Kit ELISA per il dosaggio degli Immunocomplessi dell’antigene prostatico specifico (PSA-IgM) nel Carcinoma Prostatico

PROS

TATE-IC

L I F E B I O T E C H N O L O G YL I F E B I O T E C H N O L O G Y

XEPTAGENXEPTAGENL I F E N A N O T E C H N O L O G YL I F E N A N O T E C H N O L O G Y

40% dei casi rispetto al 22% ottenuto con PSA (cut off 10 ng/mL). Nella differenziazione degli iperplastici PSA-IgM mostra una specificità pari all’ 88% rispetto al 71% ottenuto con PSA (Tab. 1).

Figura 1: Istopatologia del carcinoma prostatico. Fonte: Otis Brawley, AV-9612-438.

Nell’intervallo compreso tra 4 e 10 ng/mL , il valore predittivo positivo (PPV = 77%) e il valore predittivo negativo (NPV = 60%) ottenuti con PSA-IgM sono entrambi più elevati di quelli ottenuti con PSA a 4 ng/mL (PPV = 46%, NPV = 20%) e PSA a 10 ng/mL (PPV = 42%, NPV = 48%). Inoltre, la combinazione dei risultati dei test PSA-IgM e PSA permette di aumentare il numero dei pazienti correttamente diagnosticati rispetto ai test considerati singolarmente, dimostrando il buon grado di complementarietà dei due test e supportando la validità di PSA-IgM come marcatore per il carcinoma prostatico (1-6).

Aumento specificità diagnostica del PCa

Migliore distinzione tra PCa e BPH

Riduzione di biopsie prostatiche negative

Il carcinoma della prostata (PCa) è oggi il tumore più diffuso nella popolazione maschile e da diversi anni si registra un costante aumento del numero di morti dovuti a PCa anche in aree geografiche in cui esso non era particolarmente presente. Il PCa colpisce uomini con età superiore ai 55 anni, con un tasso di sopravvivenza a cinque anni superiore al 70%. La maggior parte dei decessi dipende da diagnosi tardive e una diagnosi precoce può, più che in altri tumori, determinare la differenza in termini di guarigione. Per formulare la diagnosi del tumore vengono utilizzate l'esplorazione rettale, l'ecografia prostatica trans-rettale, l’esame sierologico dell’antigene prostatico specifico (PSA) e la biopsia, che rimane comunque il metodo più sicuro. Il test del PSA, di cui sono state sviluppate diverse varianti che comprendono la densità del PSA, la velocità del PSA, la percentuale di PSA libero su quello totale e gli intervalli corretti per età ed etnia, da un lato ha rivoluzionato la diagnosi del carcinoma prostatico dall’altro ha aumentato i problemi di sovradiagnosi a causa della scarsa accuratezza diagnostica. I valori di PSA, infatti, possono risultare elevati, oltre che nei casi di carcinoma prostatico, anche in casi di affezioni prostatiche benigne (ipertrofia prostatica benigna, prostatiti batteriche) o di traumi e manipolazioni prostatiche. Il valore di PSA al di sopra del quale deve essere posta l’attenzione è di 4 ng/mL in quanto possibile segno di patologia neoplastica, con particolare riguardo all’intervallo compreso tra 4 e 10 ng/mL definito “zona grigia”.Xeptagen ha sviluppato un nuovo kit diagnostico (Prostate-IC) basato sulla scoperta che il PSA complessato con IgM (PSA-IgM) ha un’accuratezza diagnostica superiore rispetto al PSA (1) (Fig. 2). Nei donatori sani i livelli sierici di PSA-IgM risultano sempre negativi (cut off di 145.1 AU/mL), mentre nel gruppo dei tumori tali livelli sono superiori al cut-off nel

Kit ELISA per il dosaggio degli Immunocomplessi dell’antigene prostatico specifico (PSA-IgM) nel Carcinoma Prostatico

code XG007 PROSTATE-IC

Figura 2: Box-plot dei livelli sierici di PSA e PSA–IgM nei pazienti con carcinoma prostatico e iperplasia prostatica benigna. Il box rappresenta il primo ed il terzo quartile e la linea di mezzo è la mediana.

PS

A (n

g/m

L)

PS

A-Ig

M (A

U/m

L)

1

10

100

PCa BPH10

100

1000

10000

PCa BPH

125,0,0

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TATE-IC

rev. 2

L I F E B I O T E C H N O L O G YL I F E B I O T E C H N O L O G Y

XEPTAGENXEPTAGENL I F E N A N O T E C H N O L O G YL I F E N A N O T E C H N O L O G Y

y = 0.5295Ln(x) - 0.4015

R2 = 0.9987

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

10 100

PS A-IgM [Au/ mL]

ΔO

D@

45

0 n

m

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 2 4 6 8 10 12

PS A-IgM [AU/ mL]

ΔO

D@

45

0 n

m

y = 0.0775x + 0.0285

R2 = 0.9912

Dispensare 100 μL/well dei campioni diluiti 1:50 (in duplicato). Usare il buffer di diluizione XG-DB5 come diluente. Dispensare inoltre 100 mL/well di buffer di diluizione XG-DB5 come bianco. Incubare la piastra 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la piastra 6x con XG-WB2.

Anticorpo secondario: Aggiungere 100 μL/well di coniugato XG-EA ed incubare 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la piastra 6x con XG-WB2.

Rivelazione: Aggiungere 100 μL/well di soluzione cromogena XG-CH3. Lasciare incubare al buio e leggere i valori di densità ottica (OD) di ciascun pozzetto usando un lettore per micropiastre equipaggiato con un filtro a 650 nm. Alternativamente aggiungere 100 μL/well di soluzione di arresto XG-ST3 e misurare i valori di OD di ciascun pozzetto utilizzando il lettore di micropiastre equipaggiato con un filtro a 450 nm. Leggere la colorazione della reazione bloccata entro 1 ora.

ELABORAZIONE DEI RISULTATI

Figura 3A: Intervallo di linearità di una tipica curva standard del kit Prostate-IC dopo 15 min di incubazione con il substrato ed aggiunta della soluzione di arresto.

Figura 3B: Intervallo di linearità di una tipica curva standard del kit Prostate-IC dopo 15 min di incubazione con il substrato ed aggiunta della soluzione di arresto.

XEPTAGEN SpAParco Scientifico VEGA – Edificio Auriga

Via delle Industrie, 930175 Marghera (VE) – Italia

Tel.: +39 041 509 3910Fax: +39 041 509 3884

info@xeptagen.comwww.xeptagen.com

Biomarcatore Sens Spec PPV NPV

PSA-IgM (145,1 AU/mL) 40% 88% 77% 60%

PSA (4 ng/mL) 84% 4% 46% 20%

PSA (10 ng/mL) 22% 71% 42% 48%

PSA (10 ng/mL) o PSA-IgM (145,1 AU/mL) 60% 63% 61% 62%

PSA (>4 e <10 ng/mL) e PSA-IgM (145,1 AU/mL) 43% 88% 76% 55%

Tabella 1: Confronto degli indici di sensibilità (Sens), specificità (Spec), valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV) di PSA-IgM e PSA nei pazienti con carcinoma prostatico (n = 50) e pazienti con iperplasia benigna (n = 51). Tra parentesi vengono indicati i valori di cut-off utilizzati.

REFERENZE1. Beneduce et al. Annual Congress (EAU), Parigi 5 – 8

Aprile, 2006 2. Beneduce et al. Cancer Detect Prev, 2007,

31(5):402-7 3. Prayer-Galetti et al. Congresso Nazionale (SIU),

Bologna, 17- 21 Giugno 20064. Prayer-Galetti et al. Congresso Nazionale (SIU), Bari 27

Settembre - 1 Ottobre 20075. Zani et al. Congresso Nazionale (SIU), Roma, 22-28

Settembre 20086. Zani et al. Congresso Nazionale (SIU), Rimini 4-7

Ottobre 2009

REAGENTI E MATERIALI FORNITIXG007-PL: una piastra multistrip da 96 pozzetti, sensibilizzata con anticorpo di coniglio anti-PSA.XG007-Calibratore: due vial di calibratore liofilizzato (contiene proteine di origine umana).XG-EA: soluzione dell’anticorpo secondario coniugato con l’enzima. Tappo verde. XG-CH3: soluzione cromogena pronta all’uso, contiene TMB (3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina) 10 mL.XG-ST3: soluzione di arresto pronta all’uso, contiene HCl 1N, 10 mL.XG-DB5: tampone di diluizione concentrato 5X, 10 mL, contiene Proclin come conservante. Dopo diluizione la soluzione di lavoro contiene 1% BSA e 0.05% Tween 20.XG-WB2: tampone di lavaggio da ricostituire in acqua di grado reagente, due tavolette. Dopo ricostituzione il tampone contiene lo 0.05% di Tween 20 in PBS .

STRUMENTAZIONE RICHIESTA MA NON FORNITAPipette di precisione con puntali monousoWasher per micropiastreLettore per micropiastre con filtri per letture a 450 ± 20 o 650 ± 20 nmAcqua di grado reagente

ISTRUZIONI PER L’USOCurva di calibrazione e campioni: Ricostituire il calibratore XG007-Calibratore liofilizzato con 440 μL di acqua di grado reagente. Dispensare 100 μL/well di calibratore standard (in duplicato) partendo dalla soluzione ricostituita ed eseguire una diluizione seriale di ragione 2 ottenendo una curva di calibrazione a sette punti. Usare il buffer di diluizione XG-DB5 come diluente. Per l’esatta concentrazione del calibratore fare riferimento al valore riportato in etichetta.

code XG007 PROSTATE-IC

125,0,0