REQUISITI PER LA VALIDAZIONE DI UN

TEST DI LABORATORIO

�Efficacia tecnica: è in relazione alla metodica utilizzata

�Accuratezza diagnostica: è correlata a decisioni diagnostiche e terapeutiche

METODI IMMUNOLOGICI PER IL

RILIEVO DI AUTOANTICORPI

Metodi immunochimici :

consentono la ricerca qualitativa (presenza/assenza) degli autoanticorpi nel siero dei pazienti

1. Immunoblotting : Western Blot (WB), Dot Blot (DB)

2. Immunofluorescenza indiretta (IFI)

Metodi immunometrici :

consentono la misurazione quantitativa delle concentrazioni autoanticorpali

1. Immunoenzimatico (EIA, ELISA)

2. Immunofluorimetria e sue varianti (FEIA)

3. Immunochemiluminescenza (CLIA)

4. Radioimmunologico (RIA)

IMMUNOFLUORESCENZACARATTERISTICHE GENERALI

� Utilizza anticorpi anti-imunoglobuline umane

coniugate con una sostanza fluorescente

�per rivelare la presenza di autoAb fissati ad

�autoantigeni specifici espressi in

� substrati differenti costituiti da cellule in coltura

e\o sezioni di tessuti fissati su supporto vetroso.

� Cellule HEP-2 da carcinoma laringeo umano

� Emoflagellato: Crithidia luciliae

� Granulociti neutrofili umani

� Triplo tessuto (fegato-rene-stomaco)di

ratto o di topo

� Pancreas umano o animale

� Esofago di scimmia

� …

IFI: ES. DI SUBSTRATO UTILIZZATO

ANAANA

DNADNA

ANCAANCA

APCA,ASMA,APCA,ASMA,

LKM, AMALKM, AMA

ICAICA

EMAEMA

....

IFI:TECNICA DI ESECUZIONE

� Diluizione siero ( 1:40, 1:20, 1:5 ecc.)

� Incubazione con il substrato

� 1° Lavaggio

� Incubazione con Ac anti-Ig umane coniugate con

fluorocromo;

� 2° Lavaggio

� Montaggio dei vetrini in glicerolo al 10% in PBS;

� Lettura dei preparati con microscopio a

fluorescenza

IFI: PREPARATORI AUTOMATICI

Sistemi automatici per la preparazione dei vetrini in

grado di eseguire in automazione le fasi di:

�Diluizione

�Dispensazione

�Incubazione

�Lavaggio

Pro: “completa” automazione

Contro: attenzione alla qualità della preparazione

�NEW ENTRY: SISTEMI PER L’ACQUISIZIONE , L’ANALISI E

L’ARCHIVIAZIONE DELLE IMMAGINI

IFIIFIVANTAGGIVANTAGGI LIMITI

• Buona sensibilità (95%)

• Semplice,rapido e

riproducibile

• Numero elevato di

reattività antigeniche

distinte

• Ottimizza l’iter

diagnostico (percorso

ragionato e a cascata)

• Costo contenuto

• Tecnica soggettiva

• Richiede di ottimizzare la

standardizzazione

• Perdita di alcuni Ag

nucleari altamente solubili

nei lavaggi

• Metodo qualitativo

• Deve essere completato

da indagini sierologiche

antigene specifiche

IFI:CONTROLLO DI QUALITA’ INTRALAB

IFI:CONTROLLO DI QUALITA’ INTRALAB

In ogni seduta analitica deve essere inserito un Controllo positivo

e un Controllo negativo

CONTROLLO POSITIVO

serve a confermare la correttezza delle procedure di

esecuzione dell’esame ( dispensazione sieri, lavaggi

vetrini, efficienza del coniugato)

CONTROLLO NEGATIVO

indispensabile per una valutazione del grado di auto-

fluorescenza del substrato

Lettura e interpretazione IFI

1.Definizione POSITIVO/NEGATIVO

2.Definizione del TITOLO Valutazione quantitativa discreta effettuando diluizioni seriate fino a scomparsa della

fluorescenza

3. Definizione del PATTERN

4.Confronto tra due operatori

Lettura e interpretazione degli ANA

Definizione del Pattern

(26 classificati)

IMMUNOBLOTTING: tecnica

�Separazione elettroforetica degli Ag (su un gel di

poliacrilamide)

�Western Blotting: la separazione elettroforetica viene

trasferita su una membrana di nitrocellulosa

�Dot Blot: al termine dell’elettroforesi le proteine sono

“selezionate” e quindi trasferite su nitrocellulosa

� Incubazione con siero diluito

� incubate con un antisiero coniugato con un enzima

�substrato

�Reazione di evidenziazione, confrontate con marcatori di PM

noto per WB

Dot e Line BlotTrasferimento diretto di molecole su membrana di nitrocellulosa o nylon.Si ottengono aspetti:

•punto dot blot

•linea line blot

IMMUNOBLOTTING: vantaggi

• Alta flessibilità

• Praticità

• Riproducibilità

• Alta sensibilità e specificità

• Possibilità di automazione

completa

CARATTERISTICHE DEI METODI IN IMMUNOBLOTTING

�Dot blot e Line blot:

• informazioni limitate agli antigeni

selezionati ,

• facile interpretazione

�WB:

• pattern antigenico completo per PM

• presenta soggettività e

• difficoltà nella interpretazione del

risultato

METODI IMMUNOMETRICI

CONSIDERAZIONI GENERALI METODI IMMUNOMETRICI

� Immunoenzimatica,

� immunochemiluminescenza e

� immunofluoro-enzimatica

rispondono all’esigenza di automazione

delle procedure analitiche e permettono

• riduzione dei costi

• esecuzione su larga scala

• aumento dell’affidabilità analitica

�antigeni specifici adesi ad una

fase solida in polistirene

�un reattivo rivelatore costituito

da anticorpi anti-

immunoglobuline umane

coniugati con un enzima

� e di un substrato dell’enzima

IMMUNOENZIMATICA in fase solida

METODICA IMMUNOENZIMATICA ( ELISA )

Vantaggi

�Analisi di numerosi campioni

�Buona automazione

�Tecnica quantitativa

Problematiche

�natura , qualità e quantità dell’Ag

�efficacia del suo adsorbimento alla fase solida

�stabilità Ag

� organizzazione: a test/non a paziente

Sistemi monostrip a determinazione singola basati sui test ELISA

Utilizzati per:

� test rari , es:anti-insulina, anti-fattore intrinseco

� test a carattere di urgenza es. : anti-tTGIgA in sospetto crisi celiaca

DiluizionecampionePozzetti di

reazione

Reattivi

•Alegria® Test Strip sono sistemi basati sui test ELISA

•Taratura Memorizzata

• prevede un set completo di reagenti.

Campione negativo

Campione positivo

UN METODO INNOVATIVO

PER AUTOIMMUNITA’Tecnologia CLIA: Chemiluminescence enzymeimmunoassay:

� test quantitativo in due step

�fase solida con Ag immobilizzato

� 1° incubazione Ac specifici

� 2° incubazione coniugato con DMAE

� aggiunta di soluzione innescante

� rilevazione

Principio del test: Lavaggio Lavaggio

Fase solida: particelle magnet. rivestite con autoAg

Autoanticorpispecifici

Coniugato:

Ac Mo marcato DMAE

Attivazione

Rilevazione tramite CL

+ +

UN METODO INNOVATIVO PER

AUTOIMMUNITA’: Tecnologia CLIA� strumento completamente automatizzato ad accesso random

� concepito per test di autoimmmunità

� fino a 15 immunodosaggi simultaneamente

� 21 test attualmente disponibili

�costante aggiornamento dei marcatori Ac

� test quantitativi validati clinicamente

� possibilità di test reflex

• malattie autoimmuni sistemiche

• celiachia

• sindrome anti-fosfolipidi

• Vasculiti ANCA associate

dia

gn

ostica

dia

gn

ostica

CRITERI PER LA SCELTA di UN METODO

è importante giungere alla scelta di un metodo in base a:

� Finalità del test:

� Rapporto con i clinici

� Compatibilità del

metodo con

• Screening

• Approfondimento

• Monitoraggio• Quantitativo? Qualitativo?

• Indagini mirate

• specifiche esigenze

diagnostiche

• Struttura Lab

• Modello organizzativo

METODOLOGIE E TEST PRESENTI METODOLOGIE E TEST PRESENTI

ATTUALMENTE PRESSO IL ATTUALMENTE PRESSO IL

LABORATORIO DI IMMUNOPATOLOGIA E LABORATORIO DI IMMUNOPATOLOGIA E

ALLERGOLOGIA DELLA AZIENDA ALLERGOLOGIA DELLA AZIENDA

OSPEDALIEROOSPEDALIERO--UNIVERSITARIA DI UDINEUNIVERSITARIA DI UDINEAlcuni test vengono eseguiti con più metodiche es:

Anti-centromero: IFI-ELISA-blot

Anti-DNA: ELISA-IFI

MODELLO ORGANIZZATIVO LAB UDINE

Utilizza metodi :

� validati

� svariate tecnologie

� sia di tipo quantitativo che qualitativo

� automatizzati, semi autom. e manuali (dotblot)

Si pone come obiettivo :

� attuare percorsi diagnostici dedicati

� lavorare con appropriatezza

� effettuare approfondimenti necessari

Come si inserisce il lavoro del tecnico di

laboratorio biomedico?

Il TSLB deve:

� conoscere test e metodi

� averne padronanza e dimestichezza

� conoscere i percorsi diagnostici messi in atto

� potere aggiungere test necessari appropriati

� essere in grado di utilizzare più metodiche in

una giornata per

� seguire e portare a termine iter diagnostici

anche complessi

Alcuni esempi di percorsi diagnostici:

MALATTIA AUTOIMMUNE SISTEMICA

Test 1°livello Test 2°livello Test 3°livello Test 4°livello

ANA IFI ENA EIA ENA BLOT ENA BLOTSclero/Miosite

DNA EIA DNA IFI DNA BLOT NucleosomiBLOT/EIA

ENA EIA Screening

ENA Sp. EIA ENA BLOT

ANCA IFI ANCA EIA MPO/PR3

ANCA BLOT

Pattern rari : membrana nucleare

Pattern sovrapposti: SPECKLED e CENTROMERICO

Centromeroa basso titolo?

TEST DI 2° LIVELLO PER CONFERMA SPECIFICITA’’

Centromeroa basso titolo?

Test anti-dsDNA Crithidia

MALATTIE AUTOIMMUNI SISTEMICHE

RICERCA Ac. SPECIFICI es: anti-dsDNA

Anti-dsDNA

Test 2° livello:IFI

test più specifico

Anti-dsDNA

Test 1° livello. ELISA

POS

Alcuni esempi di percorsi diagnostici:

MALATTIA AUTOIMMUNE D’ORGANO

Test 1°livello Test 2°livello Test 3°livello Test 4°livello

ANTI-Mitocondri IFI

LIVER BLOT

Anti-tTG IgAEIA

EMA IgAIFI

Anti-tTG IgAEIA

IgA totaliturbidimetria

Anti-tTG IgGEIA

Anti-DGPIgG

APCAIFI

APCAEIA

RICERCA AC ANTI-MITOCONDRI IFI SU TESSUTO DI RATTO

Positività anti-mitocondriale visibile come punteggiatura su cell.tubuli renali ed epatociti

RENE

FEGATO

RENE FEGATO

Anti-mitocondrio

M2

Line Blot con Antigeni specifici per epatopatia di tipo autoimmune

LINE-BLOT: TEST DI 2° LIVELLO PER CONFERMA SPECIFICITA’ AMA

Line Blot con Antigeni specifici per

epatopatia di tipo autoimmune

Anti-SLA : Si associa ad epatite autoimmune

LINE-BLOT:TEST DI 1° LIVELLO PER ALTRI Ac. come a-SLA o a-LC1

DIAGNOSI DI GASTRITE ATROFICA AUTOIMMUNE

Fluorescenza cellule parietali stomacoAutoanticorpi specifici:ATPase H+/K+ pompa protonica

IFI : mucosa gastrica ratto

In caso di positività a basso titolo dubbia o sovrapposizione altri autoAc (es.AMA)

N

P

ELISA: Ag specifico

DIAGNOSI DI MAL. CELIACA

Anti-endomisioIgA in IFI : terzo infer. Esofago scimmia pattern tipico 20X.

Ricerca anti-tTG IgA

Test di 1° livello ELISA

EMA IgA:

Test 2° livello IFI

test più specifico

POS

Paziente: F.C. anni 16 femminaPresentazione clinica: celiachia atipicaanti-tTG IgA = 39 UA (cut off 10 UA)Anti- peptidi deamidati gliadina IgA e IgG = positivi

Diluizione 1:5 (40x)

Diluizione 1:20 (20x)Diluizione 1:5 (40x)

Diluizione 1:100 (20x) Diluizione 1:200 (20x)

• La MC: prevalenza 1:100

• Nei soggetti con deficit assoluto di IgA (uno ogni 700 circa) la MC ha una prevalenza 5-10 volte superiore

• I pazienti con deficit assoluto di IgA e MC non producono a-tTG IgA ma a-tTG IgG

• Il test di 1°livello per MC è a-tTG IgA

• Tutte le richieste per a-tTG IgA dovrebbero comprendere anche il dosaggio delle IgA totali (in realtà solo il 20% soddisfa tale requisito)

Ricadute dei percorsi clinico-diagnostici sul modello organizzativo:

il caso della malattia celiaca

Ricadute dei percorsi clinico-diagnostici sul modello organizzativo:

il caso della malattia celiaca• Esecuzione del test a-tTG EIA con inserimento di

un siero noto con deficit assoluto di IgA

• I sieri con valori di assorbanza molto bassi (comparabile a quello del siero con deficit) eseguono il test per IgA totali

• Se confermato il deficit esecuzione dei test EIA a-tTG IgG e anti-DGP IgG

• Il referto viene accompagnato da un commento che spiega l’iter seguito e indica il significato dell’eventuale deficit di IgA e della eventuale diagnosi di MC.

CONCLUSIONI• Complessità tecnologica e diagnostica• Organizzazione e gestione dei campioni

biologici impegnativa, richiede attenzione

• Necessità di middelware dedicati al settore autoimmunità

• Si richiede: conoscenza dei percorsi d. e delle indicazioni cliniche generali anche da parte del TSLB e

• stretta interazione tra dirigenti e personale tecnico