DEFINIZIONE DI VIRUS

• I virus sono agenti “filtrabili” poiché di dimensioni inferiori a 0,22µ

• I virus sono parassiti intracellulari obbligati• I virus non possono produrre energia e sintetizzare

proteine al di fuori di una cellula ospite•Il genoma dei virus può essere costituito da DNA o da

RNA, ma non da entrambi gli acidi nucleici.•I virus possiedono un capside nudo e in alcuni casi un

pericapside (envelope).•I virus non si replicano per divisione, ma per assemblaggio delle componenti virali pre-formate.

CONSEGUENZE DELLE CARATTERISTICHE VIRALI

• I virus per resistere in natura devono essere infettivi

• I virus devono essere in grado di utilizzare i meccanismi della cellula ospite per produrre i propri componenti (mRNA virali, proteine e copie identiche del genoma).

• I virus devono codificare proteine specifiche per ogni processo da loro richiesto e non effettuabile dalla cellula.

• Le diverse componenti virali devono essere in grado di autoassemblarsi

COMPONENTI DI BASE DEL VIRIONE

GENOMA VIRALE

• DNA• –Singolo filamento o doppio filamento• –Lineare o circolare• RNA• –RNA+ o RNA-• –Singolo filamento, doppio filamento, ambisenso

-Unica molecola o segmentato

VIRUS A DNA E LORO MORFOLOGIA

Virus a DNA

rivestiti con capside nudo

Pox Herpes Hepadna Papova Adeno Parvo

VIRUS A RNA E LORO MORFOLOGIA

Virus a RNA

RNA + RNA+via DNARNA +/ -RNA -

N E Doppio capsideE

PicornaCalici

Norwalk

TogaFlavi

Corona

RhabdoOrthomyxoParamyxo

BunyaArenaFilo

Reo Retro

E

Strategie per la produzione di mRNAvirale

STRUTTURA DEL VIRIONEL’unità di misura per le dimensioni del virione è il nm.

I virus di importanza clinica variano dai 18 nm (parvovirus) ai 300 nm

STRUTTURA DEL VIRIONE

CAPSIDE

SIMMETRIAICOSAEDRICA

STRUTTURA VIRALE: VIRUS A CAPSIDE NUDO• Componenti

–Proteine

•Proprietà–E’ resistente alle seguenti condizioni: alta temperatura, acidi, proteasi, detergenti, essicamento

–Viene rilasciato dalla cellula per lisi

•Conseguenze–Può essere facilmente diffuso (su oggetti, da una mano all’altra, con la

polvere o con piccole gocce d’acqua)–Può essere essiccato e mantenere l’infettività.–Può sopportare le avverse condizioni dell’intestino–Può essere resistente ai detergenti e in acque di scolo trattate

blandamente.–L’azione degli anticorpi può essere sufficiente per la protezione

immunitaria

STRUTTURA VIRALE: VIRUS CON PERICAPSIDE• Componenti

–Membrana, lipidi, proteine, glicoproteine• Proprietà

–E’ distrutto dalle seguenti condizioni ambientali: acidi, detergenti, essicamento, calore–Modifica le membrane cellulari durante la replicazione. E’ rilasciato per gemmazione o per lisi cellulare.

• Conseguenze–Deve rimanere in ambiente umido.–Non può sopravvivere nel tratto gastrointestinale. –Si diffonde in grandi gocce d’acqua, secrezioni, trapianti d’organo e

trasfusioni di sangue.–Non deve necessariamente uccidere la cellula per diffondersi.–Può essere necessaria una risposta immunitaria sia umorale che

cellulare per la protezione e il controllo dell’infezione. -Produce ipersensibilità e infiammazione

EFFETTI DEI VIRUS SULLE CELLULE ANIMALI

EVENTI NELLA REPLICAZIONE VIRALE•

• Riconoscimento della cellula bersaglio•• Adsorbimento• Penetrazione• Spogliazione• Sintesi macromolecolari

–Sintesi degli mRNA precoci e di proteine non precoci-Replicazione del genoma

–Sintesi degli mRNA tardivi e di proteine strutturali–Modificazioni post-traduzionali delle proteine

• Assemblaggio dei virus• Gemmazione dei virus con pericapside

REPLICAZIONE VIRALE

TRASMISSIONE VIRALE•• Respiratoria• •Oro-fecale• Per contatto (lesioni, saliva, oggetti

contaminati)• Zoonosi (animali, insetti)• Sangue• Rapporto sessuale• Trasmissione materno-fetale• Genetica

Infezioni virali

FATTORI DETERMINANTI LA MALATTIA VIRALE

•Natura della malattia–Tessuto bersaglio•Via d’ingresso del virus•Accesso del virus al tessuto bersaglio•Tropismo tissutaledel virus•Permissività alla replicazione virale delle cellule–Ceppo virale patogeno•Stato immunitario dell’ospite–Competenza del sistema immunitario–Precedente immunità nei confronti del virus•Gravità della malattia–Capacità citopaticadel virus–Immunopatologia–Entità dell’inoculo virale–Tempo richiesto per la risoluzione dell’infezione–Condizioni generali di salute dell’ospite•Nutrizione• Altre patologie influenzanti lo stato immunitario – Patrimonio genetico dell’ospite – Età

DIFESE DELL’OSPITE CONTRO LE INFEZIONI VIRALI

•• Barriere naturali

• Difese immunitarie non specifiche

• Risposte immunitarie antigene-specifiche

FARMACI ANTIVIRALI: BERSAGLI

• Fasi precoci delle interazioni virus-cellulaes. amanditina per virus influenzale

enfuviride per HIV• Traduzione di mRNAvirali

es. interferone• Trascrizione e replicazione

es. analoghi strutturali di nucleosidi,.inibitori della trascrittasi inversaacido fosfonoacetico e derivati

• Proteasies. ritonavir, saquinavir

• Assemblaggioes. inibitori di neuramidasi

Metodi di diagnosi virologica• Identificazione del virus dopo isolamento in

coltura cellulare

• Esame diretto del virus nei campioni biologici– Citologia e istologia– Microscopia elettronica– Metodi immunologici– Metodi molecolari– Colture cellulari convenzionali e shell vial.

• Test immunosierologici

Significato del riscontro di virus • La dimostrazione di un virus in un campione

clinico non è una prova sufficiente che il virus sia la causa della malattia (NB: infezione latente, infezione persistente, ecc.)

• È importante considerare:– Natura dell’interazione virus-ospite– Se il virus è noto essere in grado di causare la

malattia dell’ospite

• E’ importante quindi valutare:– Presenza concomitante di IgM specifiche– Espressione di trascritti o proteine virali strutturali,

espressi solo in corso di infezione attiva.

Campioni per diagnosi virologica

• Tipo di campione– Sede di infezione

• Tempo di raccolta– Titolo virale elevato nei primi giorni post-infezione– Siero acuto e convalescente per ricerca di

anticorpi• Qualità e quantità• Condizioni di trasporto

– Coltura– 4°C se >1 h; -70°C se >24h

La coltura del virus

– Nell’animale sensibile

– Nelle uova embrionate

– Nelle colture cellulari

Colture virali in uova embrionate

Isolamento virale in colture cellulari

• L’uso di colture cellulari è peculiare della diagnostica virologica.

• La coltura è un metodo che consente di amplificare il virus per ulteriori caratterizzazioni, mantenendone l’infettività.

• Consente di isolare anche virus non ancora noti.

• Richiede però strutture e personale specializzati, costi elevati, tempi relativamente lunghi.

ISOLAMENTO VIRALELe colture cellulari sono ampiamente impiegate per l’isolamento di virus. Esistono 2 tipi di colture cellulari:

1. Colture cellulari primariees.: Rene di scimmia

2. Linee cellulari continuees.: HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK

Le colture cellulari primarie sono riconosciute come il miglior sistema disponibile, in quanto permettono la crescita di un maggior numero di virus. Sono tuttavia molto costose e spesso difficilmente ottenibili. Le linee cellulari continue sono più facilmente maneggiabili ma permettono la crescita di un numero limitato di virus.

COLTURE CELLULARI

I virus possono provocare:1. Effetto citopatico – come il rigonfiamento delle cellule o la

formazione di sincizi. Può essere specifico o aspecifico.2. Emoadsorbimento – le cellule acquisiscono la capacità di

adesione agli eritrociti.

La conferma dell’identitàdi un virus può essere ottenuta mediante saggidi neutralizzazione, inibizione dell’emoadsobimento o immunofluorescenza.

Culture control

Virus-infected culture

Late stage of virus infection

CPE da CMV su fibroblasti umani

Emoadsorbimento• Alcuni virus (es paramyxovirus) sono in grado di

legare i globuli rossi.

• Il test dell’emoadsorbimento consiste nell’aggiungere degli eritrociti di cavia, ratto o scimmia ad una coltura cellulare già inoculata con il campione clinico.

• Dopo un’incubazione di 30’ si osserva il legame degli eritrociti alle cellule.

• Può seguire l’identificazione del virus mediante IF.

Neutralizzazione del virus

• Della capacità di replicare• Della capacità di emoagglutinare• Della capacità di produrre una reazione

enzimatica

Il virus deve essere conosciutoTecnica complessa

TITOLAZIONE DI VIRUSPFU/ml (plaque assay)

IMMUNOFLUORESCENZA