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Comparación de la Decidualización de células deciduales de mujeres con embarazo normal y células deciduales de mujeres con pre-eclampsia LUIS ALFONSO BOHÓRQUEZ VALERO UNIVERSIDAD DE SANTANDER, FACULTAD DE SALUD PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO BUCARAMANGA 2018
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Comparación de la Decidualización de células deciduales de mujeres con embarazo normal y células deciduales de
mujeres con pre-eclampsia
LUIS ALFONSO BOHÓRQUEZ VALERO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER,
FACULTAD DE SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
BUCARAMANGA
2018
Comparación de la Decidualización de células deciduales de mujeres con embarazo normal y células deciduales de
mujeres con pre-eclampsia
LUIS ALFONSO BOHÓRQUEZ VALERO
TESIS DE GRADO
DIRECTORA: OSMANY BLANCO MUÑOZ
UNIVERSIDAD DE SANTANDER,
FACULTAD DE SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
BUCARAMANGA
2018
TABLA DE CONTENIDO:
Pág.
RESUMEN ............................................................................................................... 7
ABSTRACT ............................................................................................................. 7
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 9
Las Células Deciduales: ..................................................................................... 10
Preclampsia: ....................................................................................................... 13
1. OBJETIVOS ...................................................................................................... 18
1.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................. 18
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................... 18
2. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 19
3. MARCO CONCEPTUAL ................................................................................... 20
3.1. El Endometrio: ............................................................................................. 20
3.2. La Decidualización: ...................................................................................... 20
3.3. La decidua: .................................................................................................. 23
3.4. La placenta: ................................................................................................. 23
3.5. La progesterona:.......................................................................................... 24
3.6. El AMPc: ...................................................................................................... 25
3.7. La Prolactina y su importancia: .................................................................... 26
3.8. La Gestación: .............................................................................................. 27
4. METODOLOGÍA ................................................................................................ 28
4.1 Aspectos Éticos del proyecto: ....................................................................... 28
4.2. Muestra: ....................................................................................................... 28
4.3. Cultivo celular y Tratamiento: ...................................................................... 29
4.4. Determinación de prolactina: ....................................................................... 30
5. RESULTADOS .................................................................................................. 32
5.1. Resultados decidualizaciones células deciduales mujeres con embarazo normal (DSC MEN). ............................................................................................ 32
5.2. Resultados decidualizaciones células deciduales mujeres con pre-eclampsia (DSC MP) ........................................................................................................... 34
5.3 Comparación entre ambos grupos celulares DSC MEN y DSC MP ............. 36
5.4 MORFOLOGÍA ............................................................................................. 38
6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ....................................................................... 39
7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 43
8. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 44
9. ANEXOS ............................................................................................................ 45
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................... 46
LISTA DE TABLAS:
Pág.
Tabla 1. DSC Mujeres con Embarazo normal sin complicaciones y con parto vaginal…………………..…………………………………………………………………………32
Tabla 2. DSC Mujeres con Desarrollo de Pre-eclampsia y cuyo parto fue por cesárea, ………………………………………………………………………………………………………34
Tabla 3. Promedio secreción de prolactina (ng/mL) Tres Grupos celulares DSC MEN y Tres Grupos celulares DSC MP……………………………………………………………...36
LISTA DE GRÁFICOS Y FIGURAS
Pág.
Gráfico 1. Resultados secreción de prolactina DSC MEN………………………33
Gráfico 2. Resultados secreción de prolactina DSC MP………………………...35
Gráfico 3. Gráfico comparativo todos los grupos celulares DSC MEN y DSC MP………………………………………………………………………………………....37
Gráfico 4. Gráfico comparativo de la Media de Secreción de Prolactina de los grupos células DSC-MEN y DSC-MP………………………………………………..37
Figura 1. Células en cultivo DSC MP Y DSC MEN antes del tratamiento con el cóctel decidualizador.……………………………………………..…………………..38
Figura 2. Células en cultivo DSC MP y DSC MEN Después del tratamiento con
el cóctel decidualizador……………………………………………………………….38
LISTADO DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Esquema descongelación células deciduales…………………………45
Anexo 2. Esquema Cultivos celulares y Tratamiento con Coctel decidualizador………….………………………………………………………….....…45
AGRADECIMIENTOS
A mis padres que me formaron íntegramente con los ideales y valores que me conforman, a ellos que son mi motor de impulso que siempre me están apoyando, y que con el mayor de los esfuerzos hacen todo lo posible por hacerme salir adelante.
A mis hermanos y compañeros de vida (Gabriela, Nicolás, Sara).
A Karen, por ser tan indispensable y brindarme los ánimos y el amor necesarios para seguir adelante, a mis amigos que siempre son un apoyo positivo ante todos los proyectos que son planteados (Jonathan, David, Sebastián, Pedro, Juan, Daniela, Silvia, Paula, Ludwing)
A Ludwing quién hizo parte inicial de este proyecto, a la Dra. Osmany directora del proyecto, Profesor Jerson Granados de gran apoyo igualmente.
A mis Docentes, quienes fueron parte de mi formación profesional durante toda la carrera y quienes a nivel personal también fueron un apoyo grandísimo y que luchan cada día por la formación de cada estudiante y el crecimiento de la universidad (Profesora Elsa Morales, Maritza Carvajal, Liliana Benítez, Sergio Gómez, Claudia Lozano, Ana Elvira Farfán, Ana Doris, Mónica Arias y a todos los demás docentes que sirvieron en mi formación personal.)
A Dios, quien guía mis pasos y sabe exactamente el lugar en el que debo estar.
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RESUMEN
Título: COMPARACIÓN DE LA DECIDUALIZACIÓN DE CÉLULAS DECIDUALES DE MUJERES CON EMBARAZO NORMAL Y CÉLULAS DECIDUALES DE MUJERES CON PRE-ECLAMPSIA
Autor: LUIS ALFONSO BOHÓRQUEZ VALERO
Palabras clave: Decidualización, Prolactina, Células Deciduales Estromales Humanas, Pre-eclampsia
Descripción:
Durante el embarazo se pueden presentar complicaciones que afectan tanto a la madre como al feto generando un incremento en los índices de morbi-mortalidad materno infantil. Una de las complicaciones más frecuentes es la pre-eclampsia de la cual aún se desconoce en su totalidad todos los factores que inducen o favorecen el desarrollo de la misma.
En el presente trabajo se analiza a pequeña escala las diferencias encontradas en cuanto a secreción de prolactina como uno de los marcadores de decidualización por parte de las células deciduales estromales humanas (DSC), procedentes de placentas de mujeres en las cuales el embarazo se desarrolló de forma normal sin ningún tipo de complicación y cuyo parto fue vaginal y DSC procedentes de placentas de mujeres cuyo embarazo presento una complicación específica la cual fue el desarrollo de pre-eclampsia y el parto fue realizado por cesárea.
El experimento se realizó in vitro empleando 3 grupos celulares de cada una de los grupos celulares (DSC Mujeres con pre-eclampsia y DSC Mujeres Embarazo Normal) a los cuales se les aplicó un tratamiento decidualizador para inducir la secreción de prolactina. Los datos encontrados muestran una mayor secreción de prolactina por parte de las DSC de mujeres cuyo embarazo se desarrolló de manera normal, al ser comparadas con las DSC procedentes de mujeres con pre-eclampsia, esto puede sugerir que los defectos durante el proceso de decidualización están presentes en el desarrollo de complicaciones durante el embarazo tales como la pre-eclampsia.
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ABSTRACT
Title: COMPARISON OF DECIDUALIZATION OF DECIDUAL CELLS OF WOMEN WITH NORMAL PREGNANCY AND DECIDUAL CELLS OF WOMEN WITH PREECLAMPSIA
Author: LUIS ALFONSO BOHÓRQUEZ VALERO
Keywords: Decidualization, Prolactin, Human Stromal Decidual Cells, Pre-eclampsia.
Descrition:
During pregnancy, complications can occur that affect both the mother and the fetus, generating an increase in maternal and infant morbidity and mortality rates. One of the most frequent complications is pre-eclampsia, of which all the factors that induce or favor the development of it are still unknown.
In the present work, the differences found regarding prolactin secretion as one of the decidualization markers by human stromal decidual cells (DSC), from placentas of women in which the pregnancy developed from normal form without any complication and whose delivery was vaginal and DSC from placentas of women whose pregnancy presented a specific complication which was the development of pre-eclampsia and delivery was performed by caesarean section.
The experiment was performed in vitro using 3 cell groups from each of the cell groups (DSC Women with pre-eclampsia and DSC Normal Pregnancy Women) to which a decidualizing treatment was applied to induce the secretion of prolactin. The data found show an increased secretion of prolactin by the DSC of women whose pregnancy developed normally, when compared with the DSC from women with pre-eclampsia, this may suggest that the defects during the decidualization process are present in the development of complications during pregnancy such as pre-eclampsia.
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INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la pre-eclampsia es un síndrome que aunque ha sido bastante estudiado, todavía se desconoce de forma completa todos aquellos factores que favorecen su desarrollo o que inducen a que se desencadene este tipo de patología en la materna.1 Hace falta un mayor enfoque investigativo en este tipo de temas para que se permita dilucidar de manera completa todas las incógnitas que giran en torno a este tipo de enfermedades.2
La presente investigación está centrada en el estudio de las células deciduales estromales humanas, provenientes de placentas de mujeres que presentaron un embarazo normal sin complicaciones y cuyo parto fue vaginal, así mismo placentas de mujeres que desarrollaron pre-eclampsia y el parto fue por cesárea.
Para abordar esta problemática se eligió analizar las células deciduales y el proceso de decidualización como tal que es realizado por las mismas, como posible factor contributivo en el desarrollo de la pre-eclampsia. Para esto se tomaron en cuenta tres grupos celulares que fueron analizados y que corresponden a los grupos celulares de placentas de mujeres con embarazo normal y de placentas de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia y las posibles diferencias que pudieran encontrarse con respecto a las mismas.
En el marco experimental se realiza la decidualización in vitro en las células deciduales mediante el uso de un coctel decidualizador, tomando como punto de análisis la secreción de prolactina como uno de los marcadores característicos del proceso de decidualización.
Este trabajo podría considerarse como un experimento piloto para futuras investigaciones que puedan ser realizadas por parte de otros investigadores en
1 ZAKIYAH, Neily. Pre-Eclampsia Diagnosis and Treatment Options: A Review of Published Economic Assessments. Netherlands: Unit of PharmacoEpidemiology and PharmacoEconomics, Department of Pharmacy. 2015. 1069-82
2 RAMMA, W. AHMED, A. “Is Inflammation the Cause of Pre-Eclampsia?” United Kingdom: University/BHF Centre for Cardiovascular Sciences, Queen's Medical Research Institute. 2016. 1619-27
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cuestión, ya que la muestra utilizada corresponde únicamente a tres grupos celulares de placentas de mujeres con embarazo normal y tres grupos celulares de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia. La muestra analizada aunque pequeña, arroja resultados significativos que pueden servir como base o sustento para un trabajo investigativo con mayor amplitud.
Es importante el apoyo y el interés por parte de la comunidad científica para permitir el avance en este tipo de investigaciones, de entera importancia para la salud materna, debido a la alta tasa de morbi-mortalidad materno infantil generadas por este tipo de patologías, como la pre-eclampsia y más aún en países en vía de desarrollo como lo es Colombia.
Las Células Deciduales:
El origen de las células deciduales (DSC) se presentaba como un tema de debate, el cual no se había determinado o establecido en su totalidad. Se encontraba que diversos estudios realizados, podían dar indicio del desarrollo y origen de estas células, pero aún se presentan ciertos vacíos que no permiten entender el origen y el funcionamiento completo de las mismas.3 Estudios realizados por Kearns y Lala en los cuales se definía el origen de las células deciduales, partía de la hipótesis donde se creía que estás células pudieron desarrollarse y migrar a partir de células toti-potenciales originadas en la medula ósea, donde finalmente se ubicaban en el endometrio. Más tarde esto fue confirmado en estudios posteriores realizados por los mismos autores, donde demostraron la presencia de células deciduales procedentes de migración a partir de médula ósea, pero en menor proporción que las desarrolladas a nivel local en el endometrio. La diferencia gradual entre las células que migran desde la médula ósea y las células originarias del endometrio radica en la determinación del marcador para el receptor nuclear de progesterona, que únicamente es encontrado en este tipo de células (DSC) y que no es encontrado en ninguna otra célula hematopoyética, lo cual las diferencia y define finalmente como células deciduales.4 Además algunas evidencias parecen apuntar a que estás
3 CASTEJON, O. BELOUCHE, R. CASTEJON, V. células deciduales y trofoblasticas: Su interacción
con la matriz Extracelular de fibrinoide Venezuela: Facultad de ciencias de la Salud UDC. 2001. Vol.
106 231-236 4 DUNN, L Carolynn. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic
transformation. France: University of Edinburgh Chancellor’s Building. 2003. Vol 7. No 2. P 151 – 161
11
células son provenientes de precursores estromales, localizados a nivel endometrial y relacionados directamente como parte de las células del endometrio (ESC).5
En estudios más recientes se ha definido que la aparición de las DSC y su desarrollo se da a partir de la llegada del blastocito y la penetración del mismo en las paredes uterinas, Una vez realizado el proceso de implantación, se estimula el desarrollo y diferenciación de las células endometriales (ESC) a células deciduales estromales (DSC). Donde finalmente las células deciduales son las encargadas de la producción local de citoquinas, hormonas y otras sustancias, que favorecen los efectos sobre el desarrollo placentario, además, interactúan directamente con otras células hematopoyéticas brindando así un efecto inmuno-protector.6 Todos estos factores determinan la importancia a nivel del desarrollo de las DSC, definido como un proceso necesario para que se dé una placentación e implantación fetal adecuada, lo cual favorece en ultimas el desarrollo fetal de manera normal y un embarazo saludable.7
La decidua es el tejido que se forma a nivel endometrial favoreciendo el proceso de implantación del blastocito. Es un tejido conformado en su gran mayoría por células deciduales, las cuales ejercen principalmente una función secretora, es decir permiten la liberación de hormonas tales como Prolactina, Cortisol, Hormona liberadora de Gonadotropina (GnRH), Proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, entre otras hormonas, que cumplen con funciones a nivel del desarrollo fetal y favorecen la función de las células del sistema inmune, ya que también se puede encontrar que la decidua está conformada por un tejido rico en leucocitos, en los que se destacan principalmente las células Natural Killer (dNK) y los macrófagos. La decidua representa una de las principales barreras físicas contra los posibles daños inflamatorios y oxidativos que ocurren durante el estado de embarazo, favoreciendo el proceso de placentación. Es por esto que el desarrollo de la decidua durante etapas iniciales del embarazo es necesario para garantizar que se dé un embarazo exitoso y saludable.8
5 DURÁN, E. Comparación de Las células deciduales estromales humanas y sus precursoras las
células endometriales: Fenotipo antigénico, diferenciación, apoptosis y relación funcional con
linfocitos. Tesis Doctoral Inmunología. España: Universidad de Granada. 2011. 241p. 6 BLANCO, Osmany. Las Células Deciduales Estromales Humanas Y Su Participación En La
Tolerancia Materno-Fetal. Tesis de Doctorado. España: Universidad de Granada. 2009. p 184
7 DUNN. Óp. Cit., p 11.
8 VARGAS, Manuel P. Desarrollo Y Fisiología Placentaria, Ciudad de México: Hospital de México,
Obstetricia, 2016. p 1-10
12
Se requiere de dos procesos fundamentales que garantizan el desarrollo embrionario y propician el inicio de la decidualización para un embarazo adecuado, el primero, el desarrollo fetal y el segundo corresponde a la diferenciación uterina, este último es posible y se encuentra regulado gracias a la producción hormonal, donde las hormonas tales como el estradiol y la progesterona permitirán o favorecerán los diferentes cambios a nivel morfológico con respecto al epitelio endometrial.9
En las DSC los receptores encontrados a nivel celular tales como el receptor de progesterona (RP) característico de estas células, son conocidos como receptores dependientes o inducidos por la presencia de ligandos, que en ausencia de los mismos se mantiene como un complejo inactivo, Cuando se da la unión de los ligandos al receptor se genera un cambio conformacional en el receptor de la progesterona que favorece finalmente la unión o sensibilización ante la acción de la de la misma y está acción es la que finalmente permite los cambios a nivel de las células deciduales.10
En estudios realizados in vitro se ha encontrado que la transformación decidual de las DSC se logra a partir de cultivos celulares tratados con progesterona posterior a un cultivo prolongado haciendo uso de Adenosin Mono fosfato cíclico (AMPc), el cual favorece la sensibilización de dichas células estromales a la acción de la progesterona donde finalmente permite el cambio o el desarrollo del fenotipo decidual. También se observa que después del tratamiento prolongado a las células haciendo uso de progesterona y AMPc las células adquieren una morfología más grande y más redondeada y adquieren una función secretora liberando hormonas tales como la prolactina.11
Se ha definido que un proceso decidual incompleto o fallos durante el proceso de decidualización podrían generar anomalías en la implantación fetal y desarrollo del mismo. Llevando así al desarrollo de posibles complicaciones durante el embarazo o trastornos fisiológicos que afectan finalmente al feto.12
9 TABIBZADEH, S. BABAKANI, A. The signals and molecular pathways involved in implantation, a
symbiotic interaction between blastocyst and endometrium involving adhesion and tissue invasión.
South Florida: Tampa Department of pathology. Human Reprod. Jun 10, 2000. p 1579-1602
10 HUANG, Jyun. Et al. NLRP7 contributes to in vitro decidualization of endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology, 2017. 15(1), 66.
11 CAROLYN. Óp. Cit., p 11.
12 VARGAS. Óp. Cit., p 12.
13
Preclampsia:
La pre-eclampsia, se presenta como una patología compleja que puede afectar la supervivencia tanto a nivel materno como a nivel fetal y está constituida como una problemática en salud pública importante a nivel mundial, generando tasas significativas de morbilidad y mortalidad materno-fetal.1314
Es una patología compleja ya que puede desencadenar un daño a nivel multi-orgánico, la cual se puede presentar después de la semana 20 de gestación o en algunos casos puede desarrollarse en etapas más avanzadas del embarazo. El desarrollo de esta patología compromete la salud tanto de la madre como del feto y se destaca por ser una patología con altas tasas de morbi-mortalidad. La pre-eclampsia cursa principalmente con un cuadro de hipertensión arterial y proteinuria, además de otros síntomas secundarios que afectan de manera directa a las mujeres en estado de embarazo, siendo esta la principal causa de nacimiento pre término por indicación médica, además de inducir el desarrollo de posibles complicaciones en el recién nacido.1516
Esta problemática se asocia principalmente, a que aún en la actualidad se desconocen en su totalidad todos aquellos factores que contribuyen o que desencadenan está patología en las diferentes etapas gestacionales. A nivel sociodemográfico podemos encontrar que puede afectar a cerca del 5-7% de las mujeres en estado de embarazo lo cual representa un riesgo con respecto a la salud materno-fetal y los índices de natalidad. Fisiopatológicamente de forma más concreta a lo mencionado en el apartado anterior, es una enfermedad que se manifiesta con un cuadro de hipertensión, proteinuria y alteraciones a nivel de diferentes órganos en una etapa complejamente avanzada, en donde pueden llegar a presentarse finalmente complicaciones que lleven al desarrollo de una
13 ZAKIYAH. Óp. Cit., p. 10.
14 SOCIEDAD ESPAÑOLA DE GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA. Protocolos Asistenciales en Obstetricia. 2006. Trastornos hipertensivos del embarazo.
15 RAMMA, Wenda. ASIF, Ahmed. “Is Inflammation the Cause of Pre-Eclampsia?” United Kingdom:
Biochemical Society Transactions. 2016. 39.Pt 6.
16 SANCHEZ, Sixto. Actualización en la epidemiología de la preeclampsia. Perú: ginecol. obstet. 2014. Vol. 60, n. 4, p. 309-320.
14
insuficiencia renal aguda, edemas pulmonares, lesiones hepáticas, síndromes hemolíticos, trombocitopenia, convulsiones e incluso la muerte de la materna.17
En las etapas avanzadas en donde se permite la progresión de la enfermedad, los neonatos de mujeres que desarrollaron pre-eclampsia durante el embarazo, tienen más probabilidad de morir durante el periodo neonatal, de igual forma en el periodo postnatal y durante el primer año de vida; así mismo en las madres las complicaciones son tan graves que determinan un desorden y una serie de procesos fisiológicos descontrolados que la pueden llevar a la muerte.18 Las distintas fuentes bibliográficas muestran también que la progresión a un estadío de la enfermedad más avanzado, es decir de la pre-eclampsia a eclampsia, reduce las opciones terapéuticas, direccionando su tratamiento o manejo, al aborto como único procedimiento capaz de salvar la vida de la madre. Por esta razón es importante el diagnóstico y manejo temprano de la pre-eclampsia en sus fases iniciales, ya que permite encontrar soluciones de manera más específica y que garanticen que se preserve la vida tanto de la madre como la del feto. Las medidas preventivas actuales se basan principalmente en un cuidado y monitoreo constante así como de una alimentación adecuada que garantice un estado saludable por parte de la materna, disminuyendo la probabilidad de desarrollar pre-eclampsia, pero el problema se fundamenta en que la etiología de esta patología es muy diversa lo cual dificulta finalmente su detección.19
A nivel mundial se ha intentado mantener un control desde hace varios años, sobre la tasa de incidencia de pre-eclampsia. Como es evidenciado existe una gran diferencia entre la letalidad presentada por los países desarrollados en contraste con aquellos que se encuentran en vías de desarrollo, donde este fenómeno se asocia principalmente con los países latinoamericanos, de los cuales Colombia no es la excepción, donde además de una manera directamente proporcional también se logra evidenciar que son estos países en vía de desarrollo los que presentan una tasa de morbilidad mucho más alta. Estadísticamente a nivel mundial, La organización mundial de la Salud (OMS) determinan que la incidencia de esta enfermedad se encuentra entre el 2 al 10% de todos los embarazos. También se ha determinado que los índices de desarrollo de la preclamsia se presentan 7 veces
17 Ibíd., p. 14.
18 MARTINEZ, Luis, et al. El pronóstico de los hijos de madres con pre-eclampsia: Parte 2: efectos a
largo plazo. Argentina: Archivos argentinos de pediatría. 2011.
19 ÁLVAREZ, José, et al. Desenlace obstétrico antes y después del inicio de la artritis reumatoide.
México: Revista Médica del Instituto Mexicano del Seguro Social. 2011. P 599-604.
15
más altos en países en vía de desarrollo que en aquellos países definidos como desarrollados (2,8% y 0,4% de los nacidos vivos respectivamente).20
En países desarrollados, en los continentes industrializados tales como Norte América y Europa, la incidencia se estima alrededor de 5 a 7 casos por cada 10.000 partos normales, mientras que en países con un nivel de desarrollo mucho más bajo es encontrado un valor que oscila o puede ser variable que puede ir desde 1 caso por cada 100 partos normales a 1 por cada 1.700 partos normales, siendo los países africanos los que presentan una incidencia y prevalencia mayor que el resto de la población mundial.21
En países latinoamericanos podemos encontrar que el incremento de las enfermedades cardiovasculares y la preclampsia se presentan como uno de los factores principales de mortalidad materno-fetal y entidades tales como la Fundación Cardiovascular de Colombia han destacado y definido estás patologías como una prioridad máxima en cuanto a la investigación que permita el desarrollo de tratamientos y mecanismos de prevención eficientes.22
A nivel nacional Según los datos oficiales para el país, obtenidos a través del Sistema de Vigilancia Epidemiológica para el año 2015 los índices de morbilidad se presentaron con 15 067 casos; Destacándose las zonas donde se presentan condiciones socio-económicas más desfavorables como lo son: La Guajira, Cartagena, Vaupés. Debido a esta problemática tan grande que gira en torno a la salud materno-infantil, el gobierno Colombiano pretende disminuir los índices de mortalidad materna, el cual se ha establecido como uno de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS). Implementando un sistema de información y vigilancia que contribuye de manera significativa para la evaluación del estado de salud materna en el país.23
20 VARGAS, Manuel. ACOSTA, Gustavo, MORENO, Mario. La pre-eclampsia un problema de salud
pública mundial. México: Laboratorio de Inmuno-biología. Hospital Juárez de México, Secretaría de
Salud, México DF. 2012. 471-476
21 STEVENS, W. et al. Short-term costs of preeclampsia to the United States health care system. Los
Angeles: Precision Health Economics. 2017. p 237-248
22 LÓPEZ JARAMILLO, Patricio. et al. Metabolic syndrome and pre-eclampsia: contributions realized
by the research Institute of the Colombian Cardiovascular Foundation. Colombia: Grupo VILANO.
Instituto de Investigaciones, Fundación Cardiovascular de Colombia. Floridablanca. 2006. Rev
Col.Cardiol Vol13 no.2
23 SIVIGILA. Protocolo de Vigilancia en Salud Pública MORBILIDAD MATERNA EXTREMA. 2016
16
Aunque en Colombia se ha logrado tener avances considerables con respecto al descenso de la mortalidad materna, aún se puede encontrar la pre-eclampsia como problemática en cuanto a salud pública y en comparación con respecto a los países desarrollados aún la meta de lograr un descenso significativo se encuentra lejana. En el año de 1956 encontrábamos una tasa de mortalidad materna cercana a 311 casos por cada 100.000 nacidos vivos y ya para el año de 2003, según estadísticas del DANE, la tasa de mortalidad materna descendió a 67,36 casos por cada 100.000 nacidos vivos.24
Otra problemática importante que gira entorno a la pre-eclampsia se encuentra ajustada a los altos costos del manejo de la misma cuando la gestante ya ha desarrollado algún tipo de alteración fisiológica. Estudios realizados en 2012 en Estados Unidos dan a conocer los costos de los tratamientos de aquellas mujeres que desarrollaron pre-eclampsia en los primeros 12 meses posteriores al parto, donde los valores procedimentales y el manejo de las mismas presentaban un costo altamente desproporcionado.25
En Colombia, pesé a que se han implementado los Objetivos de Desarrollo sostenible, donde se incluyen la salud materna, las tasas de mortalidad siguen presentándose inexplicablemente elevadas. Colombia es encontrada como uno de los países que hace parte del 99% de mortalidad materna a nivel mundial, siendo el 4 país a nivel latinoamericano con índices de mortalidad maternas más altos.26
Las alteraciones hipertensivas entre estás la pre-eclampsia se definen como una complicación que conduce de manera frecuente a la morbi-mortalidad materna y fetal y representa una de las principales causas de mortalidad materna en nuestro país. Es una enfermedad de gran complejidad que requiere de la participación y
24 BARBOSA, Miguel et al. Vigilancia De Morbilidad Materna Extrema En Una Institución De
Referencia En Cali, Colombia, 2013-2014. Colombia: Clínica Rafael Uribe Uribe. 2016. Vol. 67 No 3 p215-222.
25 STEVENS. Óp. Cit., p. 16. 26 SANDOVAL, Yirdley. ESLAVA, Javier. Inequidades en mortalidad materna por departamentos en
Colombia para los años 2000-2001, 2005-2006 y 2008-2009. Colombia: Instituto de Investigaciones
Clínicas. Grupo de Equidad en Salud. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia.
2013. p 529-541
17
manejo de recursos tanto técnicos como humanos y de altos costos para intentar salvar la vida tanto de la madre como del feto.27
Con respecto al desarrollo fisiopatológico de la enfermedad aún se tienen muchas incógnitas que permitan dilucidar de manera concreta por qué se desarrolla esta patología o todas las variables que favorecen el desarrollo de la misma, hacen falta más investigaciones y más recursos destinados al manejo de esta patología que permitan disminuir los índices de mortalidad materno-fetal no solo a nivel de la población Colombiana sino a nivel mundial.28
Dada la importancia denotada en otros estudios con respecto al proceso de decidualización como factor fundamental que permite el desarrollo fetal y favorece la progresión del embarazo de manera normal; este estudio se enfoca principalmente en mostrar si existen defectos en la decidualización con respecto a las células deciduales estromales (DSC) o algún tipo de diferencia entre las dos poblaciones celulares, obtenidas de mujeres bajo dos condiciones diferentes, las primera aquellas mujeres que habían tenido un embarazo normal sin ningún tipo de complicación y la segunda condición a partir de mujeres que habían presentado complicaciones especificas durante el embarazo, correspondientes con el desarrollo de la preclamsia.
27 PETRO, Gustavo, et al. Guía de trastornos hipertensivos del embarazo Colombia: Alcaldía Mayor
de Bogotá. 2014.
28 CASTEJON. Óp. Cit., p. 11.
18
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar si los efectos de la decidualización in vitro están alterados en las células deciduales obtenidas de placentas de mujeres con parto vaginal sin complicaciones y placentas de mujeres con pre-eclampsia.
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Inducir la Decidualización in vitro a través del tratamiento con AMPc y progesterona en cultivos de DSC derivadas de placentas de mujeres con parto vaginal sin complicaciones y pre-eclampsia.
Determinar los niveles de prolactina a partir de los sobrenadantes de cultivos celulares de DSC decidualizadas obtenidas de mujeres que presentaron parto vaginal sin complicaciones y pre-eclampsia
Comparar si existen diferencias en los niveles de Prolactina y diferencias cualitativas en la morfología celular de las DSC decidualizadas obtenidas de placentas de mujeres con parto vaginal sin complicaciones y pre-eclampsia.
19
2. JUSTIFICACIÓN
De esta forma, destacándose las altas tasas de morbilidad y mortalidad materna, además de la carencia de investigaciones no solo a nivel mundial, sino principalmente en Colombia y otros países latinoamericanos. Donde se dificulta encontrar estudios, que permitan establecer una causa especifica respecto al desarrollo fisiopatológico de la pre-eclampsia y el desarrollo de métodos diagnósticos que permitan de manera precoz la detección de mujeres en estado de embarazo que presentan un riesgo mayor para el desarrollo de la pre-eclampsia.
El presente proyecto intenta establecer a pequeña escala y de manera experimental las diferencias, que se puedan presentar en las DSC obtenidas de mujeres con parto normal sin complicaciones y DSC de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia, a partir de la determinación de PRL y los cambios morfológicos encontrados en cada una de ellas, como marcadores de decidualización in vitro en respuesta un estímulo inducido a partir del tratamiento con progesterona y AMPc. Puesto que se ha demostrado, que la decidualización se encuentran implicada directamente con el proceso de angiogénesis y regulación del crecimiento trofoblastico durante el embarazo. Así, por medio de este trabajo contribuir con una pequeña parte en el proceso investigativo de los diferentes mecanismos fisiopatológicos que favorecen el desarrollo de la pre-eclampsia o dar paso a que se desarrollen más investigaciones con respecto a este tipo de patología.
Así mismo de forma indirecta se busca tener un impacto a nivel social, que influya para que más investigadores se sumen en la búsqueda y el desarrollo de este tipo de investigaciones, pertinentes a estas enfermedades de las cuales podemos encontrar muchas incógnitas y cuyo proceso investigativo puede llegar a contribuir con la disminución de los índices de mortalidad materna generados por la pre-eclampsia, identificado como un problema prioritario de salud pública principalmente en los países en vía de desarrollo.
20
3. MARCO CONCEPTUAL
3.1. El Endometrio:
El endometrio es un tejido que se desarrolla en la cavidad uterina, el cual es encontrado en la capa superior de dicha cavidad. Este tejido puede ser determinado como propia de los humanos y algunos primates superiores. Fisiológicamente se ha encontrado que este tejido es regulado en función a los cambios hormonales que se presentan en base a los diferentes cambios durante el ciclo menstrual y el embarazo.29
Los cambios que se producen a nivel del tejido endometrial permiten la preparación para el adecuado proceso de adquisición y recepción que garantiza la implantación embrionaria y el adecuado desarrollo fetal.30
3.2. La Decidualización:
Los cambios que se generan a nivel uterino, son encontrados principalmente como cambios a nivel morfológico que favorecen la adaptación y especialización de las células endometriales para favorecer la producción de citoquinas y hormonas que permiten que la implantación fetal, anclaje y desarrollo placentario se lleve a cabo sin ningún tipo de alteración, este conjunto de cambios a nivel celular se denomina como decidualización.31
Estudios previos como el de Gellersen y colaboradores., afirman que la decidualización de las DSC es un proceso de diferenciación y crecimiento esencial para una implantación exitosa. Teniendo en cuenta que este proceso inicia durante el embarazo y que las DSC indiferenciadas presentes tanto en el endometrio como en la decidua, experimentan cambios morfológicos y fenotípicos durante la decidualización como lo es su morfología, además de una activa secreción de
29 SIMÓN, Carlos. Anatomía y Angiogénesis del endometrio humano. España: Universidad de
Valencia. 2009. p 2-9 30 GALLEGOS, S. et al. La placenta humana. Revisión. México: Departamento de Medicina Materno
Fetal Del instituto Nacional de Perinatología. 2008. Vol. 22- N°3 p 230 -240 31 GELLERSEN, Birgit. BROSENS, Ivo. BROSENS, Jan. Decidualization of the human Endometrium:
Mechanism, Functions, and Clinical perspectives. United Kingdom: Thieme Medical Publishers
ONN.2007. p 25.
21
hormonas como la PRL y citoquinas como IL-15 e IL-11, que median las funciones inmunológicas de estas células.32
Brosens y colaboradores mencionan en su estudio que la decidualización también se puede definir como un proceso de transformación epitelioide de fibroblastos endometriales en células secretoras, cuyos productos secretores principales incluyen la PRL y IGFBP-1 dos hormonas que han sido ampliamente usadas como importantes marcadores fenotípicos de DSC. Sin embargo, las células estromales endometriales diferenciadas también contribuyen a una masiva producción de citoquinas y factores de crecimiento, que tienen la capacidad de amplificar y propagar el proceso decidual de forma autocrina o paracrina, que inducen la diferenciación del compartimiento del estroma.33
Así mismo, otro estudio realizado por Brosens cataloga a la PRL como un marcador ampliamente determinado en la transformación de las DSC, que se detectó por primera vez en el compartimiento estromal endometrial superficial aproximadamente a los 10 días después del aumento postovulatorio.43
De igual forma Dongmei y colaboradores en su estudio resaltaron las necesidades nutricionales y de oxígeno del feto, para los cuales son necesarios realizar un proceso de remodelación endometrial, incluida la transformación de las arterias espirales en vasos no-activos de gran diámetro. Y por ende se cree que la interrupción o bloqueo de este proceso conduce a varios trastornos de la gestación durante el embarazo y esto trae como consecuencia la restricción del crecimiento intrauterino y la pre-eclampsia. Una de las características de la remodelación endometrial es la decidualización, en respuesta a las hormonas ováricas como lo son la progesterona y el estrógeno. Durante la fase secretora las DSC se decidualizan y secretan PRL.34
Han y colaboradores, publicaron, que la decidualización afecta a todos los compartimentos uterinos, incluidos los compartimentos del estroma, los miocitos de
32 GELLERSEN. Óp. Cit., p. 20.
33 BROSENS, Jan. et al .Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in
differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 2001. vol. 140, no 10, p. 4809-4820.
34 DONGMEI, et al. Positive Regulation of Decidualization by L-Type Amino Acid Transporter 1 (lat1) in Pregnant Mice. Nutrients. 2016. vol. 8, no 11, p. 704.
22
la zona de unión, las arterias espirales, las células inmunitarias locales y las células endometriales.35
En general se puede evidenciar, que los diferentes autores mencionados concluyeron que la decidualización humana es una condición esencial para la implantación del blastocito y el desarrollo del embarazo. Además, se conoce que el proceso de decidualización se extiende a la capa basal del endometrio, siendo importante para la invasión del trofoblasto y la formación de placenta durante el embarazo.
La decidualización es un proceso que ocurre a nivel de las células endometriales, después del proceso de implantación del blastocito y garantiza que todo el proceso de placentación ocurra de manera adecuada; se inicia a partir de un incremento en los niveles circundantes de progesterona a nivel sanguíneo, favoreciendo el inicio de una cascada de eventos a nivel celular y molecular, que incluyen la diferenciación de las células endometrial a células deciduales, dichos cambios se denotan principalmente a nivel morfológico donde las células adquieren un morfología más redondeada o poligonal, además de la función secretora que permite la liberación de hormonas tales como la prolactina, además también se presenta mayor actividad por parte de las glándulas encontradas a nivel uterino y remodelación de los vasos sanguíneos. Este se desarrolla como un proceso progresivo que inicia principalmente entorno a las arterias espirales de la capa superficial endometrial y que finalmente afecta todo el endometrio, este proceso se lleva a cabo durante todo el embarazo.36
La implantación o anidación se da, cuando el blastocito se ubica a nivel del estroma endometrial, este proceso garantiza o permite que el trofoblasto comience con su respectivo proceso de invasión a nivel del endometrio, que se conoce como decidua después de la implantación fetal e inicio del desarrollo placentario.37
35 HAN, et al. Treatment of human endometrial stromal cells with chorionic gonadotropin promotes
their morphological and functional differentiation into decidua. Molecular and cellular endocrinology. 2002. 147(1), 7-16
36 GELLERSEN. Óp. Cit., p. 20. 37 VARGAS. Óp. Cit., p. 13.
23
3.3. La decidua:
La decidua, es el tejido mucoso que se genera a partir de los cambios producidos por parte del estado de embarazo mediante el proceso de decidualización, la decidua está conformada por diferentes capas denominadas según su función principal, la decidua basal, es la primera capa y es aquella que sirve como base receptora para el cigoto, la decidua capsular, es aquella que favorece el recubrimiento del blastocito y permite la separación del mismo con la cavidad uterina y por último se encuentra la decidua corionica que es la capa más externa y cumple con la función de barrera física principalmente. La decidua se encuentra conformada principalmente por células deciduales estromales, estas células cumplen con diferentes funciones que garantizan principalmente y como se menciona con anterioridad el proceso para un adecuado desarrollo fetal, regulando la fase de invasión por parte del trofoblasto, además de conferirle protección contra la reacción inflamatoria y el estrés oxidativo que pudieran generar daños a nivel fetal.38
3.4. La placenta:
La placenta se presenta como órgano transitorio a nivel humano que está presente únicamente durante del desarrollo fetal y hasta el final del embarazo. Es una progresión que se da de manera bastante lenta, está se conforma tanto por tejidos procedentes de la madre como tejidos procedentes del feto.39 Su importancia está definida principalmente ya que se genera como un órgano que permite el intercambio de nutrientes y otras sustancias a nivel materno-fetal, por tanto cualquier defecto durante el desarrollo de la misma puede favorecer que se presenten defectos durante el embarazo o embarazos que puedan terminar de manera prematura. De esta forma puede ser definida la decidua como aquella barrera física que se regula mediante los procesos hormonales y permite la producción de citoquinas a nivel local que van a favorecer finalmente el desarrollo del feto.40
38 BLANCO. Óp. Cit., p. 12.
39 VARGAS. Óp. Cit., p. 13. 40 SIMÓN. Óp. Cit., p. 20.
24
3.5. La progesterona:
La progesterona se presenta como una de las principales hormonas involucradas en el proceso de decidualización, está hormona se encarga de inducir cambios en las células principalmente a nivel morfológico, dichos cambios son determinados a través de una transición morfológica de la célula fibroblastica a una morfología más agrandada y redondeada, además los cambios permiten estimular la función secretora, permitiendo la liberación de hormonas tales como la Prolactina (PRL) y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFBP-1)41 favoreciendo de manera directa la adquisición del fenotipo conocido como fenotipo decidual por parte de las células endometriales, proceso que se genera principalmente frente a estímulos dados por la fecundación; en ausencia de dichos estímulos se disminuye la producción de progesterona, lo cual induce a que se genere el proceso de apoptosis a nivel de las células endometriales cuyo desprendimiento se le conoce como periodo o ciclo menstrual.42
Huang y colaboradores, afirmaron en su estudio, que el aumento de los niveles de la progesterona después de la ovulación contribuye a la inducción de la decidualización de las células estromales, para que estas lleven a cabo una transformación muy similar a la de los fibroblastos en células epitelioides y así se lleve a cabo la expresión de una variedad de antígenos fenotípicos y la secreción de sustancias como es el IGFBP-1 y la PRL. También se demostró que las células del estroma decidualizadas adquieren propiedades bioquímicas y celulares que son únicas para preparar un entorno apropiado, para que se lleve a cabo la implantación del embrión en desarrollo, como también la placentación adecuada y el mantenimiento del embarazo. Dado que una decidualización defectuosa ha sido relacionada con el aborto espontáneo y la pre-eclampsia.43
41 MIKIHIRO, Yoshie. KAZUYA, Kusama. KASUHIRO, Tamura. Molecular mechanisms of human
endometrial decidualization activated by cyclic adenosine monophosphate signaling pathways. Japón: Department of Endocrine and Neural Pharmacology, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences. 2015. J. Mamm. Ova Res. Vol. 32 (3)
42 MIKHAILOV, V M. Life Cycle of Decidual Cells. Rusia: Institute of Cytology, Russian Academy of
Sciences, St. Petersburg. International Review of Cytology. 2003. Vol. 227, p 45-63
43 HUANG, Jyun. Et al. NLRP7 contributes to in vitro decidualization of endometrial stromal cells. China: Reproductive Biology and Endocrinology. 2017. 15(1), 66.
25
3.6. El AMPc:
El Adenosin monofosfato ciclico (AMPc) es una molécula que se encuentra a nivel intracelular la cual cumple un papel importante actuando como segundo mensajero intracelular. Está molécula se produce a partir de la unión con los receptores transmenbrana y se encuentra regulada a partir de la actividad de la enzima Adenil-ciclasa la cual se encarga de la producción de AMPc a partir de ATP.44
Normalmente el AMPc juega un papel importante en el proceso de regulación celular, mediante diferentes interacciones con receptores expresados a nivel celular. Su expresión está dada a raíz de diferentes variables tales como: regulación de receptores, procesos catabólicos y expresión de genes o coactivadores; donde en última instancia se encuentra que la finalidad de estos sistemas se basa en terminar la respuesta celular frente a estímulos ejercidos externamente en las células. Las células estromales endometriales (ESC) a diferencia de otras células y dependen de la actividad y expresión del AMPc para poder diferenciarse en células deciduales y mantener el fenotipo decidual. El inicio del proceso de decidualización es dependiente de un incremento en los niveles de AMPc a nivel intracelular, el cual garantiza finalmente la activación de la ruta de la proteín Kinasa A. Este proceso se desarrolla en las células deciduales, hasta que se elimina o se da por terminado el estímulo ejercido por parte del AMPc. Frente a la terminación del estímulo también se da por terminada la producción de segundas moléculas derivadas del proceso de decidualización tales como la Prolactina (PRL) y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFBP-1).45
44 GELLERSEN, Birgit. BROSENS, Jan. Cyclic AMP and progesterone receptor Cross-talk in human
endometrium: a decidualizing affair. Alemania: IHF Institute for Hormone and Fertility Research,
University of Hamburg, Hamburg, Journal of Endocrinology. 2003. 178, 357–372
45 Ibíd., p. 25.
26
3.7. La Prolactina y su importancia:
A nivel placentario, nos encontramos que las células deciduales cumplen con la función o actividad endocrina que permite la secreción de prolactina, dicha secreción se encuentra regulada a nivel local y no a través de los factores que se encargan de la liberación de prolactina a nivel hipotalámico. Como se determina con anterioridad la progesterona juega un papel importante sirviendo como potente estimulador de la producción local de prolactina por parte de las células deciduales. La PRL se origina a nivel de la decidua y se distribuye por difusión hacia el saco amniótico y se incrementa durante todo el proceso de gestación. Los niveles de PRL alcanzan concentraciones máximas alrededor de las semanas 20 y 24 con concentraciones elevadas tanto a nivel materno como por parte del feto, gracias a que el desarrollo final de la decidua y su gran tamaño permiten la producción de 1µg de prolactina / g de decidua.46
Varios estudios sugieren que la PRL secretada a nivel decidual durante el embarazo puede tener un papel importante en la regulación tanto del volumen como de la composición del líquido amniótico, favorece la disminución de la respuesta inmune en etapas iniciales del embarazo además de favorecer y ayudar en la función y competencia inmune por parte de los linfocitos T.47
También se ha demostrado que la PRL es un marcador importante de la decidualización en DSC. Garrido y colaboradores demuestran en su trabajo que las DSC secretan productos específicos como lo es la PRL y la proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP-1). Demostrando la importancia de estas proteínas como marcadores de células decidualizadas, además también demostraron la importancia de la PRL para que se lleve a cabo la diferenciación endometrial y el control de la invasión del citotrofoblasto, resaltando así este
46 MARTINEZ, Jorge. Fisiología de la Prolactina. España: Instituto de Investigaciones Biomédicas A.
Sols CSIC/UAM de Madrid. 2005. p 5-14 47 PAREDES, Freddy. GOÑES, Carmen. Prolactina Decidual En El Primer Trimestre De Embarazos
Normales Y complicados Con Pre-eclamsia Severa. Perú: Ginecología y Obstetricia. 2001. Vol. 39 –
N°17 p 78.
27
proceso como un componente importante para establecer la interfaz materno-fetal durante el embarazo normal.4849
De esta forma en este estudio, se determina la importancia de la PRL como marcador característico del proceso de decidualización, para determinar si las células adquirieron el fenotipo decidual, caracterizado como se menciona anteriormente, por su función secretora.
3.8. La Gestación:
La Gestación es un proceso fisiológico complejo, que requiere de la sincronía de todas las fases del mismo para que finalmente se garantice el desarrollo y estabilidad del feto durante toda la gestación y hasta su nacimiento. En las fases iniciales se observa que se producen una serie de cambios a nivel celular, tales como los cambios a nivel morfológico en el que las células adquieren el fenotipo decidual y función secretora, de igual forma se presentan cambios y adaptaciones por parte del sistema inmune, con la llegada de células tales como las dNK y los macrófagos, además de la liberación de citoquitas ayudan a regular la respuesta inflamatoria, que finalmente permiten que el feto sea aceptado y no se presente ningún tipo de reacción adversa por parte de la actividad inmune de la madre. El proceso inicial que garantiza el desarrollo del feto de manera adecuada, parte desde la implantación fetal, donde encontramos que el trofoblasto migra hacia el tejido uterino, donde realiza un proceso de invasión y anclaje en el epitelio uterino para facilitar la obtención de nutrientes. Este primer contacto que se presenta entre el trofoblasto y el tejido uterino da inicio a la adaptación inmune y a la producción local de hormonas tales como la PRL y el IGFBP-1 y segundos mensajeros como el AMPc que favorecen finalmente un embarazo normal.50
48 GARRIDO, Tamara. Et al. "Defective decidualization during and after severe preeclampsia reveals
a possible maternal contribution to the etiology." Estados Unidos: Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017 .114.40 E8468-E8477.
49 GIUFFRIDA, et al. Does prolactin induce apoptosis? Evidences in a prostate cancer in vitro model. En: Journal of endocrinological investigation, 2010 vol. 33, no 5, p. 313-317.
50 GALLEGOS. Óp. Cit., p. 20.
28
4. METODOLOGÍA
4.1 Aspectos Éticos del proyecto:
En este proyecto investigativo, no se realizó ningún tipo de ensayo clínico o experimento en el cual se incluyeran pacientes o donantes sanos, ni se efectuó un seguimiento o un estudio continuado con los mismos. En este proyecto investigativo se estudiaron las células deciduales estromales humanas (DSC) que se encontraban crio-preservadas en nitrógeno líquido en el laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB), de la Universidad de Santander UDES, estás células fueron obtenidas de un proyecto anterior que fue aprobado por Colciencias y realizado de igual forma en la UDES. Las células deciduales estromales humanas que fueron estudiadas fueron únicamente aquellas en las que las donantes autorizaron por escrito para que estas fuesen preservadas y utilizadas para estudios posteriores (ver consentimiento informado). Para la protección de los datos y la confidencialidad de las donantes, a cada grupo celular se le asignó un código con el cual fueron guardadas las células. El estudio en cuestión cuenta con la aprobación del comité de ética en investigación (CEI) de la Universidad de Santander, del hospital Universitario de Santander HUS y del hospital del Norte de la ciudad de Bucaramanga. Se siguieron todos los lineamientos o las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud que contempladas en la “Resolución 8430 de 1993” del Ministerio de Salud. Este proyecto fue realizado en el laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB) de la Universidad de Santander UDES, en donde se aplicó, durante todo el procedimiento todas las normas bioseguridad establecidas por el laboratorio que garantizaban el acceso y permanencia en el mismo.
4.2. Muestra:
Para el desarrollo de la fase experimental, como se menciona en el apartado anterior, se dispuso de las células crio-preservadas en el Laboratorio de investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB) de la universidad de Santander (UDES) dichas muestras fueron obtenidas a partir de las placentas de mujeres con embarazo normal y placentas de mujeres que desarrollaron pre-eclampsia, la obtención se dio a partir del proceso de macerado y tripsinización de las mismas y fueron almacenadas previamente mediante la técnica de crio-preservación. Estás células fueron obtenidas de otras investigaciones realizadas a cargo de la Dra. Osmany Blanco y otros investigadores, previamente a esta investigación. Las células utilizadas son denominadas como Células deciduales
29
Estromales Humanas (DSC) de las cuales se dispusieron de dos grupos diferentes de las células utilizadas, las primeras corresponden a mujeres que no presentaron ningún tipo de complicación durante el embarazo, lo que permitió el desarrollo normal del mismo y el parto se da con total normalidad a través del canal vaginal y las segundas corresponden a mujeres cuya complicación específica fue el desarrollo de pre-eclampsia y el parto fue realizado por cesárea. Se decidió hacer uso de tres grupos celulares de mujeres con embarazo normal (MEN) y tres grupos celulares de mujeres con pre-eclampsia (MP) ya que algunos de los grupos celulares no presentaron crecimiento a la hora de ser cultivadas, lo cual redujo el número de cultivos viables para el experimento, además por motivos económicos la muestra utilizada no podía ser tan grande. Se destaca de igual forma que esta investigación se presenta como una prueba piloto para futuras investigaciones que pudieran ser realizadas, donde los resultados pueden servir como base para otros experimentos.
4.3. Cultivo celular y Tratamiento:
Para la fase experimental, las células fueron sometidas a descongelación debido a su estado previo de crio-preservación. Una vez se retiran los tubos del nitrógeno líquido (-195°C) son sometidas a shock térmico rápidamente mediante el baño maría (37°C) por un lapso de 2 – 3 min, posterior a la descongelación de las células garantizando la esterilidad del proceso se hizo uso de la cabina de flujo laminar donde el compuesto celular contenido en el crío-tubo se re-suspende con Búfer Fosfato Salino (PBS) diluyendo el PBS con agua destilada estéril para obtener una solución al 1x (es decir una parte de PBS por nueve partes de agua destilada estéril) para garantizar un lavado más efectivo de las células y favorecer la adhesión de las mismas al frasco de cultivo celular. Finalmente el contenido se dispone en frascos de cultivo celular de 25mL con medio de cultivo OptiMEN con suero fetal bovino inactivado al 5% y se incuba por 24 horas en ambiente de CO2 al 5% (ver Anexo 1). A las 24 horas se determinó si las células presentaron crecimiento y adherencia al frasco, además de observar su morfología, se realizó un cambio inicial del medio. Inicialmente se apreció que las células presentaban una morfología fibroblastica, por lo que se re-incuban nuevamente. Los cambios del medio de cultivo fueron realizados cada tres días. Una vez se confirma el crecimiento, adhesión y proliferación de las células en una proporción del 90% de confluencia (Porcentaje aproximado que indica el crecimiento de la Mono-capa sobre la superficie de la placa de cultivo celular), se procede a iniciar el tratamiento celular con un coctel decidualizador.
Para el desarrollo del tratamiento en el experimento se tuvo un modelo longitudinal que permitió determinar el comportamiento a lo largo de un periodo de tiempo
30
específico de 15 días, periodo en el cual se esperaba que las células alcancanzaran el fenotipo denominado como fenotipo decidual. Como se determina con anterioridad el experimento hizo uso de los dos grupos celulares en los cuales se esperaba encontrar diferencias significativas, la primera que era procedente de mujeres cuyo embarazo se desarrolló con total normalidad (MEN), y las demás células procedentes de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia (MP), se utilizaron 3 cultivos de cada una (3 grupos celulares de MEN y 3 grupos celulares de MP) cada grupo celular presentaba su respectivo control (El cultivo bajo las misma condiciones pero sin tratamiento con coctel decidualizador) y una réplica que permitiera comparar si los resultados se presentaban de manera similar. Todos los cultivos celulares se sometieron a las mismas condiciones y tratamiento para evitar posibles sesgos. (Ver Anexo 2).
El tratamiento se basó en el uso de un coctel decidualizador, que contenía progesterona 300 nM y Adenosin monofosfato (AMP) cíclico 500 µM51 . Cuyas cantidades se ajustaron y se adicionaron en 10 mL de medio de cultivo. Las células control, únicamente contenían el medio de cultivo Optimen con suero fetal bovino inactivo al 5%, mientras que las células utilizadas como variable de experimentación se les adicionó el medio Optimen y adicional a esto se agregó el coctel decidualizador. Posterior a este tratamiento se procedió a incubar las células a 37°C en atmosfera de 5% de CO2. El cambio de medio y aplicación de tratamiento fue determinado cada 3 días durante un periodo de 15 días, donde previamente al cambio se recogieron los sobrenadantes de cada uno de los medios de cultivo para determinación de prolactina una vez finalizado el experimento. Los sobrenadantes fueron almacenados en congelación a una temperatura de -20°C hasta el final del experimento.
4.4. Determinación de prolactina:
Una vez finalizado el periodo de tratamiento, Los sobrenadantes se descongelaron y fueron llevados a Fundación Cardiovascular de Colombia (FCV) para ser analizados. La determinación de los niveles de prolactina se realiza a través de la técnica de Inmuno-ensayo electroquimoluminiscencia (ECLIA) de sus siglas en inglés, que se basa en un principio tipo sándwich, donde la muestra se une a un anticuerpo monoclonal biotinililado anti-Prolactina para la formación de un primer
51 CHO, Ju Wan. Et al. The progesterone receptor as a transcription factor regulates phospholipase
D1 expression through independent activation of protein kinase A and Ras during 8-Br-cAMP-induced decidualization in human endometrial stromal cells. Corea: Biomedical Research Institute and Department of Biochemistry & Molecular Biology. 2011. BioChem. 436, 181–191
31
complejo, tras una segunda incubación que incluye la adición de un anticuerpo marcado con quelato de rutenio y micro partículas con estreptavidina se da finalmente la formación del completo tipo sándwich el cual es fijado a la fase sólida gracias a la interacción que se presenta entre la biotina y la estreptavidina. Luego del proceso de fijación está mezcla es transferida hacia la célula de medida donde por efecto del magnetismo las micro partículas que contenía la reacción son fijadas a la superficie del electrodo, finalmente cuando se aplica una corriente eléctrica se produce un efecto de quimioluminiscencia que puede ser medida a partir de un fotomultiplicador. La duración del procedimiento fue de 130 minutos aproximadamente. Para este inmuno-ensayo se utilizó el analizador automático (Cobas 6000) Roche.
32
5. RESULTADOS
5.1. Resultados decidualizaciones células deciduales mujeres con embarazo normal (DSC MEN).
Tabla 1. Niveles de Prolactina DSC Mujeres con Embarazo normal sin complicaciones y con parto vaginal.
Los resultados encontrados durante la fase experimental, permitieron denotar el proceso de decidualización realizado por parte de las DSC, ya que como se observa en la tabla se apreció una mayor secreción de Prolactina por parte de las células tratadas en contraste con las células no tratadas (Controles) siendo la Prolactina el marcador característico del proceso de decidualización. A pesar de que las células se cultivaron y se mantuvieron bajo las mismas condiciones, se observaron diferencias en cuanto los niveles de secreción de Prolactina, siendo las DSC-MEN 2 las que secretaron una menor cantidad de Prolactina, lo cual puede estar
Código Días de
Tratamiento
Resultados Tratamiento
PRL ng/mL
Resultados Controles
PRL ng/mL
Media de Secreción
PRL células tratadas ng/mL
Media de Secreción PRL
Controles ng/mL
DSC- MEN 1
Día 6 223 1
572,25 1 Día 9 399 1
Día 12 729 1
Día 15 938 1
DSC- MEN 2
Día 6 140 0,3
245,5 0,4 Día 9 220 0,3
Día 12 310 0,5
Día 15 312 0,5
DSC- MEN 3
Día 6 112 0,3
427,75 0,8 Día 9 320 1
Día 12 435 1
Día 15 844 1
33
determinado por parte de las condiciones presentes a nivel de las mujeres de las cuales se obtuvieron dichas células.
Gráfico 1. Resultados secreción de prolactina DSC MEN
Gráfico A, B, C Secreción de Prolactina ng/mL de las células deciduales de Mujeres con Embarazo Normal (DSC-MEN) tratadas y no tratadas (Controles), demarcando la notable secreción de Prolactina que aumenta en función al tiempo siendo el día 15, el de mayor secreción por parte de la células tratadas con el coctel decidualizador, lo cual determina el proceso de decidualización realizado por las mismas, siendo la Prolactina el marcador caracteristico de decidualización. Gráfico D, media comparativa de secreción de Prolactina de los tres grupos DSC-MEN, donde se aprecia la difencia en cuanto a los niveles de secreción de Prolactina por parte de los tres grupos celulares y se destaca la diferencia significativa en cuanto los niveles secretados por los controles. Determinación de Prolactina por la técnica de Electro quimio luminiscencia (ECLIA) equipo Cobas 6000 Roche.
A B
C D
34
5.2. Resultados decidualizaciones células deciduales mujeres con pre-eclampsia (DSC MP)
Tabla 2. Niveles de Prolactina DSC Mujeres con Desarrollo de Pre-eclampsia y cuyo parto fue por cesárea.
Código Días de
Tratamiento
Resultados Tratamiento PRL ng/mL
Resultados Controles PRL
ng/mL
Media de Secreción
PRL células tratadas ng/mL
Media de Secreción
PRL Controles
ng/mL
DSC- MP 1
Día 6 69 0,2
169,5 0,4 Día 9 83 0,3
Día 12 224 0,5
Día 15 302 0,5
DSC- MP 2
Día 6 29 0,3
38,7 0,45 Día 9 28 0,3
Día 12 33 0,5
Día 15 65 0,5
DSC- MP 3
Día 6 65 0,5
103,1 0,5 Día 9 100 0,5
Día 12 120 0,5
Día 15 127 0,5
Los resultados encontrados denotan una decidualización incompleta o bastante lenta por parte de las DSC-MP tratadas, ya que los niveles de Prolactina secretada son bastante bajos desde el día 6 que da inicio el proceso de secreción de Prolactina, hasta el Día 15 en el cual se hace la última recolección de los sobrenadantes, se destaca de igual forma que las DSC-MP si intentaron realizar el proceso de decidualización ya que se observó una mayor secreción de Prolactina por parte de las DSC tratadas en contraste con las no tratadas (Controles). De igual forma a pesar que las células se cultivaron y mantuvieron bajo las mismas condiciones se observan diferencias en los niveles de secreción de Prolactina por parte de los tres grupos celulares, estas diferencias pueden asociarse tanto a las condiciones fisiológicas de las donantes, como a la procedencia de las células ya que cada grupo celular proviene de una mujer diferente. De igual forma se observa que las DSC-MP1 al día 15 secretaron una cantidad Prolactina considerable, a
35
pesar de que en las primeras determinaciones día 6-9 los niveles fueron bastante bajos, lo cual podría indicar que la decidualización se está presentando de forma más lenta.
Gráfico 2. Resultados secreción de prolactina DSC MP
Gráfico A, B, C, Secreción de Prolactina ng/mL de las células deciduales de Mujeres con Desarrollo de Pre-eclampsia (DSC-MP) tratadas y no tratadas (Controles), se denota la mayor secreción de Prolactina por parte de la células tratadas con el coctel decidualizador en comparación con las células no tratadas. Así mismo se podría determinar posibles defectos durante el proceso de decidualización realizado por las mismas, ya que de igual forma los niveles de Prolactina secretados por parte de las células tratadas son bastante bajos. Al igual que las DSC-MEN se utilizó la Prolactina como el marcador caracteristico de decidualización. Gráfico D, Media comparativa de secreción de Prolactina de los tres grupos DSC-MP, donde se aprecia la difencia en cuanto a los niveles de secreción de Prolactina por parte de los tres grupos celulares y se destaca la diferencia significativa en cuanto los niveles secretados por los controles. Determinación de Prolactina por la técnica de Electro quimio luminiscencia (ECLIA) equipo Cobas 6000 Roche.
A B
C D
36
5.3 Comparación entre ambos grupos celulares DSC MEN y DSC MP
Tabla 3. Promedio secreción de niveles de Prolactina (ng/mL) Tres Grupos celulares DSC MEN y Tres Grupos celulares DSC MP.
Días de tratamiento
Promedio DSC MEN ng/mL
Promedio DSC MP ng/mL
Día 6 158 54
Día 9 313 70
Día 12 491 126
Día 15 698 165
Con respecto a los resultados del promedio de secreción de Prolactina arrojados por parte de los tres grupos celulares de DSC-MEN y los tres grupos de DSC-MP, se logra apreciar niveles de Prolactina mucho más bajos por parte de las DSC-MP desde el inicio del tratamiento, donde la secreción de Prolactina se hace notable al día 6, hasta el día 15 cuando se hace la última recolección de los sobrenadantes para determinación de Prolactina, esto en comparación por parte de los niveles de Prolactina secretados por parte de las DSC-MEN (Ver Gráfico 4). Está diferencia en cuanto a secreción de Prolactina que de igual forma se logra observar en las réplicas (No incluidas en los resultados) realizadas a cada uno de los grupos celulares, podría determinar posibles alteraciones en cuanto al proceso de decidualización realizado por las DSC-MP.52
De igual forma es importante destacar que esté estudio se presenta como una prueba piloto para futuras investigaciones que pudieran ser realizadas, ya que la muestra utilizada es pequeña, lo cual limita una comparación concreta con respecto a los 2 grupos analizados.
52 NAKAJIMA, Ryojun. Et al. Elevated vasoinhibin derived from prolactin and cathepsin D activities in sera of patients with preeclampsia. En: Hypertension Research. 2015. vol. 38, no 12, p. 899-901.
37
Gráfico 3. Gráfico comparativo de cada uno de los grupos celulares DSC MEN y DSC MP
Comparación del promedio de secreción de prolactina (ng/mL) para cada uno de los tres Grupos celulares DSC MEN y Tres Grupos celulares DSC MP.
Gráfico 4. Gráfico comparativo de la Media de Secreción de Prolactina de los grupos células DSC-MEN y DSC-MP
572,25
245,5
427,75
169,5
38,7103,1
1 0,4 0,8 0,4 0,45 0,50
100
200
300
400
500
600
700
DSC- MEN 1 DSC- MEN 2 DSC- MEN 3 DSC- MP 1 DSC- MP 2 DSC- MP 3
Media Secreción de PRL DSC-MEN y DSC-MP
Media de Secreción PRL células tratadas ng/mL
Media de Secreción PRL Controles ng/mL
158
313
491
698
54 70126
165
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Día 6 Día 9 Día 12 Día 15
Comparación Media de Secreción de PRL DSC-MEN y DSC-MP
Promedio DSC MEN ng/mL Promedio DSC MP ng/mL
38
5.4 MORFOLOGÍA
DSC antes del tratamiento con cóctel decidualizador
(A) (B)
Fig.1 Las Células en cultivo DSC MP (A) Y DSC MEN (B), presentan un tipo de morfología alargada, fibroblastica y la confluencia alcanzada fue del 90%. Objetivo 40x. No se encuentran diferencias morfológicas, entre los dos grupos celulares previo al tratamiento con el coctel decidualizador.
DSC Después del tratamiento con cóctel decidualizador
(A) (B)
Fig.2 Células en cultivo DSC MP (A) y DSC MEN (B). Las DSC presentan una morfología mucho más grande después del tratamiento con el cóctel decidualizador, además Se observa una menor confluencia por parte de las células puestas en cultivo. Las DSC-MEN, muestran un cambio más notable en cuanto a su morfología siendo más grandes que las DSC-MP decidualizadas. Objetivo 40X.
39
6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La importancia del estudio y análisis de enfermedades tan complejas como lo es la pre-eclampsia, que acarrean consecuencias nefastas para la salud de las maternas, se resalta a la hora de inferir el porqué de las mismas, ya que dilucidar la razón por la cual se presentan no se ha determinado de una manera completa.53 A partir de esta idea fundamental centramos el estudio, en buscar a pequeña escala los factores que pueden contribuir en el desarrollo de esta enfermedad. Con la investigación centrada a partir de investigaciones previas por parte de otros investigadores y la necesidad de conocer completamente los factores que determinan el desarrollo de la enfermedad, partimos de dos variables y las posibles diferencias que podrían encontrarse, correspondientes a células deciduales de mujeres que presentaron un embarazo de manera normal (DSC-MEN) y células deciduales de mujeres que desarrollaron pre-eclampsia (DSC-MP) las cuales procedían de placentas, que fueron adquiridas bajo todo los consentimientos éticos pertinentes al caso.
Teniendo en cuenta que la decidualización se caracteriza como uno de los procesos necesarios que ayudan al desarrollo de un embarazo normal y saludable, que se determina como un proceso que favorece la implantación fetal y los cambios celulares. Dichos cambios se encuentran caracterizados por cambios a nivel de la morfología de las células deciduales, adquiriendo un mayor tamaño y una forma redondeada y así mismo desarrollando una función secretora, que permite la liberación de hormonas tales con la Prolactina y La proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1, que ayudan en los procesos de desarrollo placentario y regulación inmune. La decidualización es el proceso que inicia a partir del estímulo generado por el incremento en los niveles hormonales durante el ciclo menstrual y el embarazo, dicho estímulo se mantiene cuando los niveles de progesterona se elevan y se conservan producto del mismo estado de embarazo. De igual forma se ha encontrado que niveles bajos de progesterona durante la fase post-ovulatoria se pueden asociar directamente con problemas de fertilidad y abortos espontáneos.54
53 RAMMA. Óp. Cit., p. 10.
54 OKADA, Hidetaka. TSUZUKY, Tomoko. MURATA, Hiromi. Decidualization of the Human endometrium. Japón: Department of Obstetrics and Gynecology Reprod. Med Biol. 2018. (3): 220–227.
40
Definiendo la importancia que se da al proceso de decidualización, se analizó como posible factor contribuyente en el desarrollo de la pre-eclampsia planteando la posible diferencia encontrada en las dos variables definidas de los dos grupos celulares DSC-MEN y DSC-MP.
Como se denota en los resultados, se muestra una notable diferencia del proceso realizado por cada uno de los grupos celulares que fueron puestos en experimentación, ya que a partir del estímulo in vitro con el coctel decidualizador se demarca la diferencia, en cuanto a secreción de prolactina por parte de ambos grupos celulares, siendo mayor la secreción de prolactina por parte de las DSC-MEN.55
En paralelo con otros estudios al comparar y determinar posibles similitudes y diferencias, nos encontramos que no son muchas las investigaciones que se han realizado con similaridad a esta investigación, lo cual dificulta un poco la comparación entre diferentes resultados, ya que es un área de estudio en crecimiento y que todavía no se ha estudiado a profundidad. Se destaca que aquellas investigaciones que nos resultaron relevantes aportan información importante que nos sirvió para denotar que la investigación iba por buen camino.
En estudios realizados por Tamara y Col., se puede corroborar la similitud entre los resultados obtenidos en el presente estudio, ya que hacen uso de las mismas variables (Mujeres Con embarazo normal y Mujeres con Pre-eclampsia), pero empleando células endometriales como factor de experimentación. En el estudio realizado por Tamara y Col., demarcan las diferencias encontradas en el proceso de decidualización entre las células endometriales, con una menor secreción de prolactina por parte de las células endometriales de mujeres que desarrollaron pre-eclampsia. De igual forma ellos pudieron determinar factores genéticos como la expresión incorrecta de cerca de 129 genes luego de la decidualización de las células endometriales de mujeres que desarrollaron pre-eclampsia y defectos en la expresión de receptores importantes durante el proceso de decidualización (IGFBP-1, CNR-1 y La IL-1B) como factores determinantes en el desarrollo de los defectos en el proceso de decidualización por parte de las células endometriales humanas de cada una de las pacientes que fue analizada.56
55 GELLERSEN. Óp. Cit., p. 20.
56 GARRIDO, Tamara. Et al. "Defective decidualization during and after severe preeclampsia reveals a possible maternal contribution to the etiology." Estados Unidos: Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017. 114.40 E8468-E8477.
41
Partiendo de esta idea se puede definir la similitud en cuanto los factores involucrados en los defectos celulares que llevan a una decidualización incompleta o defectuosa, ya que se tiene en cuenta que el desarrollo de las células deciduales encontradas a nivel placentario, provienen de los cambios morfológicos y fisiológicos realizados por parte de las células endometriales durante los primeros meses de embarazo.57
En contraste, estudios realizados previamente por Paredes y Col, haciendo uso del líquido amniótico de mujeres en estado de embarazo, obtenido a partir de amniocentesis abdominal, muestra que los niveles de prolactina en mujeres que desarrollaron pre-eclampsia fueron mayores en etapas iniciales que para las mujeres que presentaban embarazos normales. Este incremento fue marcado durante el primer trimestre de embarazo, pero a medida que avanzaba el embarazo, denotaron que los niveles de prolactina en mujeres cuyo embarazo fue normal se mantenían en un nivel estable, mientras que para aquellas mujeres con pre-eclampsia los niveles de prolactina eran decrecientes, llegando a niveles muy bajos. Además demarcan que estos factores podrían fluctuar de manera individual teniendo en cuenta el desarrollo fisiopatológico de la enfermedad, ya que se han reportado casos de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia en etapas finales de su embarazo.58 Teniendo en cuenta lo encontrado por parte de Paredes y Col, se puede definir que se presentan posibles defectos durante el proceso de decidualización de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia ya que se demarca la disminución a nivel de la secreción de Prolactina por parte de las células deciduales en aquellas mujeres que desarrollaron esta patología.
En este estudio se encontraron varios limitantes en cuanto al desarrollo completo del mismo, debido principalmente a que durante la fase experimental, algunas de las células que fueron puestas en cultivo, no presentaban crecimiento o no alcanzaban la confluencia necesaria para ser puestas en estudio, además por factores económicos la muestra utilizada no podía ser tan grande, debido a los costos asociados a los medios cultivo, tratamiento con coctel decidualizador y determinaciones de prolactina que sobrepasaban el presupuesto destinado para esta investigación, por tanto la muestra correspondió únicamente a 3 grupos celulares de mujeres con embarazo normal y tres grupos celulares de mujeres con
57 SIMÓN, Carlos. Anatomía y Angiogénesis del endometrio humano. España: Universidad de
Valencia. 2009. p 2-9 58 PAREDES, Fredy. GOÑES, Carmen. Prolactina Decidual En El Primer Trimestre De Embarazos
Normales Y complicados Con Pre-eclampsia Severa. Perú: Ginecología y Obstetricia. 2002. Vol. 39
– N°17 p 78.
42
desarrollo de pre-eclampsia. Por tanto este estudio se presenta como una prueba piloto para futuras investigaciones que puedan ser realizadas y puedan basarse en los resultados previos arrojados por el mismo, ya que es pertinente analizar todos los puntos o factores influyentes, antes de concluir finalmente lo que se quiere estudiar, además de que es necesario tener una muestra mucho más grande que permita disminuir el margen de error.
A pesar de los limitantes encontrados al abordar el proyecto de investigación, pudimos encontrar diferencias significativas en cuanto al proceso de decidualización ejercido por parte de las DSC obtenidas de diferentes grupos celulares mencionados anteriormente en el presente escrito. De igual forma podemos definir a través de los resultados obtenidos y conforme a la literatura encontrada, teniendo en cuenta resultados analizados por otros investigadores, que el proceso de decidualización a pesar de no ser directamente el causante de la pre-eclampsia, si se encuentra alterado en esta patología y juega un papel importante que puede contribuir con el desarrollo de complicaciones que puedan afectar directamente el embarazo. La importancia de realizar estudios pertinentes y en pro de la salud materno-infantil, se presentan como problemáticas que se encuentran un tanto abandonadas y de las cuales aún surgen muchas dudas acerca del desarrollo o las causas que llevan al desarrollo de enfermedades complejas como la pre-eclampsia.
43
7. CONCLUSIONES
Los niveles de Prolactina secretados por parte de las células deciduales de mujeres con un embarazo normal se presentan de manera creciente desde el día 6 cuando se hace notable la secreción, hasta el día 15 que corresponde al último día de recolección de los sobrenadantes, a diferencia de las células deciduales de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia cuya secreción fue baja desde el día 6 y alcanza niveles muy bajos al día 15.
Las células deciduales provenientes de mujeres con desarrollo de pre-eclampsia mostraron menor respuesta frente al estímulo in vitro generado a partir por el cóctel decidualizador en contraste con las células deciduales de mujeres cuyo embarazo se desarrolla de manera normal, esto podría asociarse a posibles defectos durante el proceso de decidualización o una decidualización mucho más lenta, es necesario hacer uso de una muestra más grande que permita validar los resultados.
44
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda un estudio más grande que permita hacer uso de una muestra mucho más grande y descartar todas las variables presentadas durante la fase experimental, para poder validar los resultados encontrados y complementar los hallazgos previos generados por esta investigación.
45
9. ANEXOS
Anexo 1. Gráfico descongelación células deciduales
Las células en estado de crio-preservación a -195,8°C son sometidas a descongelación haciendo uso de baño maría, se re-suspenden con medio Optimen para darles sostenimiento inicial luego de estar crio-preservadas, se centrifugan a 1400 rpm y se re-suspenden con PBS al 1x, para garantizar un lavado más efectivo de las células y evitar posibles restos de otras sustancias que generen interferencia en los cultivos celulares, se centrifuga nuevamente a 1400 rpm y se adiciona el medio Optimen suplementado con SFB al 5% inactivado posterior a esto se realiza el pase de las células a los frascos de medio de cultivo para ser incubadas a 37°C con ATM de CO2 al 5%.
Anexo 2. Gráfico Cultivos celulares y Tratamiento con Coctel Decidualizador
46
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ÁLVAREZ, José, et al. Desenlace obstétrico antes y después del inicio de la artritis reumatoide. [En Línea] México: Revista Médica del Instituto Mexicano del Seguro Social. 2011. p 599-604. Disponible En: http://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=38616
BARBOSA, Miguel. Et al. Vigilancia De Morbilidad Materna Extrema En Una Institución De Referencia En Cali, Colombia, 2013-2014. [En Línea] Colombia: Clínica Rafael Uribe Uribe, En: Revista Colombiana de Ginecología y obstetricia. 2016. Vol 67 No 3 p215-222. Disponible En: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0034-74342016000300005&script=sci_abstract&tlng=es
BLANCO, Osmany. Las Células Deciduales Estromales Humanas Y Su Participación En La Tolerancia Materno-Fetal. Tesis de Doctorado. [En Línea] España: Universidad de Granada. 2009. p 184. Disponible En: https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=64094
BROSENS, Jan. et al. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. En: Endocrinology. 2001. vol. 140, no 10, p. 4809-4820. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10499541
CASTEJON, O. BELOUCHE, R. CASTEJON, V. células deciduales y trofoblasticas: Su interacción con la matriz Extracelular de fibrinoide. [En Línea] Venezuela: Facultad de ciencias de la Salud UDC En: Gaceta Médica de Caracas. 2001. Vol. 106 231-236. Disponible En: https://www.researchgate.net/publication/242224540_Celulas_deciduales_y_trofoblasticas_su_interaccion_con_la_matriz_extracelular_de_fibrinoide
CHO, Ju Wan. Et al. The progesterone receptor as a transcription factor regulates phospholipase D1 expression through independent activation of protein kinase A and Ras during 8-Br-cAMP-induced decidualization in human endometrial stromal cells. [En Línea] Corea: Biomedical Research Institute and Department of Biochemistry & Molecular Biology. 2011. BioChem. 436, 181–191. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21284604
47
DUNN L, Carolynn. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation. [En Línea] France: University of Edinburgh Chancellor’s Building. 2003. Vol 7. No 2. P 151 – 161. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14567882
DONGMEI, et al. Positive Regulation of Decidualization by L-Type Amino Acid Transporter 1 (lat1) in Pregnant Mice. Nutrients. 2016. vol. 8, no 11, p. 704. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5133091/
DURÁN, E. Comparación de Las células deciduales estromales humanas y sus precursoras las células endometriales: Fenotipo antigénico, diferenciación, apoptosis y relación funcional con linfocitos. Tesis Doctoral Inmunología. [En Línea] España: Universidad de Granada. 2011. 241p. Disponible En: https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=62755
GALLEGOS, S. et al. La placenta humana. [En Línea] Revisión México: Departamento de Medicina Materno Fetal Del instituto Nacional de Perinatología, En: Perinatología y Reproducción Humana. 2008. Vol 22- N°3 p 230 -240. Disponible En: http://www.medigraphic.com/pdfs/inper/ip-2008/ip083g.pdf
GARRIDO, Tamara. Et al. "Defective decidualization during and after severe preeclampsia reveals a possible maternal contribution to the etiology." [En Línea] Estados Unidos: Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017. 114.40 E8468-E8477. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28923940
GELLERSEN, Birgit. BROSENS, Jan. Cyclic AMP and progesterone receptor Cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. [En Línea] Alemania: IHF Institute for Hormone and Fertility Research, University of Hamburg, Hamburg, Journal of Endocrinology. 2003. 178, 357–372. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12967329
GELLERSEN, Birgit. BROSENS, Ivo. BROSENS, Jan. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. [En Línea] United Kingdom: Thieme Medical Publishers. ONN. 2007 p. 445-453. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17960529
48
GIUFFRIDA, et al. Does prolactin induce apoptosis? Evidences in a prostate cancer in vitro model. En: Journal of endocrinological investigation, 2010 vol. 33, no 5, p. 313-317. Disponible En: https://link.springer.com/article/10.1007/BF03346592
HAN. Et al. Treatment of human endometrial stromal cells with chorionic gonadotropin promotes their morphological and functional differentiation into decidua. Molecular and cellular endocrinology. 2002 147(1), 7-16. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10195687
HUANG, Jyun. Et al. NLRP7 contributes to in vitro decidualization of endometrial stromal cells. [En Línea] China: Reproductive Biology and Endocrinology. 2017. 15(1), 66. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28810880
JORGE P, Fisiología de la Prolactina, Madrid: Instituto de Investigaciones Biomédicas A. Sols CSIC/UAM (2005) p 5-14 Internet:
digital.csic.es/bitstream/10261/78144/1/Fisiología%20de%20la%20prolactina.pdf
LÓPEZ, Jaramillo. Et al. Metabolic syndrome and pre-eclampsia: contributions realized by the research Institute of the Colombian Cardiovascular Foundation. [En Línea] Colombia: Grupo VILANO. Instituto de Investigaciones, Fundación Cardiovascular de Colombia. Floridablanca. 2006. Rev Col.Cardiol Vol13 no.2. Disponible En: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-56332006000500006
MARTINEZ, Luis. Et al. El pronóstico de los hijos de madres con preeclampsia: Parte 2: efectos a largo plazo. [En Línea] Argentina: Archivos argentinos de pediatría. 2011. vol.109 no.6. Disponible En: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-00752011000600009
MARTINEZ, Jorge. Fisiología de la Prolactina. [En Línea] España: Instituto de Investigaciones Biomédicas A. Sols CSIC/UAM de Madrid. 2005. p 5-14. Disponible En: http://digital.csic.es/bitstream/10261/78144/1/Fisiolog%C3%ADa%20de%20la%20prolactina.pdf
49
MIKIHIRO, Yoshie. KAZUYA, Kusama. KASUHIRO, Tamura. Molecular mechanisms of human endometrial decidualization activated by cyclic adenosine monophosphate signaling pathways. [En Línea] Japón: Department of Endocrine and Neural Pharmacology, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences. 2015. J. Mamm. Ova Res. Vol. 32 (3). Disponible En: https://bioone.org/journals/journal-of-mammalian-ova-research/volume-32/issue-3/jmor.32.95/Molecular-Mechanisms-of-Human-Endometrial-Decidualization-Activated-by-Cyclic-Adenosine/10.1274/jmor.32.95.short
MIKHAILOV V M., Life Cycle of Decidual Cells. [En Línea] Rusia: Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg: International Review of Cytology. 2003. Vol. 227, p 45-63. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14518549
NAKAJIMA, Ryojun. Et al. Elevated vasoinhibin derived from prolactin and cathepsin D activities in sera of patients with preeclampsia. En: Hypertension Research. 2015. vol. 38, no 12, p. 899-901.Disponible En: https://www.nature.com/articles/hr201599
OKADA, Hidetaka. TSUZUKY, Tomoko. MURATA, Hiromi. Decidualization of the Human endometrium. [En Línea] Japón: Department of Obstetrics and Gynecology Reprod. Med Biol. 2018. (3): 220–227. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6046526/
PAREDES, Freddy. GOÑES, Carmen. Prolactina Decidual En El Primer Trimestre De Embarazos Normales Y complicados Con Pre-eclamsia Severa. [En Línea] Perú: En: Ginecología y Obstetricia. 2001. Vol. 39 – N°17 p 78. Disponible En: http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/ginecologia/vol_39n17/prolactina.htm
PETRO, Gustavo. Et al. Guía de trastornos hipertensivos del embarazo. [En Línea] Colombia: Alcaldía Mayor de Bogotá. 2014. Disponible En: http://www.saludcapital.gov.co/DDS/Publicaciones/Guia%20Maternidad-Trastornos_baja.pdf
RAMMA, W. AHMED, A. “Is Inflammation the Cause of Pre-Eclampsia?” [En Línea] United Kingdom: University/BHF Centre for Cardiovascular Sciences, Queen's Medical Research Institute, En: Biochemical Society Transactions. 2016. 1619-27 Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22103497
50
SANDOVAL, Yirddley. ESLAVA, Javier. Inequidades en mortalidad materna por departamentos en Colombia para los años 2000-2001, 2005-2006 y 2008-2009. [En Línea] Colombia: Instituto de Investigaciones Clínicas. Grupo de Equidad en Salud. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia. 2013. p 529-541. Disponible En: https://revistas.unal.edu.co/index.php/revsaludpublica/article/view/32805
SANCHEZ, Sixto. Actualización en la epidemiología de la preeclampsia: En: Rev. Perú. ginecol. obstet. 2014 Lima, v. 60, n. 4, p. 309-320. Disponible En: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2304-51322014000400007
SIMÓN, Carlos. Anatomía y Angiogénesis del endometrio humano. [En Línea] España: Universidad de Valencia En: El Endometrio Humano. 2009. p 2-9. Disponible En: http://media.axon.es/pdf/72138.pdf
SIVIGILA. Protocolo de Vigilancia en Salud Pública MORBILIDAD MATERNA EXTREMA. [En Línea] Colombia. 2016. Disponible En: http://www.cruevalle.org/files/PRO-Morbilidad-Materna-Extrema.pdf
SOCIEDAD ESPAÑOLA DE GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA. Protocolos Asistenciales en Obstetricia. 2006. Trastornos hipertensivos del embarazo. Disponible En: https://sego.es/documentos/gap/61-Trastornos-Hipertensivos-del-Embarazo1.pdf
STEVENS, W. Et al. Short-term costs of preeclampsia to the United States health care system. [En Línea] Los Angeles: Precision Health Economics. .2017. p 237-248. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28708975
TABIBZADEH, S. BABAKANI, A. The signals and molecular pathways involved in implantation, a symbiotic interaction between blastocyst and endometrium involving adhesion and tissue invasión. [En Línea] South Florida: Tampa Department of pathology. En: Human Reprod. Jun 10, 2000, p 1579-1602. Disponible En: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7593542
51
VARGAS, Manuel P. Desarrollo Y Fisiología Placentaria. [En Línea] Ciudad de México: Hospital de México. Obstetricia. 2016. p 1-10. Disponible En: http://medicina-ucr.com/cuarto/wp-content/uploads/2016/01/OB03-Desarrollo-y-fisiolog%C3%ADa-placentaria-Dr.-Vargas-Prado.pdf
VARGAS, Manuel. ACOSTA, Gustavo. MORENO, Mario. La preeclampsia un problema de salud pública mundial. [En Línea] México: Laboratorio de Inmunobiología. Hospital Juárez de México, Secretaría de Salud, México DF .2012. 471-476. Disponible En: http://www.revistasochog.cl/files/pdf/DOCUMENTOS029.pdf
WARREN, Stevens, et al. Short-term costs of preeclampsia to the United States health care system. En: American Journal of Obstetrics and Gynecology. 2017. 237-248.e16
ZAKIYAH, Neily, et al. Pre-Eclampsia Diagnosis and Treatment Options: A Review of Published Economic Assessments. [En Línea] Netherlands: Unit of PharmacoEpidemiology and PharmacoEconomics, Department of Pharmacy. 2015. 1069-82. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26048352
