COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE -...

COLORAZIONI

ISTOMORFOLOGICHE

CLASSIFICAZIONE DELLE COLORAZIONI:

Le colorazioni, indipendentemente dal meccanismo d’azione del

colorante, possono essere divise in due gruppi:

1.colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto nervoso,

collagene, ecc...);

2. colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze

chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).

COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):

L’ematossilina è una sostanza vegetale isolata da un estratto di legno azzurro

(legno di campeggio, Haematoxylum campechianum ) un albero originario del

centro America. Questa è di per sé incolore (o si presenta sotto forma di

cristalli giallo-bruni) incapace di colorare. Il vero colorante non è

l’ematossilina, ma il suo prodotto di ossidazione: l’emateina (per questo

all’ematossilina vanno aggiunte sostanze ossidanti come il permanganato di

potassio, l’idrato di potassio, iodato di sodio, ecc.).

Ematossilina Emateina


L’emateina è colorata e costituisce il cromoforo, è anionica e non ha particolari

affinità con gli acidi nucleici. Per conferire al composto una carica positiva è

necessario aggiungere un mordente (ad es. l’allume potassico: KAl(SO4)2 ·

12H2O) che costituirà con l’emateina, una lacca relativamente insolubile:

l’emallume. L’ematossilina più usata nel laboratorio e’ quella di Mayer, ed e’ così

costituita:

-ALLUME DI POTASSIO;

-EMATOSSILINA;

-IODATO DI SODIO;

-ACIDO CITRICO;

-CLORALIO (tossico; corrosivo).

Alcuni metodi di colorazione comportano una mordenzatura. Questa operazione consiste nel trattare il tessuto con un composto capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali a loro volta, potranno legarsi con un colorante basico o acido. Il composto che costituisce questo termine di collegamento fra il tessuto e il colorante è detto mordente .

EMATEINAEMATEINA ossidazione di ematossilina ossidazione di ematossilina

Compl. con Al Compl. con Al EMALLUME (Mayer - Carazzi) EMALLUME (Mayer - Carazzi)

Fe Fe EMAT. HARRIS (Lillie) EMAT. HARRIS (Lillie)

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)

progressiveprogressive - Differenziazione- DifferenziazioneEmatossilineEmatossiline

regressiveregressive - pH- pH


A seconda del mordente usato, alluminio, ferro, cromo, ecc..., si

distinguono ematossiline alluminiche (o emallumi), ematossiline

ferriche, ematossiline cromiche, ecc... .

Le soluzioni ematossiliniche emalluminiche più usate in istologia sono:

1. Ematossilina di Mayer;

2. Ematossilina di Harris;

3. Ematossilina di Delafield;

4. Ematossilina di Carazzi;

5. Ematossilina di Ehrlich.

1. Ematossilina di Weigert;

2. Ematossilina di Heidenhain.


L’eosina è un colorante artificiale debolmente acido, di cui esistono

varie forme, che colora i citoplasmi, il tessuto connettivo e la

sostanza intercellulare in varie tonalità di rosa. L'eosina è

chimicamente una tetrabromofluoresceina. Più precisamente, sono di

comune utilizzo due molecole di eosina denominate Y e B.

Eosina Y Eosina B

• sezioni in H2O distillata

• Emallume acido di Mayer, filtrato ( 7’)

• lavare H2O corrente (10’)

• Eosina [0.25 %], acidificata con qualche

goccia di CH3COOH (1’)

• lavare in H2O distillata (2’)

• disidratare in etanolo 95° (4’)

• disidratare in etanolo 100° (4’) (3 cambi)

• chiarificare in xilolo (3 cambi)

• montare in mezzo d’inclusione (Entellan

o balsamo Canada)


Risultati:

Nucleo Blu - viola

Citoplasma Rosa - rosso

EMATOSSILINA DI EHRLICH

METODI CITOLOGICI

La colorazione EE può essere descritta come un metodo che si

utilizza per lo studio topografico e generale per tessuti e organi.

Ci sono però alcuni metodi in grado di mettere in evidenza strutture

specifiche: ci sono quindi metodi che evidenzieranno il connettivo

piuttosto che il tessuto nervoso, ma anche tecniche per lo studio

fine di organuli cellulari.

METODI CITOLOGICI CON COLORAZIONE REGRESSIVA DI LACCHE DI EMATOSSILINA

Si tratta di metodi di cui non si conosce ancora appieno il

meccanismo di azione.

EMATOSSILINA FERRICA (Metodo di Heidenhain)

Metodo di elezione per lo studio della cariocinesi. Regolando la

differenziazione si possono mettere in evidenza anche i centrioli o

inclusioni citoplasmatiche.

EMATOSSILINA FERRICA

STUDIO DEI TESSUTI E DEGLI ORGANI

TESSUTO NERVOSO

TESSUTO NERVOSO

Tra le prime tecniche per lo studio del tessuto nervoso vanno

ricordate quelle per mettere in evidenza i Corpi di Nissl.

Uno di questi metodi prevede l’uso del Cresyl Violet. Si tratta di un

colorante basico che lega rapidamente le componenti acide del

citoplasma dei neuroni (soprattutto l’RNA dei ribosomi, compresi i

nuclei). Questo colorante mette ben in evidenza i Corpi di Nissl che

sono appunto aggregazioni del RER tipiche dei neuroni.

Risultati:

RNA nero

Altre strutture viola

Altri metodi impiegano l’uso del Blu di Toluidina.

Metodo di GOLGI-CAJAL

Per quanto riguarda lo studio della forma dei neuroni si possono

usare alcuni metodi colorimetrici sia vitali che non (un esempio di

colorazione vitale usata nei vertebrati è quella con il Blu di

Metilene). Risultati migliori si ottengono mediante impregnazioni

metalliche elettive. Fra questi metodi il più noto è quello

dell’impregnazione cromoargentica di Golgi (sec. Cajal) che utilizza la

precipitazione elettiva di cromato di argento sulle cellule nervose

quando queste sono state preventivamente fissate con tetraossido

di osmio e bicromato di potassio. Oltre l’argento si può usare anche

l’oro.

Metodo di BIELSCHOWSKY per neurofibrille

Metodo di elezione per la visualizzazione di neurofibrille, assoni,

dendriti, placca senile. I metodi di impregnazione argentica sono fra

i metodi più comunemente usati in neuroistologia.

Il principio su cui si basano le tecniche di impregnazione è il

seguente: l’argento, presente in alcuni composti allo stato di

ossidazione +1 (es. AgNO3), può essere ridotto da alcune componenti

tissutali allo stato metallico insolubile.

Selettività del metodo Bielschowsky: il diverso grado di argirofilia

degli elementi cellulari presenti del tessuto nervoso permette

attraverso una opportuna calibrazione della soluzione riducente di

evidenziare selettivamente neurofibrille, assoni, dendriti, placca

senile.

TESSUTO NERVOSO (Luxol Fast Blue)

Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li

colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool

isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina

integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di

Schwann). Tale colorazione è spesso associata al Cresyl Violet

(Metodo di Klüver-Barrera).

Risultati:

Mielina blu-azzurro

Luxol Fast Blue:

Rame ftalocianina solfonata

(X=SO3-)

Klüver-Barrera

TESSUTO CONNETTIVO

AZAN-MALLORY (AM)Colorazione AZAN (acronimo di AZocarmine-ANilin blue) modificata da Mallory. E’

una delle tecniche di colorazione utilizzate per mettere in evidenza le fibre collagene

del tessuto connettivo.

Il metodo associa una colorazione citologica ottenuta tramite un colorante acido

(azocarminio) ad una colorazione di contrasto effettuata con blu di anilina dopo

mordenzatura con acido fosfotungstico. Per ottenere buoni risultati occorre

sovracolorare con azocarminio, quindi differenziare lentamente con alcol-anilina, al

fine di evitare che la colorazione di contrasto predomini

AzocarminioBlu di anilina

AZAN-MALLORY (AM)

Si utilizzano in sequenza due coloranti:

-Azocarminio (colora i nuclei in rosso vivo ed il citoplasma in rosso

chiaro)

-Miscela di Mallory (Blu d’anilina, Orange G e acido ossalico, evidenzia

il connettivo in azzurro).

Risultati:

Collagene, reticolo, granuli basofili (ipofisi) blu-azzurro

Neurofibrille rossastro

Muscolo arancio

Nuclei, eritrociti e granuli acidofili (ipofisi) rosso

Granuli citoplasmatici delle cellule delta dell’ ipofisi azzurro

Il meccanismo di colorazione non è ancora completamente compreso. Alcune spiegazioni propongono che l'acido fosfotungstico funga da mordente per legare i colori basici al tessuto.

COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA (MGG):

COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA:

È una doppia colorazione utilizzata normalmente per colorare gli

strisci di sangue (simile al metodo Wright-Giemsa). Il sangue viene

strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per almeno 30 min.

all’aria e colorato prima con la miscela di May-Grüwald (blu di

metilene, colorante basico, e eosina, colorante acido). Segue poi un

lavaggio e una colorazione con l’eosinato azzurro (colorante di

Giemsa) composto da eosina giallastra, blu di metilene, azzurro A e B

e violetto di metilene.

Risultati:

Globuli rossi rosa-arancio

Nuclei dei leucociti blu-porpora

Granuli eosinofili rosso brillante

Granuli basofili blu Blu di metilene

Linfocita

BasofiloMonocita

AcidofiloPiastrine

Neutrofilo

VERHOEFF – VAN GIESON (VVG)

Si tratta di un metodo combinato. Il metodo di Verhoeff è una colorazione

specifica per le fibre elastiche (in particolare per la proteina elastina). La

colorazione di Van Gieson è specifica per il collagene. In questo metodo le

sezioni sono colorate regressivamente con ematossilina (usando un eccesso

di mordente, il cloruro ferrico, in modo da avere una maggiore affinità della

stessa ematossilina ferrica per le fibre elastiche rispetto agli altri

elementi).

Risultati:

Fibre elastiche blu-nero Collagene rosso

Nuclei blu-nero Altri elementi giallo

WEIGERT - VAN GIESON (WvG):

Metodo combinato per la visualizzazione sul medesimo preparato delle

fibre elastiche, del connettivo, del collagene e dei nuclei.

Il metodo (Weigert “metodo lungo”) sfrutta l’ affinità per le fibre

elastiche del precipitato (cresofucsina) ottenuto facendo reagire

resorcina, fucsina basica e cristalvioletto con perclorato di ferro. La

specificità del metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e

membrane basali possono colorarsi; è quindi importante una accurata differenziazione per ottenere una colorazione marcata e selettiva delle

fibre elastiche. Il contrasto con la colorazione tricromica di Van Gieson

permette di differenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel

contempo anche i nuclei.

Applicazione : fibre elastiche.

Risultati Fibre elastiche da blu scuro a nero Nuclei neri Collagene rosso,Connettivo, eritrociti, ecc giallo

Weigert - Van Gieson:

Fucsina basica

Resorcina

Cristalvioletto

TRICROMICA DI GOLDNER:

Una colorazione è detta tricromica quando si usano due o più coloranti per

tingere differenzialmente diverse strutture istologiche.

Il metodo della tricromica di Goldner (conosciuto anche come Masson-

Goldner) utilizza l’ematossilina, rosso Ponçeau, orange G e light green.

Risultati:

Strutture basofile (come la cromatina) marrone-nero

Strutture debolmente acidofile (cartilagine) rosso-arancio

Strutture fortemente acidofile (fibre collagene, osso) azzurro-verde

Rosso Ponceau Orange G Light green

TRICROMICA DI MASSON:

Metodo di elezione per il tessuto connettivo, particolarmente

indicato per gameti, nuclei, neurofibrille, nevroglia, collagene,

cheratina, fibrille intracellulari e immagini in negativo dell’ apparato

di Golgi.

Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con ematossilina

ferrica di Weigert, una colorazione delle emazie con acido picrico e

una colorazione del connettivo con due differenti coloranti acidi

(Light Green oppure blu di anilina/blu di metilene)

Risultati :

Nuclei e gameti nero

Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili rosso

Collagene, muco, granuli basofili dell’ipofisi blu /verde

Eritrociti giallo

PENTACROMICA DI MOVAT:

Questo metodo, piuttosto lungo e laborioso, consente di rivelare

contemporaneamente le mucosostanze acide e i diversi componenti

del connettivo. Coloranti utilizzati: alcian blu, resorcifucsina, blu di

celestina sec Culling, ematossilina di Weigert e miscela di Van

Gieson.

Risultati:

Mucine acide e sostanza fondamentale blu

Collagene rosso

Elastina rosso purpureo

Muscolo giallo

Neclei neri

Tessuto osseoPer l’osservazione microscopica del tessuto osseo si utilizzano tecniche particolari che tengono conto della struttura dura e mineralizzata dell’osso stesso. Per allestire un preparato sottile di tessuto osseo per l’osservazione microscopica vengono generalmente impiegate delle varianti delle procedure tradizionali che possono essere schematizzate come segue:

1) METODI PER DECALCIFICAZIONE

2) METODI PER USURA

I metodi per decalcificazione servono per mantenere la componente organica dell’osso, a scapito tuttavia della componente minerale che viene più o meno completamente rimossa. Il frammento di osso da esaminare viene fissato subito dopo il prelievo, al fine di preservare al meglio la morfologia delle cellule e l’integrità delle molecole organiche della sostanza intercellulare. Successivamente si procede alla rimozione della componente minerale, che viene dissolta chimicamente mediante il soggiorno del frammento in una soluzione acida. Per queste tecniche si possono usare o soluzioni di acidi organici (es. acido citrico, acido ascorbico) o di chelanti del calcio (es. acido etilendiamminotetraacetico o EDTA, acido etilenglicoltetraacetico o EGTA), che rimuovono la parte inorganica senza troppo danneggiare la parte organica. Una volta rimosso il minerale, il campione viene trattato come qualunque altro campione molle: inclusione in paraffina, sezionamento con microtomo e colorazione.

Osso – Metodo per decalcificazione

I metodi per usura sono utilizzati quando si vuole preservare la componente minerale (ma anche la componente organica – collagene – mineralizzata). La componente cellulare (componente organica non mineralizzata) viene eliminata facendo macerare in acqua (per un tempo sufficiente) il frammento osseo prelevato. Successivamente dal frammento macerato viene tagliata manualmente una sezione piuttosto spessa che viene fatta asciugare e poi aderire ad un vetrino portaoggetto tramite una goccia di mezzo di montaggio (es. balsamo del Canadà o balsami sintetici). Una volta che questo si è solidificato, la sezione di osso viene lavorata con carta abrasiva a grana decrescente, fino a ridurla per usura ad uno spessore sufficientemente sottile da renderla attraversabile dalla luce. Viene poi messo sopra il montante e il vetrino coprioggetto.

Osso – Metodo per usura

COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE -...

Documents

Transcript of COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE -...