Considerazione strategiche 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione...

Considerazione strategiche

2. Scelta del sistema cellulare

3. Scelta della tecnica di transfezione

4. Metodo di selezione delle cellule transfettate

1. Scelta del vettore


2. Efficienza di transfezione

3. Modificazioni post-traduzionali

4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica

5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

1. Facilità di coltura e stabilità


Microiniezione

Adsorbimento mediante DEAE-Destrano

Coprecipitazione con calcio fosfato

Lipofezione

Elettroporazione

Infezione con vettori virali

Microiniezione

Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo)

Impossibile applicazione su larga scala

Grande manualità dell’operatoreApplicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)

Microiniezione

Adsorbimento mediante DEAE-Destrano

Formazione di aggregati di DNA (-) e DEAE-destrano (+)

Deposizione sulla membrana cellulare

Internalizzazione per endocitosi

Scarsa efficienza

Elevata degradazione del DNA, scarsa penetrazione nel nucleoUtilizzato in cellule con elevata attività endocitotica

DNA-DEAE Destrano-TBS

Coprecipitazione con calcio fosfato

La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-

DNA sulla superficie cellulare favorisce

l’internalizzazione dell’acido nucleico

Buona efficienza (5-40%)

Semplice esecuzionePiuttosto riproducibile

Tossicità cellulare

DNA+CaCl2 HEPES

Coprecipitazione

Lipofezione

Trasferimento di DNA mediato da liposomi

In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA

La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol

Buona efficienza Scarsa citotossicità

Riproducibilità

DNADNA

Lipofezione con reagenti lipidici neutri

I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che

possono essere riempite con DNA. Esse fondono

spontaneamente con le membrane cellulari rilasciando il loro contenuto nel citoplasma.

Sono disponibile commercialmente dei kit per la

semplice preparazione dei liposomi.

Lipofezione con reagenti lipidici cationici

Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli (100-400nm) liposomi unilamellari. La superficie

carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente “incapsulato” nel liposoma ma piuttosto

legato alle sue superfici.

Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi.

L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.LIPOFECTAMINETM

OLIGOFECTAMINETM

CELLFECTINTM

Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati

Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono un’architettura sferica, che si ramifica

radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati.

Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula.

Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente tampona il pH del

lisosoma riducendo la degradazione del vettore.

Elettroporazione

Un campo elettrico altera la permeabilità di membrana e permette l’ingresso al DNA.

Non c’è endocitosi

Minore esposizione alle

nucleasi

Buona efficienza

Elevata citotossicità

Adatto a cellule con membrane particolarmente resistentiAdatta a cellule in sospensione

Elettroporazione

Le cellule vengono concentrate, miscelate con il DNA da

transfettare e collocate in una cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre

in maniera reversibile dei “buchi” nelle membrane

cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono piastrate in

terreno fresco.

Infezione con vettori virali

I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle cellule in maniera efficiente e specifica

Infezione Iniezione del DNA Replicazione

Sintesi del capsideAssemblaggio

Lisi

Il genoma virale deve essere modificato

Inserimento del gene di interesse

Eliminazione dei “late genes”, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata

Per la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus “helper” oppure “packaging cell lines”.

Packaging cell lines

Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del

capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.

La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del

costrutto nel virione.

Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

Vettori virali

SV40. Il primo. Genoma piccolo ed instabile, solo per cellule di scimmia

Retrovirus. Genoma ad RNA. Integrazione del vettore. Alta efficienza e capacità.

Terapia genica

Baculovirus. Virus degli insetti. Porta all’espressione ed accumulo di grandi

quantità di proteine.

Mutanti virali. Ex. Virus vaccinico iperesprimente la RNA pol T7.

Transfezioni stabili o transienti

Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si

integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi

Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza

di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.

La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle

cellule transfettate

Transfezione stabile

Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle

cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le

cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo

perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di

selezione.

Marcatori di selezione per cellule di mammifero

Tk fosforila la timidina

Aminopterina (Inibisce sintesi

timidina-P)

Timidina chinasi (Tk)

XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico(Inibisce sintesi GMP)

Xantina-guanina fosforibosil

transferasi (XGPRT)

Inattiva Xyl-A9--D-furanosil (Xyl-A) (danneggia

DNA)

Adenosina deaminasi (ADA)

HPH inattiva igromicina

Igromicina B (Inibitore sintesi

proteica)

Igromicina fosfotransferasi (HPH)

Variante resistente DHFR

Metotrexate (Inibisce DHFR)

Diidrofolato reduttasi (DHFR)

APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica)

Aminoglicoside fosfotransferasi (APH)

MECCANISMOFARMACOENZIMA

Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è

praticabile

Timidino chinasi

Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”

L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio

5-fosforibosil-1-pirofosfato

Uridina monofostato

Inosina monofostat

o

Timidina monofostato

AMINOPTERINA

Guanina monofostato

Adenina monofostato

IpoxantinaTimidina

Applicazioni dell’ingegneria cellulare.

RICERCA DI BASE

APPLICAZIONI INDUSTRIALI

Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci

Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans

Analisi struttura funzione delle proteine eucariote

Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Structure of TFMPV-E2/ER ligand-binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron density map, contoured to 1.5 . ER , oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)


RICERCA DI BASE






L’esempio della identificazione di Nip-2 e protimosina

01234567

c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5Ce

ll d

ea

th (

de

ad

ce

lls

/dis

h)x

1

0 2

16 h 24h 48h

0

5

10

15

20

0 1 4 16 24 48

nip

2 m

RN

A

Hours after Locke

bnip-2 expression associates to cell death

• Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2• mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis

Meda et al. 2001

CTRL

BNIP2

BNIP2CTRL

100

75

50

25

BNIP2CTRL

200

150

100

50

CTRL

BNIP2

%su

rviv

al%

pro

lifer

atio

n

0

0

TRANSFECTION OF bnip2 cDNA IN MCF-7 CELLS

Meda et al. 2001


RICERCA DI BASE






Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex

+1

-20-40-60-80-100

GC CCAAT GC TATA

++

++----

Generazione di mutanti

Trascrizione in oociti di Xenopus laevis

+ + + +- - - -

Analisi di Northern


RICERCA DI BASE






Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter

Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione.

Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter.

Questo principio può essere esteso agli animali transgenici

X

Y

Gene reporterPromotore

Elementi di regolazione cis

Z

Elementi di regolazione trans

Proteina facilmente dosabile

I geni reporter

Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione

(non è una reazione enzimatica)

Monomerico, non richiede substrato, assente nei

mammiferi, varianti con diversa di fluorescenza.

Green fluorescent

protein (GFP, varianti RFP,

BFP)

Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari.

Proteina di secrezione, saggio colorimetrico

molto sensibile.

Fosfatasi alcalina (Umana)

Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP.

Alta attività specifica, mancanza di attività

endogena (basso background)

Luciferasi (Lucciola)

Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima

tetramerico (risposta non lineare)

Ben caratterizzata, stabile, rilevazione

automatizzabile

B-Galattosidasi (Batterica)

SVANTAGGIVANTAGGIGENE

http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:GFP_1EMA.jpg

Screening di molecole farmacologicamente attive.

ER cDNA

ERE LUC Potenziali ligandi

CTR CTRE2LU

C

Un

its

LUC

ERER

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine

fluorescenti (GFP e BFP).

Citosol BFP

Golgi GFP

High-throughput Screening (1)

La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”.

Library di molecole

Saggio biologico automatizzabile

Piattaforma Robotizzata

Elaborazione digitale dei

dati

High-throughput Screening (2)

1990. 20 ricercatori

1.5 milioni di molecole/anno

Oggi. 4 ricercatori

2.5 milioni di molecole/anno

I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della

SPECIFICITA’ della sostanza testata.


RICERCA DI BASE






Produzione di biofarmaci

La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-

traduzionali

L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici

strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi

più elevati.

Difficoltà nella produzione di biofarmaciIstituzione di Master cell banks caratterizzate in

dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene.

Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota

Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.Controllo delle condizioni di produzione

Recupero e produzione

Caratterizzazione del prodottoCONTROLLO

QUALITA’

Controllo di qualità di proteine terapeutiche

Spettrometria di massa

Presenza di DNA cellulare

Presenza pirogeni

Presenza di proteine cellulari

Presenza di proteine seriche

HPLC

SDS PAGE/Western

Determinazione dello stato di purezza

Composizione in acido sialico

Composizione in carboidrati

Sequenziamento N-terminale

Mappa peptidica

HPLC

Isoelectrofocusing

SDS PAGE Western

Saggio immunologico

Saggio biologico

Caratterizzazione della proteina

TPA ricombinante

Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero

Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary)

Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini

Assenza di attività tossica per l’uomo

Stabile integrazione di geni eterologhi

Crescita in sospensione o monostrato

Modificazioni post-traduzionali corrette

Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio

BHK (Baby Hamster Kidney

cells)

Fattore VIICHOGlucocerebrosidasiCHOEritropoietinaCHOInterferone betaCHOFSHE.ColiG-CSFE.ColiIL-2E.ColihGHE.ColiInterferone alfaE.ColiInsulina

E.Coli, CHOTPA

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