Controllo biologico dei microrganismi

Controllo biologico dei microrganismi:

sterilizzazione & disinfezione

Giovanni Di Bonaventura, PhD

CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica»

CdS Medicina e Chirurgia

AA 2019-2020

Controllo dei microrganismi

«Dove» e «perché» è necessario

MICROBIOTA AMBIENTALE

Ambiente

MICROBIOTA

UMANO

Agricoltura

Industria

Zootecnia

Cibo, farmaceutici,

carburante, cosmetici

Animali, pollame,

(conservazione, produzione), etc

Sanitizzazione delle aree

Malattie (alberi, raccolto,

piante, etc)

Prevenzione di infezioni iatrogene,

infezioni chirurgiche, infezioni

crociate, diffusione di microrganismi

e geni associati ad antibiotico-R, etc

Controllo biologico

Tecniche

Il controllo biologico è finalizzato alla decontaminazione, ossia alla rimozione od alla inattivazione dei microrganismi mediante un trattamento che rende un oggetto od una superficie «sicuri», ossia tali da poter essere maneggiati o toccati senza rischio di contaminazioni.

Pulizia

Disinfezione

▪ metodi fisici

▪ metodi chimici

Sterilizzazione

▪ metodi fisici

▪ metodi chimici

▪ metodi chimico-fisici

DECONTAMINAZIONE

Il concetto di decontaminazione è relativo.

La tecnica per decontaminare viene scelta sulla

base della pericolosità e della concentrazione del

microrganismo.

Controllo biologico

Pulizia

PULIZIA = rimozione di materiale organico dal prodotto (strumentazione, attrezzature, etc.)

1. sciacquare l’oggetto con acqua fredda

2. applicare il detergente e rimuovere meccanicamente il materiale organico

3. risciacquare l’oggetto con acqua tiepida

4. asciugare l’oggetto (quindi disinfettare / sterilizzare)

Una corretta pulizia rende più efficace la decontaminazione (disinfezione/sterilizzazione). La materia organica, infatti, può proteggere i microrganismi dal trattamento:

▪ riducendo la penetrazione dell’agente (calore, sostanza chimica)

▪ neutralizzando l’agente (sostanza chimica)

Controllo biologico

Sterilizzazione vs Disinfezione

STERILIZZAZIONE = impiego di procedure chimiche, fisiche e/o chimico-fisiche per la eliminazione o

distruzione di qualsiasi forma di vita microbica, incluse le spore batteriche (forme di resistenza).

▪ Concetto assoluto, sebbene influenzato dalla capacità tecnica di rimuovere/distruggere i

microrganismi. Ad esempio, una soluzione filtrata non è tecnicamente sterile, poiché non in grado

di rimuovere la componente virale a causa delle esigue dimensioni.

DISINFEZIONE = processo che riduce il numero dei microrganismi patogeni a livelli di sicurezza per

l’uomo. Non è attiva nei confronti delle spore, ma soltanto sulle forme vegetative.

▪ Disinfezione: trattamento di superfici o sostanze inanimate (abiotiche)

▪ disinfettante: agente chimico in grado di uccidere microrganismi; dotato di diversi livelli di efficacia

▪ Antisepsi: applicazione topica a mucose, cute od altri tessuti

▪ antisettico: disinfettante usato su tessuti viventi

Are they dead or not ?

Definizioni

▪ Biocida: composto che uccide tutti i microrganismi viventi (patogeni e non-) incluse le spore

- battericida, fungicida, virucida, sporicida

▪ Biostatico: composto che impedisce la crescita dei microrganismi, non necessariamente uccidendoli

- batteriostatico, fungistatico, virustatico

▪ Sepsi: contaminazione microbica

▪ Antisepsi: procedura atta a prevenire una contaminazione (riduzione/inibizione microbica)

▪ Asepsi: assenza di contaminazione microbica

Controllo dei microrganismi

Metodiche

Sterilizzazione

da: Murray et al. Medical Microbiology 3rd ed., Mosby, 1998

La sterilizzazione di un prodotto può essere ottenuta mediante

l’impiego di tecniche:

▪ FISICHE

▪ CHIMICHE

▪ CHIMICO-FISICHE

Sterilizzazione - LAS

Quando il concetto di sterilità viene applicato su larga scala, nessuna tecnica dà assoluta certezza di

ottenere la sterilità ma ragionevole certezza.

Un materiale è infatti considerato sterile quando la probabilità di trovarvi un microrganismo è inferiore

ad uno su un milione.

In altri termini c’è la probabilità che sia sopravvissuto non più di un microrganismo vivente in 106 unità

sottoposte a sterilizzazione. Questo concetto è espresso in termini di LAS (livello di assicurazione di

sterilità).

Nelle attività farmaceutiche (preparazione di iniettabili, colliri e nella preparazione di materiali di

medicazione), un dato prodotto è considerato sterile quando la probabilità di trovare una unità non

sterile in un lotto sterilizzato sia di 10-6, quando cioè una unità su un milione può non essere sterile.

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE

▪ Calore

▪ umido

▪ secco

▪ Filtrazione

▪ Onde elettromagnetiche

▪ radiazioni UV

▪ radiazioni ionizzanti

▪ Ultrasuoni

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE - calore

▪ Sterilizzante maggiormente utilizzato in ambito ospedaliero: tecnica indicata per la maggior

parte dei materiali, eccetto i termosensibili, le sostanze chimiche tossiche o volatili

▪ Esistenza di una temperatura massima di crescita specie/ceppo-specifica

▪ L’effetto letale indotto dal calore consiste nella DENATURAZIONE (alterazione strutturale e

funzionale) delle macromolecole (proteine enzimatiche):

▪ ossidazione (calore secco)

▪ coagulazione (calore umido)

▪ Letalità = k x temperatura

Sterilizzazione

Sensibilità dei microrganismi al calore

Parametri che caratterizzano la termosensibilità di un microrganismo:

▪ Punto di inattivazione termica (Thermal Death Point, TDP):

la più bassa temperatura alla quale tutti i batteri in coltura liquida

vengono uccisi entro 10 minuti.

▪ Tempo di inattivazione termica (Thermal Death Time, TDT):

tempo richiesto per l’uccisione, ad una data temperatura, della totalità

dei batteri in coltura liquida.

▪ Tempo di riduzione decimale (Decimal Reduction Time, DRT):

tempo richiesto per l’uccisione, ad una data temperatura, del 90% della

popolazione batterica (utile soprattutto nell’industria alimentare).

Sterilizzazione

Sensibilità dei microrganismi al calore

Tempo di riduzione decimale (Decimal Reduction Time, DRT)riduzione pari

ad 1 log10

(http://www.ceaedizioni.it/pdf/13217anteprima.pdf)

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – calore umido: autoclave

▪ Autoclave: camera a pressione che utilizza vapore saturo (privo di aria) al quale si applica una pressione

per ottenere elevate temperature. L’aria può essere rimossa dalla camera per gravità o tramite prevuoto.

▪ Meccanismo di azione: coagulazione irreversibile e denaturazione delle proteine.

▪ Tecnica di sterilizzazione di uso più frequente: rapida, dotata di elevata capacità di penetrazione

(prodotti confezionati, lume di strumenti cavi), scarsamente influenzata dalla presenza di materiale

organico/inorganico.

▪ Impiego:

▪ adatta per: materiali termostabili e resistenti al vapore (es. attrezzatura per terapia respiratoria ed

anestesia), terreni di coltura, rifiuti infettivi, contenitori di oggetti pungenti/taglienti

▪ non adatta per: chimici tox e/o volatili, radioisotopi, agenti antineoplastici

Sterilizzazione


Autoclave «gravity displacement»: struttura e funzionamento

All’interno della camera, l’aria può essere rimossa per:

▪ gravità: vapore immesso nella parta alta della camera;

poichè vapore più leggero dell’aria, questa viene rimossa

nel fondo della camera attraverso uno scarico. Utilizzata

primariamente per terreni di coltura, acqua, prodotti

farmaceutici, rifiuti medicali, oggetti non porosi (la cui

superficie entra a diretto contatto con il vapore); nel caso

di oggetti porosi, bisogna aumentare il tempo a causa

della incompleta eliminazione di aria.

▪ pre-vuoto: dotata di una pompa a vuoto (eiettore) che

garantisce la rimozione dell’aria dalla camera prima che il

vapore venga immesso. Il principale vantaggio consiste

nella istantanea penetrazione del vapore anche in oggetti

porosi o carichi che possano creare “sacche” d’aria.

Sterilizzazione


Il ciclo di sterilizzazione «classico» di un trattamento in

autoclave prevede: 121°C, 15 min, 1 atm.

Tuttavia, il ciclo può essere personalizzato in base alla

tipologia di materiale, al «carico» (quantità di materiale in

autoclave) ed alla tecnica utilizzata (gravity vs dynamic).

Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities (CDC, 2008)

Sterilizzazione


Autoclave da banco

Autoclave da pavimento

Sterilizzazione


La autoclave è generalmente dotata di un sistema di controllo real-time per la

temperatura, il tempo e la pressione.

Tuttavia, l’efficacia del ciclo di sterilizzazione viene monitorata mediante

indicatori chimici o biologici:

▪ indicatori chimici, vengono applicati alla superficie della confezione del

prodotto oppure si trovano integrate nella confezione stessa, per monitorare

la temperatura.

▪ indicatori biologici, sospensioni di spore di Geobacillus stearothermophilus

consentono di monitorare il raggiungimento dei 3 parametri.

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – calore secco

▪ Forno Pasteur, becco Bunsen, inceneritore

▪ Distruzione ossidativa delle proteine

▪ Tecnica non tossica per l’operatore e per l’ambiente

▪ Meno efficace del calore umido e richiede tempi e temperature maggiori (maggiore tempo

per trasferimento stessa quantità di calore da aria a prodotto vs quanto accade in autoclave)

▪ Utilizzabile per materiali termostabili, quelli danneggiati dal vapore (formazione di ruggine

e perdita del «filo» di taglio) o ad esso impermeabili:

▪ olii, polveri, oggetti taglienti, vetreria

▪ rifiuti infettivi (alternativa all’autoclave)

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – calore secco

Forno Pasteur, cicli di sterilizzazione:

▪ 180°C, 30 min

▪ 171°C, 60 min

▪ 160°C, 120 min

▪ 149°C, 150 min

▪ 141°C, 180 min

▪ 121°C, 12 h[processo meno efficace vs

autoclave: 121°C, 15 min]

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – filtrazione

Generalmente considerata una tecnica di sterilizzazione, la filtrazione è in realtà una tecnica

di decontaminazione in quanto:

▪ rimuove “meccanicamente” i microrganismi da soluzioni e gas (aria), non uccidendoli;

▪ non è in grado di rimuovere i microrganismi di piccolissime dimensioni (virus, micoplasmi)

Nella filtrazione si utilizzano filtri (nitrato od acetato di cellulosa) i cui pori hanno un

diametro (0.22 µm) inferiore alle dimensioni medie di gran parte dei microrganismi, eccetto

quelli di dimensioni assai ridotte (d<0.22 µm), quali virus e micoplasmi.

Utilizzata per prodotti termolabili che non possono essere sterilizzati in altro modo:

▪ terreni e supplementi (enzimi, siero, antibiotici) per crescita microbica e colture cellulari

▪ filtri HEPA (cabine biohazard, camere bianche o cleanroom) nel laboratorio biomedico,

nell’industria alimentare e farmaceutica (farmaci, vaccini)

▪ purificazione H2O

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – filtrazione di liquidi

Filtrazione di piccoli volumiFiltrazione di grandi volumi

filtrazione

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – filtrazione di gas

«High-efficiency particulate air» (HEPA) filter

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – onde elettromagnetiche

Tipologia di radiazioni utilizzata per il controllo dei microrganismi:

▪ Radiazioni IONIZZANTI (raggi γ, raggi X)

▪ Radiazioni NON IONIZZANTI (raggi UV)

Sterilizzazione


RADIAZIONI IONIZZANTI = radiazioni elettromagnetiche a corta λ (alta energia): raggi γ (Cobalto-60), raggi X,

elettroni (acceleratori elettronici).

Meccanismo di azione: effetto letale per azione ionizzante (dislocazione di e- da atomi) sulla molecola bersaglio:

▪ diretta: trasferimento di energia a biopolimeri (DNA, proteine), causandone la rottura

▪ indiretta: diffusione di radicali liberi (OH•, e-, H•), denaturanti il DNA

Applicazioni: i costi elevati ne limitano l’utilizzo a processi industriali (su «larga scala»):

▪ strumentazione (chirurgica) e dispositivi medicali monouso (aghi, siringhe, cateteri, guanti)

▪ industria farmaceutica: antibiotici, vaccini, pomate

▪ tessuti per trapianto (valvola cardiaca, tendine, pelle)

▪ rifiuti sanitari (fascio elettronico)

▪ industria alimentare: carne fresca (OMS) o carne tritata (FDA)

Svantaggi:

▪ costi elevati

▪ penetrano nei tessuti

▪ mutagene per l’uomo

Sterilizzazione


Sensibilità alle radiazioni di alcuni microrganismi e funzioni biologiche:

D10: quantità di radiazioni necessaria per ridurre di 10 volte la popolazione (o l’attività) iniziale.

Gray (Gy): dose di radiazione assorbita (1 Gy = 100 rad), dove: 1 rad = 100 erg/g.

Dose letale = 12 x D10

Specie/funzioni Tipologia D10 (Gy)

Clostridium botulinum Gram+, sporigeno 3.300

Salmonella typhimurium Gram- 200

Aspergillus niger Muffa 500

Saccharomyces cerevisiae Lievito 500

Herpes simplex virus-I (afta) Virus 13.000

Inattivazione enzimatica 20.000-50.000

Sterilizzazione


RADIAZIONI ULTRAVIOLETTE (UV):

▪ onde elettromagnetiche (λ=220-300 nm) prodotte dal passaggio di corrente elettrica attraverso vapori a

bassa pressione di Hg contenuti all’interno di speciali tubi in vetro.

▪ assorbiti dagli acidi nucleici (Amax=269 nm) e dalle proteine (Amax=280 nm).

Meccanismo di azione: danno cellulare (letale) per formazione di dimeri pirimidinici (T-T) che interferiscono

con la replicazione del DNA (effetto mutageno). Max effetto letale a 260 nm.

Applicazioni:

▪ decontaminazione di superfici, aria, acqua in ambienti confinati

▪ limita la quantità di amplificati (PCR) sulle superfici

▪ sterilizzazione “a freddo” di composti chimici, materiali plastici ad uso farmaceutico, siero per colture cellulari

Fattori critici:

▪ scarsa penetrazione (non penetra carta, vetro, indumenti), distanza minima sorgente UV – materiale trattato

▪ intensità della luce (sostituzione ogni 8.000 h)

▪ dipendenza da ambiente (umidità relativa) e specie microbica

▪ mutagena per l’uomo (cute, occhi)

Sterilizzazione


Sterilizzazione mediante UV di:

A) superfici confinate (interno di una cabina di

sicurezza biologica);

B) strumentazione chirurgica;

C) aria in ambienti confinati;

D) prodotti farmaceutici/di laboratorio.

A B

C D

Sterilizzazione


INFRAROSSI: onde di lunghezza d'onda compresa tra 700 nm e 1 mm

▪ Tecnica rapida, a basso consumo energetico, non produce residui tossici per l’ambiente.

▪ Possibile impiego per la sterilizzazione di strumenti termoresistenti, ma ad oggi non

esiste un sistema approvato per l’utilizzo in ambito sanitario.

MICROONDE: onde a frequenza radio (λ = 2450 MHz)

▪ Meccanismo di azione: producono attrito tra molecole di H2O in un campo elettrico

alternato; l’attrito produce calore con conseguente effetto letale.

▪ Applicazioni:

▪ disinfezione di prodotti termoresistenti: strumentazione odontoiatrica, lenti a

contatto, dentiere, latte, cateteri urinari (autocateterismo intermittente).

Sterilizzazione

Tecniche FISICHE – ultrasuoni

Energia ultrasonica a bassa frequenza ed energia in grado di inattivare, per cavitazione, i microrganismi

in sospensioni acquose

▪ I sonicatori non vengono considerati alla stregua di sterilizzatori, tuttavia:

▪ la combinazione ultrasuoni + trattamento chimico può avere effetto letale

Sterilizzazione

Tecniche CHIMICHE

ACIDO PERACETICO (perossido di idrogeno)

▪ agente ossidante

▪ immersione (0.2% per 15 min a 50°C)

▪ micronizzato: industria alimentare, strumenti chirurgici

▪ efficace in presenza di materiale organico

▪ produce prodotti finali non tox (acido acetico + O2)

GLUTARALDEIDE

▪ agente alchilante (aggiunta di –CH3, -CH2CH3)

▪ immersione (soluzione al 2%), tempi lunghi (90 min; 20°C)

▪ impiegata per materiale medico-chirurgico e preparazione di vaccini

▪ efficace in presenza di materiale organico

▪ il suo impiego è associato a rischio occupazionale (irritazione mucose respiratorie, dermatite da contatto)


Caratteristiche dei principali sterilizzanti chimici

Sterilizzazione

Tecniche CHIMICO-FISICHE

OSSIDO DI ETILENE (ETO)

▪ Alchilazione di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, fenolici, idrossilici) di proteine,

DNA, RNA

▪ Sterilizzazione di materiale/strumentazione sensibile ad alte temperature o calore umido

▪ 12% ETO + 88% Freon (oppure CO2, N2)

▪ L’utilizzo deve essere regolamentato: ETO è infiammabile/esplosivo, carcinogeno e

mutageno

FORMALDEIDE

▪ Agente alchilante

▪ Vaporizzazione 2-5% formaldeide in presenza di vapor acqueo a 60-80°C

▪ Impiegata per sterilizzare filtri HEPA

▪ Irrita le mucose, carcinogena

▪ “Tracce” residue in materiale polimerico (cellulosa, gomma): richiede lavaggio post-

trattamento

Sterilizzazione

Tecniche CHIMICO-FISICHE

PLASMA GAS

▪ Applicazione di energia (radio-frequenza) ad una camera contenente vapori

di H2O2. La temperatura non eccede i 40°C, ma la necessità di vuoto può

deformare la superficie del materiale

▪ La produzione di radicali liberi causa inattivazione microbica

▪ Applicata ad apparecchiature mediche (quando calore o ETO non

appropriati)

▪ Necessita di un’accurata pulizia del materiale da trattare

▪ Non efficace su metalli, cellulosa

Tecniche di sterilizzazione

Pros & cons


Sterilizzazione

Fattori critici per l’efficacia


Sterilizzazione

Caratteristiche di una tecnica «ideale»

Attività: battericida, tubercolicida, fungicida, sporicida, virucida

Rapidità di azione: sterilizzazione raggiunta in breve tempo

Penetrazione: capacità di penetrare nel materiale trattato o nella confezione in cui esso è contenuto

Compatibilità: non causa rilevanti cambiamenti strutturali o funzionali del materiale in seguito a

ripetuti trattamenti

Atossicità: sicuro per l’operatore e l’ambiente

Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in presenza di materiale organico

Costo-efficacia: costi ragionevoli per attrezzatura, installazione ed utilizzo

…in altre parole:

non esiste una

tecnica di sterilizzazione IDEALE !

Disinfezione

da: Murray et al. Medical Microbiology 3rd ed., Mosby, 1998

La disinfezione di un prodotto o di una superficie può essere

ottenuta mediante l’impiego di tecniche:

▪ FISICHE

▪ CHIMICHE

Disinfezione

Meccanismo di azione

I disinfettanti causano la morte dei microrganismi mediante differenti meccanismi:

▪ Denaturazione delle proteine (formaldeide, glutaraldeide, ossido di etilene, propriolattone)

▪ Ossidazione di enzimi (perossidi, permanganati, cloro, ipocloriti, iodio)

▪ Alterazione delle membrane (alcooli, fenoli, composti dell’ammonio quaternario, clorexidina)

Disinfezione

Tecniche FISICHE

CALORE UMIDO

Ebollizione (100° C): inattivazione delle forme vegetative e virali entro 10 minuti.

Pastorizzazione:

▪ tecnica ideata da Pasteur per conservare il vino previo riscaldamento a 60°C.

▪ riduce la carica microbica (Salmonella typhi, Escherichia coli O157:H7, Mycobacterium tuberculosis,

Brucella spp, Coxiella burnetii) presente nel latte (ed in altri alimenti deperibili) senza alterarne le

caratteristiche organolettiche:

▪ pastorizzazione di massa: 63-66°C, 30 min

▪ pastorizzazione istantanea (HTST): 71°C, 15 sec

▪ pastorizzazione “ultra-high-temperature” (UHT): 140°C, 1-3 sec

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

ALDEIDI (formaldeide, glutaraldeide).

Dotate di rilevante attività mediante alchilazione dei gruppi polari funzionali

(amminici, idrossilici, fenolici) delle proteine.

Formaldeide:

▪ 37% (formalina), utilizzato come sterilizzante: per fissazione campioni biologici

e preparazione di vaccini.

▪ 3-8%, usato come disinfettante.

▪ irrita le mucose, cancerogeno, forte odore.

Glutaraldeide:

▪ 2% (Cydex): battericida, tubercolicida, fungicida, virucida (10 minuti); sporicida

(3 - 10 ore).

▪ disinfezione strumentazione ospedaliera (termosensibile: endoscopi, superfici

abiotiche).

▪ meno irritante e più efficace della formaldeide.

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

AGENTI OSSIDANTI (perossido di idrogeno, acido peracetico).

Formazione di radicali ossidrilici (OH•) in grado di ossidare sistemi enzimatici “critici” per il microrganismo.

Battericidi, fungicidi, virucidi, sporicidi:

▪ H2O2 (come antisettico, non per ferite aperte).

▪ acido peracetico (come sterilizzante di strumentazione e matrici alimentari): battericida e fungicida (5

min), virucida e sporicida (30 min).

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

ALCOOLI (etanolo, isopropanolo).

Ad alte concentrazioni, danneggiano la membrana citoplasmatica mediante:

▪ denaturazione (coagulazione) delle proteine.

▪ solubilizzazione dei lipidi.

Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi:

▪ attività influenzata dalla presenza di materiale organico

▪ particolarmente attivi verso virus dotati di peplos (involucro di natura lipidica)

▪ isopropanolo più efficace dell’etanolo

Utilizzati in soluzione acquosa al 60-85% come:

▪ antisettici (non per ferite aperte), sebbene alto potere disidratante

▪ disinfettanti (soluzione acquosa): superfici ben ventilate e lontane da fiamme.

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

FENOLI e DERIVATI FENOLICI (fenolo, fenilfenolo, esaclorofene).

Lord Joseph Lister (1827 - 1912), medico e professore di chirurgia inglese, fu l'inventore

e il propugnatore del metodo dell'antisepsi rivoluzionando l'atteggiamento e l'approccio

dei chirurghi alla pratica operatoria.

Fenolo (Lister): tossico, corrosivo, carcinogenico.

Derivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo, alchil, benzil, phenyl, amil) a

sostituzione di un H dell’anello aromatico.

Distruzione della membrana plasmatica mediante denaturazione proteica.

Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi:

▪ 2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi).

▪ attività persistente e non influenzata dalla presenza di materiale organico.

▪ O-phenylphenol (Lysol), Irgasan.

▪ esaclorofene (Phisohex): elevata efficacia vs cocchi Gram+, strumenti chirurgici.

http://www.bumc.bu.edu/Departments/PageMain.asp?Page=1727&DepartmentID=69

http://www.healthmedialab.com/infectious/image129.htm

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

ALOGENI (ioduri, cloruri, bromuri, fluoruri).

Eliminazione di gruppi S-H per:

▪ ossidazione: formazione di ponti di-sulfidrilici inattivi

▪ combinazione: ione metallico “sottrae” SH liberi

Battericidi, fungicidi, virucidi, si usano in combinazione con metalli per ridurne la

tossicità, instabilità e corrosività.

Ioduri:

▪ soluzione alcolica: tintura di iodio

▪ iodofori: PVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico

Cloruri:

▪ disinfezione di acqua, piscine, acque di scarico

▪ Cl + p-toluene-sulfonamide (cloramina T)

▪ 1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischio ematogeni

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

COMPOSTI DELL’AMMONIO QUATERNARIO (QUATs: benzalconio cloruro, cetrimide, clorexidina).

Detergenti cationici, derivati da modificazioni di NH4+.

Distruzione di membrana cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione (coagulazione) proteica.

Batteriostatico (-cida ad elevate concentrazioni), sporostatico, fungistatico, virustatico:

▪ scarsamente attivi vs Gram-: frequenti infezioni da Pseudomonas spp QUATs-resistenti

▪ neutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti anionici

▪ non corrosivi, non tossici, stabili, inodori.

Zephiran (benzalconio cloruro), cetrimide, clorexidina.

Disinfezione

Tecniche CHIMICHE

METALLI PESANTI (Ag, Hg, Se, Zn).

Eliminazione di gruppi S-H (in combinazione con un alogeno)

L’impiego è fortemente limitato per tossicità ed inquinamento ambientale:

▪ 1% nitrato di Argento (preparati oftalmici, utilizzati negli infanti per prevenzione gonorrea

oftalmica).

▪ composti organici del Mercurio: mercurocromo, mertiolato (disinfezione cutanea).

▪ Selenio: vs fungi e spore fungine.

▪ Zinco: cloruro- (collutori per la disinfezione del cavo orale) e ossido- (antifungino).

▪ solfato di Rame (piscine e laghi)

Disinfezione

Corretta igiene delle mani

Il Ministero della Salute stima che in Italia ogni anno si verificano 450.000 - 700.000 infezioni in pazienti ricoverati

(complessivamente il 4,5-7% dei ricoveri), il 30% circa delle quali prevenibili.

La cute ed i guanti possono essere veicolo di contaminazione per batteri (stafilococchi, enterococchi, clostridi, P.

aeruginosa, enterobatteri, etc.) e virus (rhinovirus, virus parainfluenzale, virus respiratorio sinciziale, etc.).

IL LAVAGGIO DELLE MANI RAPPRESENTA LA PRINCIPALE MISURA DI CONTROLLO DELLA DIFFUSIONE

DELLE INFEZIONI IN AMBITO SANITARIO.

“Un rigoroso intervento sul lavaggio delle mani è in grado di prevenire circa il 40% di tutte le infezioni nosocomiali”

(Center for Diseases Control – Atlanta, USA)

L’igiene delle mani deve essere altresì intesa anche quale misura di protezione dell’operatore.

Igiene delle mani in ambito sanitario

Le mani: efficace «veicolo» di infezioni

La associazione tra igiene delle mani e la trasmissione delle malattie venne stabilita dagli studi di

Ignaz Semmelweis, a Vienna, e di Oliver Wendell Holmes, a Boston.

Semmelweis nel 1847 dimostrò che il tasso di mortalità (febbre puerperale da streptococchi) tra le

madri che partorivano alla Prima Clinica Ostetrica dell'Ospedale Generale di Vienna era

significativamente inferiore quando il personale effettuava il lavaggio delle mani con un agente

antisettico (cloruro di calcio) rispetto ai lavaggi delle mani con acqua e sapone semplice.



Nel 1938 Price stabilì che i batteri delle mani possono essere suddivisi in due categorie: residenti o transitori. La

composizione quali/quantitativa della flora transitoria e residente variano notevolmente da un soggetto all'altro.

Flo

ra R

ES

IDEN

TE

• Microrganismi residenti sotto lo strato corneo; si

trovano anche alla superficie cutanea

• Composta da batteri (stafilococchi, corineformi

(corinebatteri, propiobatteri, micrococchi) e

funghi (Pityrosporum)

• Duplice funzione protettiva: antagonismo

microbico e competizione per le sostanze

nutrienti nell’ecosistema

• Può provocare infezioni in cavità sterili, occhi o

cute non intatta

Flo

ra T

RA

NS

ITO

RIA

• Colonizza gli strati superficiali della cute

• I microrganismi non si replicano ma

sopravvivono. Pertanto, vengono rimossi più

facilmente con i lavaggi routinari delle mani.

• Causa di infezioni associate all’assistenza:

contratti dal personale sanitario tramite

contatto con i pazienti e/o superfici ambientali

contaminate.

• Le mani di alcuni operatori possono essere

costantemente colonizzate da MRSA, Gram-

negativi o lieviti (Candida)

• La trasmissibilità dipende da: numero

microrganismi, specie, umidità della cute.



FLORA BATTERICA PRESENTE SULLA CUTE

La cute umana normale è colonizzata da batteri, con conte totali di batteri aerobi

variabili:

▪ 1.000.000 cellule/cm2 sul cuoio capelluto

▪ 500.000 cellule/cm2 nell'ascella

▪ 40.000 cellule/cm2 sull'addome

▪ 10.000 cellule/cm2 sull'avambraccio.

Le conte batteriche totali sulle mani del personale ospedaliero oscillano tra 40.000 a 4.600.000 cellule/cm2



TRASFERIMENTI DURANTE LA ATTIVITA’ LAVORATIVA

Le mani degli operatori sanitari vengono contaminate nel corso di attività

"pulite", quali sollevare i pazienti, misurare il polso, la pressione sanguigna o la

temperatura, oppure toccando la mano, la spalla o l'inguine del paziente.

I guanti risultano essere altamente colonizzati a seguito di contatto con

differenti siti corporei, in particolare l’area inguinale.

Studi relativi alla contaminazione delle mani del personale sanitario prima e dopo il contatto diretto con il paziente,

la medicazione di ferite, la gestione di cateteri intravascolari, l’assistenza respiratoria o la manipolazione delle

secrezioni dei pazienti, hanno evidenziato che il contatto diretto con il paziente e l’assistenza respiratoria sono

risultate essere le attività che provocavano la più elevata contaminazione delle dita degli operatori.


Tecniche per la disinfezione delle mani

1. LAVAGGIO NORMALE = azione di igienizzazione delle mani al fine di rimuovere

fisicamente o meccanicamente lipidi, sporco aderente, terra e varie sostanze organiche.

Si effettua mediante utilizzo di detergenti, composti (tensioattivi) che presentano un'azione

detergente. Generalmente indicati con il termine "sapone semplice», non sono dotati per se di

attività antimicrobica, ma facilitano la rimozione meccanica (per sfregamento) della flora

transiente (circa 80%). Degradano la pellicola idrolipidica sopracutanea (emulsificazione).

Occasionalmente, i saponi semplici possono contaminarsi, provocando la colonizzazione

delle mani degli operatori sanitari con bacilli Gram-negativi. E’ consigliabile l’impiego di

dispenser. Tuttavia, il pericolo concreto di trasmettere microrganismi tramite il lavaggio con

saponette già utilizzate è irrilevante.

La decontaminazione delle mani può essere ottenuta mediante lavaggio normale oppure lavaggio antisettico



2. LAVAGGIO ANTISETTICO = si utilizza una soluzione/gel per frizioni ad azione antisettica,

oppure il lavaggio con acqua e antisettico, al fine di ridurre la flora transitoria e con minimo

effetto su quella residente.

A. La frizione antisettica si effettua mediante prodotti a base alcolica (60-80% etanolo od

isopropanolo in formulazione liquida, gel o schiuma). Non richiede l'utilizzo di fonti idriche

esogene. Dopo l'applicazione, si procede a strofinare le mani l'una contro l'altra fino a che

l'agente non sia asciutto.

Grazie alla loro azione denaturante sulle proteine, gli alcoli presentano un'eccellente attività

verso batteri (inclusi i patogeni antibiotico-resistenti MRSA e VRE), M. tuberculosis, virus

(herpes simplex, HIV, influenza, RSV) e diversi funghi.

Non presentano, tuttavia, alcuna attività rispetto alle spore batteriche od alle cisti dei

protozoi, ed un'attività ridotta sui virus privi di involucro (rotavirus, adenovirus, enterovirus).

Gli alcoli non sono buoni agenti detergenti e se ne sconsiglia l'uso in caso di mani sporche o

visibilmente contaminate con materiali proteici (es. sangue). E’ possibile, sebbene rara, la

contaminazione delle soluzioni a base alcolica (spore di Bacillus cereus).



B. Il lavaggio antisettico si avvale dell’impiego dei un sapone contenente un agente antisettico, sostanza

antimicrobica che riduce o inibisce la crescita dei microrganismi sui tessuti viventi (alcool, gluconato di clorexidina,

derivati del cloro, iodio, cloroxilenolo, composti dell’ammonio quaternario, triclosan).

Clorexidina: attività antimicrobica (attribuibile alla rottura delle membrane citoplasmatiche) inferiore a quella degli

alcoli. Dimostra una buona attività contro i batteri Gram-positivi, inferiore contro i batteri Gram-negativi e i funghi,

ed un'attività minima contro i micobatteri. La clorexidina non è sporicida. Ha invece un'attività in vitro rispetto ai

virus lipofili, ma meno marcata rispetto ai virus privi di involucro. L'attività non viene compromessa dalla presenza

di materiale organico, come il sangue.

Composti dell’ammonio quaternario (alchil-benzalconio cloruro): principalmente batteriostatici e fungistatici, sono

più attivi contro i batteri Gram-positivi rispetto ai bacilli Gram-negativi. Hanno un'attività relativamente debole

verso micobatteri e funghi, e presentano un'attività superiore contro i virus lipofili. La loro attività antimicrobica

viene influenzata negativamente dalla presenza di materiale organico. Causa la ridotta attività contro i batteri Gram-

negativi, sono frequentemente soggetti a contaminazione.


Tecnica di lavaggio delle mani

bagnare

uniformemente le

mani

erogare sulle mani il

prodotto antisettico,

premendo con il

gomito la leva del

dispenser

sfregare

vigorosamente le

mani l’una con l’altra

sfregare il palmo

destro sul dorso della

mano sinistra e

viceversa

sfregare i palmi tra di

loro con le dita

intrecciate

lavare gli spazi sub-

ungueali, utilizzando

uno spazzolino

preventivamente

bagnato e cosparso di

una dose di

antisettico

assicurarsi che i pollici

tocchino i polsi

dell’una e dell’altra

mano

decontaminare la

punta delle dita,

sfregandole contro il

palmo dell’altra mano

massaggiare

vigorosamente la

parte superiore delle

dita nel palmo

dell’altra mano con le

dita intrecciate

risciacquare, avendo

cura di evitare il

ruscellamento di

acqua dagli

avambracci alle mani

chiudere il rubinetto

(pedale, gomito o

punta delle dita)

asciugare, con

movimenti circolari, le

singole dita, quindi le

restanti porzioni delle

mani

Il lavaggio completo richiede circa 60 secondi

La frizione antisettica richiede circa 30 secondi


Sapone: meccanismo di azione

▪ I saponi agiscono alla stregua di surfattanti, molecole polari

con estremità idrofobiche ed idrofiliche.

▪ Possono legarsi al doppio strato lidico, distruggendolo,

aumentando in tal modo la permeabilità di membrana.


«Inadeguato» lavaggio delle mani

Il lavaggio delle mani viene spesso effettuato in maniera inadeguata: ridotto tempo di lavaggio, utilizzo di prodotti

inadatti, tecnica errata.

Pertanto, a seguito di un lavaggio «inadeguato» numerosi siti possono risultare ancora contaminati e, quindi,

ancora potenzialmente «utili» al trasferimento di microrganismi.

Disinfezione

Fattori critici

Ambiente:

▪ temperatura: optimum: 20-37°C. Una diminuzione della temperatura riduce l’efficacia. Un aumento pari a 10°C

determina un aumento 2x della velocità di azione

▪ pH del mezzo in cui deve agire il disinfettante

Materiale:

▪ natura del materiale (porosità)

▪ presenza di materiale organico (sangue, pus, vomito, feci)

▪ inattivazione principio attivo

▪ rivestimento della superficie batterica

▪ adsorbimento (eliminazione) del principio attivo

Disinfettante:

▪ concentrazione del principio attivo

▪ tempo di applicazione (contatto con materiale)

▪ qualità acqua per diluizione disinfettante

Disinfezione

Fattori critici

Microrganismo:

▪ tipologia

▪ i batteri Gram-negativi (presenza della membrana esterna) sono generalmente più resistenti dei Gram-

positivi ai disinfettanti ed antisettici.

▪ micobatteri, endospore e cisti protozoarie sono molto resistenti ai disinfettanti ed antisettici.

▪ i virus sprovvisti di envelope (rivestimento di natura lipidica) sono generalmente più resistenti a

disinfettanti ed antisettici rispetto ai virus con envelope.

▪ carica microbica: la attività di un disinfettante è inversamente proporzionale alla concentrazione microbica.

▪ organizzazione

▪ presenza di biofilm: comunità cellulare multistratificata sessile in cui gli elementi cellulari sono immersi in

una matrice polisaccaridica (slime) di derivazione batterica. La matrice potrebbe influenzare l’attività del

disinfettante o inattivandolo interagendo chimicamente con esso o rallentandone la diffusione attraverso

gli strati cellulari più profondi.

Disinfezione

Caratteristiche «ideali» di un disinfettante

▪ Attività: esteso spettro di azione (battericida, fungicida, sporicida, tubercolicida, viricida)

▪ Rapidità di azione: breve “tempo minimo di applicazione” (1-10 minuti)

▪ Atossicità: non irritante per occhi, mucose, cute

▪ Non deve possedere capacità tintoriali

▪ Non corrosivo

▪ Stabilità: per diluizioni e tempi consigliati (anche in presenza di materiale organico)

▪ Buona capacità di penetrazione e detersione

▪ Costi: ragionevoli (economicità)

…in altre parole:

non esiste una

tecnica di disinfezione IDEALE !

Tecniche di sterilizzazione/disinfezione

Criteri per la scelta

Un approccio conveniente è quello suggerito da

Spaulding, applicato nelle linee-guida U.S.

Gli oggetti sono classificati, sulla base del loro impiego,

come:

▪ critici

▪ semi-critici

▪ non critici

I relativi livelli di disinfezione sono:

▪ elevato (High Level of Disinfection, HLD)

▪ intermedio (Intermediate Level of Disinfection, ILD)

▪ basso (Low Level of Disinfection, LLD)

ele

va

ta S

ba

ssa

S Alto livello di

disinfezione

Basso livello di

disinfezione

Livello intermedio

di disinfezione


Criteri per la scelta – trattamento di oggetti «critici»

Oggetti “critici” = quelli collegati ad un alto rischio di trasmettere infezione, qualora vengano contaminati da

microrganismi, ivi incluse le spore batteriche:

▪ a contatto con tessuti viventi fisiologicamente sterili

▪ inseriti nel sistema vascolare (strumentazione chirurgica, protesi, aghi, cateteri urinari/cardiaci,

artroscopi, etc).

Obiettivo: inattivazione forme vegetative e sporali (sterilità).

Metodo: sterilizzante

▪ fisico (vapore)

▪ chimico (glutaraldeide 2%, perossido di idrogeno 6%, acido peracetico)

▪ chimico-fisico (ETO, plasma gas)


Criteri per la scelta – trattamento di oggetti «semi-critici»

Oggetti “semi-critici” = quelli che vengono a contatto con le mucose o con la cute integra (endoscopi,

termometri, vasche per idroterapia, attrezzatura per terapia respiratoria/anestesiologica).

Obiettivo: Inattivazione delle forme vegetative. E’ tollerabile la presenza di spore in quanto le mucose intatte

sono generalmente resistenti all’infezione.

Metodo: High or Intermediate Level of Disinfection (HLD, ILD)

▪ glutaraldeide

▪ perossido di idrogeno

▪ perossido di idrogeno + acido peracetico

▪ cloro

▪ composti fenolici

▪ iodofori


Criteri per la scelta – trattamento di oggetti «non critici»

Oggetti “non critici” = quelli che vengono a contatto con la cute intatta ma non con le mucose

(strumentazioni mediche, superfici ambientali, suppellettili del paziente: padelle, bracciali per la misurazione

della pressione sanguigna, stetoscopi, stampelle, sbarre per i letti, biancheria, alcuni tipi di posate o stoviglie,

comodini e arredi dell’unità del paziente).

Obiettivo = basso grado di contaminazione; la cute intatta, infatti, agisce come un’efficace barriera contro la

maggior parte dei microrganismi, e la sterilità di questi oggetti non è richiesta.

Metodo: Low Level of Disinfection (ILD, LLD)

▪ alcool etilico

▪ ioduri

▪ composti dell’ammonio quaternario

▪ fenoli


Criteri per la scelta

http://www.asl.pavia.it/webasl/UffEdSan.nsf/risRicDom/29979FA2AB0E7B00C1256E14004F2A6D/$File/Protocollo%20Disinfettanti%20.pdf

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E’ possibile utilizzare il materiale solo per motivi personali e non commerciali, purché ogni copia di questo materiale preservi tutti i diritti di copyright e di proprietà intellettuale, sempre a seguito di formale richiesta rivolta all’Autore (Prof. Giovanni Di Bonaventura; [email protected])

Controllo biologico dei microrganismi

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