Come studiamo le celluleCome studiamo le cellule

Osserviamo le cellule al microscopio Osserviamo le cellule al microscopio per ricavarne delle informazioni per ricavarne delle informazioni morfologichemorfologiche

(e non solo)(e non solo)

Microscopi dirittiMicroscopi diritti

Microscopio rovesciatoMicroscopio rovesciato

•A luce trasmessa in campo chiaro•A contrasto di fase o a contrasto interferenziale•A fluorescenza

Microscopia

Microscopia in campo Microscopia in campo chiarochiaro

cellule non colorate (IgrOv fissate cellule non colorate (IgrOv fissate in paraformaldeide)in paraformaldeide)

HL60HL60

Microscopia in campo Microscopia in campo chiarochiaro cellule SaOs colorate cellule SaOs colorate

(cellule adese)(cellule adese)

Microscopia in campo Microscopia in campo chiarochiaro

cellule Jurkat coloratecellule Jurkat colorate

Contrasto di fase e Contrasto di fase e contrasto interferenzialecontrasto interferenziale

Rat-1 fibroblasti di ratto 20 X

Cos-7 fibroblasti di rene di scimmia trasfettati con SV40

Si basa sul fenomeno dell'Si basa sul fenomeno dell'interferenzainterferenza luminosa. luminosa.

Il preparato viene illuminato da un fascio Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso suddiviso a livello del luminoso suddiviso a livello del condensatore in due porzioni di fase condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di differente e con diverso angolo di incidenza. incidenza.

Il cambiamento ulteriore di fase dovuto Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla porzione di luce che attraversa il alla porzione di luce che attraversa il campione, andandosi a ricombinare con campione, andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili la luce non rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. rifrazione differente da quello del mezzo.

Microscopio a contrasto di Microscopio a contrasto di fase fase 

In campo biologico, la maggior parte In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di a causa dell'elevata presenza di acqua.acqua.

Tuttavia le radiazioni luminose una Tuttavia le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subisconoun organello cellulare, subiscono dei dei cambiamenti di fase che dipendono cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura indice di rifrazione della struttura oltrepassataoltrepassata. .

Tramite la microscopia a Tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. è l'organizzazione cellulare.

La tecnica in questione fu messa La tecnica in questione fu messa a punto dal fisico olandese a punto dal fisico olandese Frederik Zernike (Frederik Zernike (FritsFrits ZernikeZernike) ) negli negli anni cinquantaanni cinquanta e gli valse il  e gli valse il Premio NobelPremio Nobel per la  per la fisicafisica nel  nel 19531953..

Microscopia a Microscopia a fluorescenzafluorescenza

Cos-7 Cellule trasformate di rene di scimmia.

Immagine a falsi colori

DNA rosso mitocondri blu F-actina verde

Microscopia di fluorescenza Immagine a falsi coloriNetwork di microtubuli rosso F-actina verdeDNA blu

Cos-7 Cellule trasformate di rene di scimmia.

Cos-7 Cellule trasformate di rene di scimmia.

Microscopia di fluorescenza Immagine a falsi colorimitocondri giallo F-actina rossoDNA verde

Perche’ nella Perche’ nella microscopia a microscopia a

fluorescenza si vedono fluorescenza si vedono cosi’ tanti dettagli?cosi’ tanti dettagli?

Ogni molecola fluorescente emetteOgni molecola fluorescente emette luce, se opportunamente eccitata. E’ come se luce, se opportunamente eccitata. E’ come se

legassimo delle lampadine alle strutturelegassimo delle lampadine alle struttureche vogliamo evidenziare che vogliamo evidenziare

Cos-7 marcate perCos-7 marcate per evidenziare i mitocondrievidenziare i mitocondri

in fluorescenza in fluorescenza

Saos marcate per evidenziare i mitocondriSaos marcate per evidenziare i mitocondriin microscopia a campo chiaroin microscopia a campo chiaro

Limite di risoluzione del Limite di risoluzione del microscopiomicroscopio

Dipenda dalla lunghezza d’onda della Dipenda dalla lunghezza d’onda della “luce” utilizzata per illuminare il “luce” utilizzata per illuminare il preparatopreparato

  Il cosiddetto criterio di Abbe limita Il cosiddetto criterio di Abbe limita infatti la risoluzione massima a circa 0.5 infatti la risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per un sistema ottico avente λ/(n sin θ) per un sistema ottico avente apertura numerica n sin θ, che impieghi apertura numerica n sin θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. luce di lunghezza d’onda λ. Per luce Per luce nello spettro visibile essa si attesta nello spettro visibile essa si attesta sui sui 0.2 ÷ 0.4 µm0.2 ÷ 0.4 µm..

Tipi di Coltura di Cellule “in Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”vitro”

Coltura Primaria Coltura Coltura Primaria Coltura SecondariaSecondaria

Coltura Primaria

●Coltura preparata direttamente da un tessuto: le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita)Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo

Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine

Ciclo vitale di Cellule Primarie

●●Isolamento di ceppi clonaliIsolamento di ceppi clonali:: il programma genetico della il programma genetico della senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotteindotte

●● Derivazione: Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali genetiche di colture primarie non tumorali

Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerosecancerose

VantaggiVantaggi: : cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarieriproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie

SvantaggiSvantaggi:: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellularecellulare

Linea Cellulare Continua

Coltura PrimariaColtura Primaria

Coltura a breve termineColtura a breve termine Coltura a Coltura a lungo terminelungo termine

< 10 duplicazioni 50-60 < 10 duplicazioni 50-60 duplicazioniduplicazioni

Coltura SecondariaColtura Secondaria

Linea Cellulare Linea Cellulare ContinuaContinua

>1>150-200 duplicazioni50-200 duplicazioni

Linea Cellulare ContinuaLinea Cellulare Continua

Capacità di crescere Capacità di crescere indipendentemente indipendentemente dall’organismo da cui è dall’organismo da cui è derivataderivata

Crescita ininterrotta per oltre Crescita ininterrotta per oltre un announ anno

ImmortaleImmortale

Le prime Linee Cellulari Le prime Linee Cellulari ContinueContinue

1952, Johns 1952, Johns Hopkins Hopkins UniversityUniversity

1963, University 1963, University of Ibadanof Ibadan

HELA RAJI

Osserviamo le coltureOsserviamo le colture Le cellule devono essere coltivate in Le cellule devono essere coltivate in

appositi recipienti.appositi recipienti.

Le cellule devono essere Le cellule devono essere coltivate coltivate

in appositi terreniin appositi terreniDiversi tipi di terreni adattiDiversi tipi di terreni adatti alle diverse linee cellularialle diverse linee cellulari

Siero animale, di solitoSiero animale, di solitoSiero Fetale Bovino (FCS)Siero Fetale Bovino (FCS)

Altri supplementi: antibiotici, Altri supplementi: antibiotici, glutamina ecc.ecc.glutamina ecc.ecc.

Medium di ColturaMedium di Coltura

●●I terreni base disponibili in commercio contengono I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle celluledelle cellule

●●I più comuni terreni base di coltura:I più comuni terreni base di coltura:

-MEM:-MEM: Minimum Essential Medium Minimum Essential Medium

-DMEM:-DMEM: Dulbecco’s modification of MEM Dulbecco’s modification of MEM

-RPMI:-RPMI: Roswell Park Memorial Institute Roswell Park Memorial Institute

Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosiosali e per la concentrazione di glucosio

acquaacqua

Medium di Coltura Sali inorganici

▪ Cloruro di calcio anidro▪ Solfato di magnesio anidro▪ Cloruro di potassio▪ Nitrato di potassio▪ Cloruro di sodio▪ Fosfato di sodio bibasico▪ Bicarbonato di sodio

Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo

Sali inorganiciSali inorganici

Nutrienti a basso peso Nutrienti a basso peso molecolaremolecolare

Medium di Coltura Zuccheri

Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonioper le biosintesi

Glucosio

Medium di Coltura Vitamine

BiotinaPantotenatoAcido folicoInositoloNicotinamidePiridossinaRiboflavinaTiaminaVitamina B12

Agiscono come catalizzatori o come substratiper facilitare o controllare alcune funzionimetaboliche

Medium di ColturaAmminoacidi-isomeri L

Alanina ArgininaAsparaginaAcido asparticoCisteinaGlutaminaAcido glutamicoGlicinaIstidinaIsoleucina

LeucinaLisinaMetioninaFenilalaninaProlinaSerinaTreoninaTriptofanoTirosinaValina

Necessari per la sintesi delle proteine

Medium di ColturaMedium di Coltura

Il terreno base viene conservato a 4°C Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di essere utilizzato, viene e, prima di essere utilizzato, viene complementato con:complementato con:

Glutammina Glutammina (aa essenziale molto labile)(aa essenziale molto labile) AntibioticiAntibiotici (penicillina/streptomicina) (penicillina/streptomicina) Siero Siero (supplemento più comune delle (supplemento più comune delle

colture cellulari)colture cellulari)

SIEROSIERO Miscela complessa di proteine ed elementi Miscela complessa di proteine ed elementi

fondamentali per la crescita fondamentali per la crescita in vitroin vitro della della maggior parte delle cellulemaggior parte delle cellule

Fattori di crescita:Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione:Fattori di adesione: fibronectina, fibronectina,

vitronectinavitronectina Altri elementi: Altri elementi: trasferrina, albumina, trasferrina, albumina,

colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali elementi minerali

Il siero di uso più comune è il siero fetale di Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)bovino (FBS)

Allestimento e Allestimento e propagazionepropagazione

1.1. Controllo della coltura al prelievo Controllo della coltura al prelievo dall’incubatore: dall’incubatore: colorecolore e e torbidita’.torbidita’.

1.1. Osservazione della fiasca al Osservazione della fiasca al microscopio rovesciato: valutazione microscopio rovesciato: valutazione della densita’ cellulare, della presenza della densita’ cellulare, della presenza di cellule staccate o con morfologie di cellule staccate o con morfologie strane. strane.

Saos 2 A DIVERSA Saos 2 A DIVERSA CONFLUENZACONFLUENZA

HL-60 trattate con una sostanza che le HL-60 trattate con una sostanza che le differenzia in macrofagi. A) HL-60 non differenzia in macrofagi. A) HL-60 non

differenziate B) differenziatedifferenziate B) differenziate

HL60 differenziate in HL60 differenziate in cellule aderenticellule aderenti

ContaminazioniContaminazioni

BatteriBatteri FunghiFunghi LievitiLieviti MicoplasmiMicoplasmi

Contamination

•Happens to even the best…

•Fungal – yeast

•Bacterial

•Mycoplasma - fi lterablebacteria which will passacross 0.2 µm fi lter. Bigproblem. I t is treated withcephalosporin antibiotics.Can take over laboratories.

http://web.uct.ac.za/depts/biomed/Cellculture_05-1.ppt

HL60 infettate da HL60 infettate da micoplasmi marcate con un micoplasmi marcate con un

colorante per il DNA colorante per il DNA

Antibiotici?Antibiotici?

Da usare con discernimentoL’utilizzo continuo puo’ creare forme di antibiotico resistenzaMolto usati cocktail di Penicillina e streptomicina o gentamicina e fungizone