CORSO DI PERFEZIONAMENTO DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA: ATTUALITA’ E PROSPETTIVE Istituito con...

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CORSO DI PERFEZIONAMENTO CORSO DI PERFEZIONAMENTO DIAGNOSTICA DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA: MICROBIOLOGICA: ATTUALITA’ E PROSPETTIVE ATTUALITA’ E PROSPETTIVE Istituito con Decreto Rettorale n.985 del 2.8.2001 Istituito con Decreto Rettorale n.985 del 2.8.2001 Evento ECM [50 crediti], #2525-11788 Medici e Biologi e #252511788 [TSLB Evento ECM [50 crediti], #2525-11788 Medici e Biologi e #252511788 [TSLB] 2° Modulo – 28 settembre 2° Modulo – 28 settembre 2002 2002 Rosanna Dei Rosanna Dei La tipizzazione La tipizzazione intraspecifica intraspecifica

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CORSO DI PERFEZIONAMENTOCORSO DI PERFEZIONAMENTO DIAGNOSTICA DIAGNOSTICA

MICROBIOLOGICA:MICROBIOLOGICA:ATTUALITA’ E PROSPETTIVEATTUALITA’ E PROSPETTIVE

Istituito con Decreto Rettorale n.985 del 2.8.2001Istituito con Decreto Rettorale n.985 del 2.8.2001Evento ECM [50 crediti], #2525-11788 Medici e Biologi e #252511788 [TSLBEvento ECM [50 crediti], #2525-11788 Medici e Biologi e #252511788 [TSLB]

2° Modulo – 28 settembre 20022° Modulo – 28 settembre 2002

Rosanna DeiRosanna Dei

La tipizzazione intraspecificaLa tipizzazione intraspecifica

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LA TIPIZZAZIONE LA TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICAINTRASPECIFICA

GenereGenere

SpecieSpecie

Variabilità entro la specieVariabilità entro la specie

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LA TIPIZZAZIONE LA TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICAINTRASPECIFICA

Variabilità all’interno della specieVariabilità all’interno della specieRilevanza clinicaRilevanza clinica

fattori di virulenza/patogenicitàfattori di virulenza/patogenicità

sensibilità ai farmacisensibilità ai farmaci

Rilevanza epidemiologicaRilevanza epidemiologicainfezioni nosocomialiinfezioni nosocomiali

infezione esogena vs endogenainfezione esogena vs endogenafonte comunefonte comune

Rilevanza forenseRilevanza forense

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LA TIPIZZAZIONE LA TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICAINTRASPECIFICA

Variabilità all’interno della specieVariabilità all’interno della specie

• CaratterizzazioneCaratterizzazione

l’isolato va qualificatol’isolato va qualificato

• ConfrontoConfronto

gli isolati vanno comparatigli isolati vanno comparati

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TIPIZZAZIONE - TIPIZZAZIONE - metodimetodi

Grande varietàGrande varietà• fenotipici / genotipicifenotipici / genotipici• tradizionali / innovativitradizionali / innovativi• one-setone-set / / two-settwo-set• Range di applicabilitàRange di applicabilità

– Ristretto o allargatoRistretto o allargato

semplici / difficoltosisemplici / difficoltosi

tutti i lab / centri di riferimentotutti i lab / centri di riferimento

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TIPIZZAZIONE - TIPIZZAZIONE - metodimetodi

ValutazioneValutazione

• Potere discriminantePotere discriminante

• ‘‘Tipabilità’ Tipabilità’ ((typing ability, typeabilitytyping ability, typeability))

• RiproducibilitàRiproducibilità

• FattibilitàFattibilità

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TIPIZZAZIONE - metodiTIPIZZAZIONE - metodi valutazione valutazione

Potere discriminantePotere discriminante

• distinguere senza ambiguità isolati distinguere senza ambiguità isolati epidemiologicamente indipendentiepidemiologicamente indipendenti– Errore di tipo IErrore di tipo I

• Dare per uguali isolati diversiDare per uguali isolati diversi

– Errore di tipo IIErrore di tipo II• Dare per diversi isolati ugualiDare per diversi isolati uguali

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TIPIZZAZIONE - metodiTIPIZZAZIONE - metodi valutazione valutazione

Potere discriminantePotere discriminante

• numero di tipi ottenuti rispetto ai numero di tipi ottenuti rispetto ai ceppi saggiaticeppi saggiati– tipizzazione fine tipizzazione fine fingerprintingfingerprinting

• non generalizzabilenon generalizzabile

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Blanc DS Blanc DS et alet al. Molecular typing methods and . Molecular typing methods and discriminatory power. Clin Microbiol Infect 1998;4:61-63discriminatory power. Clin Microbiol Infect 1998;4:61-63

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TIPIZZAZIONE - TIPIZZAZIONE - metodimetodi valutazione valutazione

C. difficileC. difficile tipizzati per sensibilità fagica tipizzati per sensibilità fagica

Set FagiSet Fagi N° profiliN° profili N° resistentiN° resistenti

RefRef (6) (6) 8 8 194194

Nuovi (12)Nuovi (12) 11 11 51 51

R + NR + N 130 130 24 24

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TIPIZZAZIONE - TIPIZZAZIONE - metodimetodi valutazione valutazione

TipabilitàTipabilità

• risultato su ogni isolato esaminatorisultato su ogni isolato esaminato– frequenza non-tipizzabilifrequenza non-tipizzabili

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TIPIZZAZIONE - TIPIZZAZIONE - metodimetodi valutazione valutazione

RiproducibilitàRiproducibilità• lo stesso risultato in occasioni diverselo stesso risultato in occasioni diverse

un ceppo un ceppo – preparazioni diversepreparazioni diverse

– la stessa preparazione ripetuta nella stessa o in prove successivela stessa preparazione ripetuta nella stessa o in prove successive

Stabilità del carattereStabilità del carattere

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TIPIZZAZIONE - TIPIZZAZIONE - metodimetodi valutazionevalutazione

Fattibilità / robustezzaFattibilità / robustezza• Facilità di esecuzioneFacilità di esecuzione

• Disponibilità di reagenti,attrezzatureDisponibilità di reagenti,attrezzature

• RapiditàRapidità

• CostiCosti

• Standardizzabilità Standardizzabilità

• Applicabilità ampiaApplicabilità ampia

• Lettura, elaborazione dei risultatiLettura, elaborazione dei risultati

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TIPIZZAZIONETIPIZZAZIONE

Confronto dei risultatiConfronto dei risultati• Identità Identità [criterio qualitativo][criterio qualitativo]

• Somiglianza Somiglianza [criterio quantitativo][criterio quantitativo]

Indici di somiglianzaIndici di somiglianza• Elaborazione Elaborazione [cluster analysis][cluster analysis]

• DendrogrammiDendrogrammi

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TIPIZZAZIONETIPIZZAZIONE metodi tradizionalimetodi tradizionali

• Su base fenotipicaSu base fenotipica– FagiFagi– BatteriocineBatteriocine– AntigeniAntigeni– Profilo biochimicoProfilo biochimico– Sensibilità agli antibioticiSensibilità agli antibiotici– Inibizione dello Inibizione dello swarmingswarming, , ProteusProteus

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TIPIZZAZIONETIPIZZAZIONE metodi tradizionalimetodi tradizionali

Fagi / BatteriocineFagi / Batteriocine• Sensibilità degli isolati in esame ad un Sensibilità degli isolati in esame ad un

panello di fagi / batteriocinepanello di fagi / batteriocine– passivapassiva

• Produzione da parte degli isolati in esame Produzione da parte degli isolati in esame di fagi / batteriocine e saggio su un di fagi / batteriocine e saggio su un pannello di indicatoripannello di indicatori– attivaattiva

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TIPIZZAZIONETIPIZZAZIONE metodi innovativimetodi innovativi

• Su base genetica molecolareSu base genetica molecolare– DNADNA– RNARNA– PlasmidiPlasmidi– ProteineProteine– Multi Locus Enzyme ElectrophoresisMulti Locus Enzyme Electrophoresis– Pirolysis mass spectrometryPirolysis mass spectrometry

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• Antibiogram typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Antibiogram typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with selected antibiotics was evaluated as a primary epidemiological typing tool selected antibiotics was evaluated as a primary epidemiological typing tool and compared with ribotyping.and compared with ribotyping. Antibiograms were derived with the Kirby-Antibiograms were derived with the Kirby-Bauer disk diffusion method by using erythromycin, clindamycin, Bauer disk diffusion method by using erythromycin, clindamycin, cotrimoxazole, gentamicin, and ciprofloxacin. For typing, antibiogram data cotrimoxazole, gentamicin, and ciprofloxacin. For typing, antibiogram data were analyzed by similarity analysis of disk zone diameters (quantitative were analyzed by similarity analysis of disk zone diameters (quantitative antibiogram typing). One hundred seventy-two isolates were typed.antibiogram typing). One hundred seventy-two isolates were typed. Reproducibility reached 98% for the quantitative antibiogram and 100% for Reproducibility reached 98% for the quantitative antibiogram and 100% for ribotyping.ribotyping. With three selected restriction enzymes (EcoRV, HindIII, and KpnI), With three selected restriction enzymes (EcoRV, HindIII, and KpnI), 40 epidemiologically unrelated isolates could be classified into 21 ribotypes, 40 epidemiologically unrelated isolates could be classified into 21 ribotypes, whereas quantitative antibiogram typing classified these isolates into 19 whereas quantitative antibiogram typing classified these isolates into 19 groups. To evaluate the discriminatory power of the methods, we calculated an groups. To evaluate the discriminatory power of the methods, we calculated an index of discrimination from data obtained with these 40 isolates. This index index of discrimination from data obtained with these 40 isolates. This index takes into consideration both the number of types defined by the typing takes into consideration both the number of types defined by the typing method and their relative frequencies.method and their relative frequencies. With both ribotyping and quantitative With both ribotyping and quantitative antibiogram typing, high discrimination indices (0.972 and 0.954, respectively) antibiogram typing, high discrimination indices (0.972 and 0.954, respectively) were obtained.were obtained. When epidemiological links between patients (ward, period of When epidemiological links between patients (ward, period of hospitalization, and contacts between staff and patients) were compared with hospitalization, and contacts between staff and patients) were compared with the results of ribotyping or the quantitative antibiogram typing method, it the results of ribotyping or the quantitative antibiogram typing method, it appeared that both methods were able to discriminate epidemiological appeared that both methods were able to discriminate epidemiological clusters, with only a few discrepancies.clusters, with only a few discrepancies. In conclusion, quantitative antibiogram In conclusion, quantitative antibiogram typing, although not necessarily based on genomic markers, is a simple typing, although not necessarily based on genomic markers, is a simple method which enables a reliable workup of methicillin-resistant S. aureus method which enables a reliable workup of methicillin-resistant S. aureus epidemic when sophisticated molecular typing methods are not available.epidemic when sophisticated molecular typing methods are not available.Blanc DS Blanc DS et alet al. J Clin Microbiol 1994;32:2505-9. J Clin Microbiol 1994;32:2505-9

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Evaluation of the discriminatory powers of the Dienes test and ribotyping as Evaluation of the discriminatory powers of the Dienes test and ribotyping as typing methods for Proteus mirabilis.typing methods for Proteus mirabilis.

Pfaller MA, Mujeeb I, Hollis RJ, Jones RN, Doern GV.Pfaller MA, Mujeeb I, Hollis RJ, Jones RN, Doern GV.

A total of 63 clinical isolates of Proteus mirabilis collected over a 19-month A total of 63 clinical isolates of Proteus mirabilis collected over a 19-month period were typed by theperiod were typed by the Dienes test and ribotyping.Dienes test and ribotyping. Ribotyping was Ribotyping was performed using the fully automated RiboPrinter Microbial Characterization performed using the fully automated RiboPrinter Microbial Characterization System (Qualicon, Wilmington, Del.). Isolates that were indistinguishable System (Qualicon, Wilmington, Del.). Isolates that were indistinguishable by the Dienes test and/or ribotyping were characterized further by pulsed-by the Dienes test and/or ribotyping were characterized further by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Most of the isolates represented unique field gel electrophoresis (PFGE). Most of the isolates represented unique strains as judged by the Dienes test and ribotyping. Forty isolates strains as judged by the Dienes test and ribotyping. Forty isolates represented 40 different ribotypes and Dienes types. The remaining 23 represented 40 different ribotypes and Dienes types. The remaining 23 isolates were grouped into 13 Dienes types, 12 ribotypes, and 14 PFGE isolates were grouped into 13 Dienes types, 12 ribotypes, and 14 PFGE typestypes. . The index of discrimination was 0.980 for the Dienes test, 0.979 for The index of discrimination was 0.980 for the Dienes test, 0.979 for ribotyping, and 0.992 for PFGE.ribotyping, and 0.992 for PFGE. Both the Dienes test and ribotyping are Both the Dienes test and ribotyping are useful methods for identifying individual strains of P. mirabilis.useful methods for identifying individual strains of P. mirabilis. The Dienes The Dienes test is simple, inexpensive, and easy to perform. It can be performed in test is simple, inexpensive, and easy to perform. It can be performed in virtually any laboratory and should be used in the initial epidemiologic virtually any laboratory and should be used in the initial epidemiologic characterization of P. mirabilis isolates.characterization of P. mirabilis isolates.

J Clin Microbiol 2000 Mar;38(3):1077-80J Clin Microbiol 2000 Mar;38(3):1077-80

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