigos de barra del reactivo)

En la prácticacon 2 puntos se adaptaa cada ensayo

Immulite 2000 (DPC)

Sistema ADVIA-Centaur (Bayer)• Diseño de sandwich invertido : Es la Anti-IgE (y no el alergeno) la

que está fijada a la fase sólida (partículas paramagnéticas) capturando sólo la totalidad de IgE que presenta el especímendel paciente.

• Es el alergeno el que va a portar el marcaje luminiscente, pero no de forma directa, sino a través de la interacción biotina-estreptavidina.

• El ester de acridinio sometido a un cambio de pH emite luminiscencia.

• Curva de calibración empleando IgE específica frente a una proteína recombinante del alergeno de abedul (r Bet v 1)

• Velocidad de trabajo del analizador : 120 determinaciones/hora. Con un tiempo para el primer resultado de 47 minutos.

Advia-Centaur (Bayer)

Anti-IgEunida a partículas

paramagnéticas

IgE

Alergenounido abiotina

Diseño sandwich invertido:la Anti-IgE es la que se fija a la fase sóliday el que lleva el marcaje es el alergeno, pero no de forma directa.

Ester de acridiniounido a

Estreptavidina

Quimioluminiscencia, RLU

pH: ac. nítrico y sosa

Advia-Centaur (Bayer)Velocidad de trabajo del autoanalizador: 120 det/h (1º en 47´)Flexibilidad analítica: hormonas, serología, marcadores

Curva master de calibración:6 puntos s-IgE rbet

En la prácticacon 2 puntos se adaptaa cada ensayo

6Muy Alto100 o +

5Muy Alto50-<100

4Muy Alto17.5-<50

3Alto3.5-17.5

2Moderado0.7-3.5

1Bajo0.35-<0.7

oAusente< 0.35

Resultados semicuantitativos“Clases”

Nivel de Ac. SIgEResultados cuantitativosKUA/L

Interpretación resultados IgE específicosInterpretación resultados IgE específicos

IgE específica y citometría de flujo

Fundamento Citometría de flujo

• Técnica de análisis celular multiparamétrico

• Flujo laminar suspensión de partículas (generalmente células) por delante de un haz de láser focalizado.

• El impacto de cada célula produce señales (dispersión y fluorescencia) que son recogidos por distintos detectores y digitalizadas para la medida simultánea de varios parámetros

• Permite el análisis de un gran número de células en poco tiempo (5000 partículas / segundo).

Se trata de una técnica cualitativa y CUANTITATIVA.

Principales componentes CMF

* Fluídica:

* Sistema óptico

* Sistema de recogida y análisis de datos

Flujo laminar.

- Fuente de radiación monocromática

- Selección de la radiación

- Detección de las distintas señales

Esquema Citómetro de flujo

IgE específica y citometría de flujo

lolium olivo gato

FLUJOLAMINAR

fila de partículas

IgE sérica

Anti-IgEmarcada

2 LASER

Cada partícula portauna especificidadalergénica Un láser identifica la partícula

por su espectro rojo-naranja.El otro cuantifica el marcajecon fluoresceína (verde).

Tecnología Multiplex

En un mismo pocillo de reacción,para una muestra determinada,realizamos múltiples micro-inmunoensayossimultáneamente.

Para cada paciente: múltiples microensayos simultáneos

analiza 50-200 esferasde cada especificidad

BajosCV

< 10%

Los Acs siguen siendo la clave

ANTICUERPO fijado a la esfera (soporte)(contra la molécula a analizar)

Marcador tumoralHormonaAntígeno

SUERODELPACIENTE

CONJUGADO (marcado con fluorocromo)contra la molécula a analizar(contra un epítopo distinto al del 1º anticuerpo)

Ventajas de CMF

- Volumen de muestra mínimo.- Mayor precisión frente a las técnicas manuales: IFI- Cuantifica: mayor rango analítico que EIA- Homogeniza las múltiples pruebas existentes- Análisis múltiple simultáneo (mismo conjugado)- Disminuye drásticamente el tiempo de respuesta- Ahorro de mano de obra

Tendencias en las pruebas de detección de sIgE

• Consolidar el mayor número de determinaciones en un solo tubo y una sola estación de trabajo óplataforma analítica multifuncional.

• Utilización de metodología de alta sensibilidad, precisión, garantía de no contaminación,

•Amplio menú de alergenos, amplio panel de alergenos recombinantes.