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Classificazione

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Malattie Genetiche

• GCGGCGGCGGGCGGGTACTGGCTTCTGGGGCCAGGGGCCAGGGGCGGTGGGCGCCGGGACCGCGGAGCTGAGGAGCGGGGCCCGGCCAGGGCTGGAGACTTTGCGCCCGGGGGCACCGGGGCTGCGCGCGGTCGCACACATCCACCGGCGCGGCTTCCCTCGGCGGCCCGGGCTCCGCTCATCCTGCGGCGGGCGGCGCCGCTCAGGGGCGGGAAGAGGAGGCGGTAGACGCGACCACAGAAGATGATGATGATGTCGGGCCAAACGCTCACGGATCGGATCGCCGCCGCTCAGTACAGCGTTACAGGCTCTGCTGTAGCAAGAGCGGTCTGCAAAGCCACTACTCATGAAGTAATGGGCCCCAAGAAAAAGCACCTGGACTATTTGATCCAGGCTACCAACGAGACCAATGTTAATATTCCTCAGATGGCCGACACTCTCTTTGAGCGGGCAACAAACAGTAGCTGGGTGGTTGTGTTTAAGGCTTTAGTGACAACACATCATCTCATGGTGCATGGAAATGAGAGATTTATTCAATATTTGGCTTCTAGAAATACACTATTCAATCTCAGCAATTTTTTGGACAAAAGTGGATCCCATGGTTATGATATGTCTACCTTCATAAGGCGCTATAGTAGATATTTGAATGAAAAGGCTTTTTCTTACAGACAGATGGCCTTTGATTTTGCCAGGGTGAAGAAAGGGGCCGATGGTGTAATGAGGACAATGGCTCCCGAAAAGCTGCTAAAGAGTATGCCAATACTACAGGGACAAATTGATGCACTGCTTGAATTTGATGTGCATCCAAATGAACTAACAAATGGTGTCATAAATGCAGCATTTATGCTTCTTTTCAAAGATCTTATCAAACTTTTTGCTTGCTACAATGATGGTGTTATTAACTTACTCGAAAAGTTTTTTGAAATGAAGAAAGGACAATGTAAAGATGCTCTAGAAATTTACAAACGATTTCTAACTAGAATGACACGAGTGTCTGAATTTCTCAAGGTTGCAGAGCAAGTTGGTATTGATAAAGGTGACATTCCTGACCTCACACAGGCTCCCAGCAGTCTTATGGAGACGCTTGAACAGCATCTAAATACATTAGAAGGAAAGAAACCTGGAAACAATGAAGGATCTGGTGCTCCCTCTCCATTAAGTAAGTCTTCTCCAGCCACAACTGTTACGTCTCCTAATTCTACACCAGCTAAAACTATTGACACATCCCCACCGGTTGATTTATTTGCAACTGCATCTGCGGCTGTCCCAGTCAGCACTTCTAAACCATCTAGTGATCTCCTGGACCTCCAGCCAGACTTTTCCTCTGGAGGGGCAGCAGCAGCCGCAGCACCAGCACCACCACCACCTGCTGGAGGAGCCACTGCATGGGGAGACCTTTTGGGAGAGGATTCTTTGGCTGCACTTTCCTCTGTTCCCTCTGAAGCACAGATTTCAGATCCATTTGCACCAGAACCTACCCCTCCTACTACAACTGCTGAAATTGCAACCACTACTGCTGCCACCGCCGCTGCCACCACCACTACCATTCATCTCTTGCCAGCTTAGTAGGCAATCTTGGAATTTCTGGTACCACAACAAAAAAGGGAGATCTTCAGTGGAATGCTGGAGAGAAAAAGTTGACTGGTGGAGCCAACTGGCAGCCTAAAGTAGCTCCAGCAACCTGGTCAGCAGGCGTTCCACCAAGTGCACCTTTGCAAGGAGCTGTACCTCCAACCAGTTCAGTTCCTCCTGTTGCCGGGGCCCCATCGGTTGGACAACCTGGAGCAGGATTTGGAATGCCTCCTGCTGGGACAGGCATGCCCATGATGCCTCAGCAGCCGGTCATGTTTGCACAGCCCATGATGAGGCCCCCCTTTGGAGCTGCCGCTGTACCTGGCACGCAGCTTTCTCCAAGCCCTACACCTGCCAGTCAGAGTCCCAAGAAACCTCCAGCAAAGGACCCATTAGCGGATCTTAACATCAAGGATTTCTTGTAAACAATTTAAGCTGCAATATTTGTGACTGAATAGGAAAATAAATGAGTTTGGAGACTTCAAATAATAATAATAAGATTGATGCTGAGTTTCAAAGGGAGCCACCAGTACCAAACCCAATACTTACTCATAACTTCTCTTCCAAAATGTGTAACACAGCCGTGAAAGTGAACATTAGGAATATGTACTACCTTAGCTGTTATCCCTACTCTTGAAATTGTAGTGTATTTGGATTATTTGTGTATTGTACGATGTAAACAATGAATGGATGTTACTGATGCCGTTAGTGCTTTTTTGGACTTCACCTGAGGACAGATGATGCAGCTGTTGTGTGGCGAGCTATTTGGAAAGACGTCTGTGTTTTTGAAGGTTTCAATGTACATATAACTTTTGAACAAACCCCAAACTCTTCCCATAAATTATCTTTTCTTCTGTATCTCTGTTACAAGCGTAGTGTGATAATACCAGATAATAAGGAAAACACTCATAAATATACAAAACTTTTTCAGTGTGGAGTACATTTTTCCAATCACAGGAACTTCAACTGTTGTGAGAAATGTTTATTTTTGTGGCACTGTATATGTTAAGAAATTTTATTTTAAAAAATATAAAGGTTAACGTCCATAATAAATACTTCTCTTTGAAGCTACCTTATCAAGAACGAAAAATCGTATGGGAAGAATCCCCTATTTATCACTGCTATATTAAAATATATATATTTTAATTATATTTGACAGGTTTTGCATCTAAATTGACCTATTTATTCATTCTTGATTAAATGCACTGAAAAGTAAAATTTAAAAGTGGTTGTATCTGAATTTACTGTGGGGATAACATACACTGTAATGGGGAAAAATTACCTAAAACCAATTTCAAAATGGCTTTCTTTGTATTTCAGTTTAAAAACCCAGTGCATGTACGCCCTCTGAGATGCAATAAACACCTTGAACAAAG

3*109 bp

150*106 bp 1-5*106 bp

• Tipo cellulare

• Numero di geni

• Funzione del gene interessato

Mutazioni somatiche e germinali

Mutazioni germinali

•Mutazioni geniche

•Alterazioni complesse del genoma(mutazioni cromosomiche)

Fenotipi Complessi

•Cancro

•Malattie degenerative

Mutazioni somatiche – mutazioni germinali – molti geni coinvolti

Presenti nello zigoteAlterazioni di un singolo gene

Malattie ad eredità Mendeliana

This database is a catalog of human genes and genetic disorders authored and

edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins and

elsewhere,

and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for

Biotechnology Information.

The database contains textual information and references.

It also contains copious links to MEDLINE and sequence records in the Entrez

system, and links to additional related resources at NCBI and elsewhere.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

11

Il cancro è una malattia genetica.

Differentemente da altre malattie genetiche, a trasmissione

mendeliana oppure ad eziologia multifattoriale,

esso è principalmente causato da mutazioni de novoche avvengono

nel genoma di cellule somatiche.

13

Figure 20-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

15

Figure 20-20b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

16


17

Quali sono i geni le cui mutazioni possono

contribuire all’insorgenza del

fenotipo neoplastico ?

19

Fattori di crescita

Recettori per i fattori di

crescita

Proteine coinvolte

trasduzione del segnale

Fattori di trascrizione

Proteine pro- apoptotiche

oppure anti-apoptotiche

20


21

Geni coinvolti nell’insorgenza e nella progressione della neoplasia

� Protooncogeni

� Oncosoppressori

� Geni codificanti proteine coinvolte nella riparazione del DNA

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What are the genes responsible for tumorigenic cell growth?

Normal

Cancer

Proto-oncogenesCell growth and proliferation

Tumor suppressor genes

+

-

Mutated or “activated”oncogenes

Malignant transformationLoss or mutation of

Tumor suppressor genes

++

24

Le mutazioni dei protooncogèni(che diventano oncogèni) alterano la

struttura e le funzioni del gene, e della proteina codificata,

in modo tale da determinare un cambiamento del fenotipo anche in

condizione di eterozigosi (gain of function mutations):

si comportano, quindi, in maniera dominante.

25

D’altra parte, le mutazioni dei geni oncosoppressori(cioè, geni che

modulano negativamente la proliferazione cellulare),

causano perdita della funzione del gene e della proteina codificata,

si comportano in modo recessivo (loss of function mutations).

26

In alcuni tipi di tumori, gli individui affetti ere ditano dai genitori

alcune delle mutazioni,

che possono contribuire all’insorgenza di un determinato fenotipo

neoplastico.

La Predisposizione familiare

27

Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancerKnudson’s two-hit hypothesis

SporadicNormal tumorsuppressorgene

Single tumors,unilateral,later-onset

Somaticmutationin one allele

Somaticmutationin other allele

• two mutations (two hits) are required for loss of t umor suppressor function

28

Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancerKnudson’s two-hit hypothesis

FamilialTumor suppressor genecontaining a germlinemutation in one allele -heterozygous for themutation

Multiple tumors,bilateral,early-onset

Somaticmutationin other allele

• two mutations (two hits) are required for loss of t umor suppressor function• the first “hit” is inherited and the second “hit” is somatic

32

Oncogenes in human tumors

Mechanisms of activation of proto-oncogenes

• point mutations

• chromosomal rearrangements or translocations

• gene amplifications

33

1. Point mutationsin a proto-oncogene that result in a constitutively acting protein product

2. Localized reduplication (gene amplification) of a DNA segment that includes a proto-oncogene, leading to overexpression of the encoded protein

3. Chromosomal translocation that brings a growth-regulatory gene under the control of a different promoter and that causes inappropriate expression of the gene

34

An oncogene formed by the first mechanism encodes an oncoprotein

that differs slightly from the normal protein encoded by the

corresponding proto-oncogene.

In contrast, the latter two mechanisms, usually, generate oncogenes

whose protein products are identical with the normal proteins;

their oncogenic effect is due to their being expressed at higher-than-

normal levels or in cells where they normally are not expressed.

37

Cell-cycle dependent phosphorylation of Rb

G1

S

G2M

G0Quiescent cells

phase

phase

phase

phase

Rbp

p

p

pRb

p

p

p

p

Rbp

p

p

p

Rbp

p

p

p

Rbp

p

Restriction point

Rbp

p

Phosphorylation of Rballows cells to transitthe restriction pointand enter S phase

Hyper phosphorylated Rb

Hypo phosphorylated Rb

38

Il passaggio attraverso il punto di restrizione G0 richiede l’attività

del fattore E2F, il quale promuove la trascrizione di geni codificanti

le proteine necessarie per la duplicazione del DNA cellulare.

Questo fattore è attivato da Cdk2, Ciclina E e Ciclina A.

L’attività di E2F è inibita dal legame con la proteina Rb

ipofosforilata, presente durante la fase M. Le Cdk 4/6, la Ciclina D, e

successivamente la Cdk2 e la ciclina E, fosforilano Rb provocando

il rilascio e la conseguente attivazione di E2F

41


43

I danni subiti dal DNA nucleare sono identificati da un sistema di controllo, attivo durante G1 e G2, che si basa sulla attivazione dip53, un fattore di trascrizione che stimola l’espressione di p21CIP.

Questo cyclin-kinase inhibitor(CKI) si lega ai complessi Cdk-Ciclinae li inibisce, causando l’arresto del ciclo in G1 oppure in G2 finchè

il danno non sia stato riparato

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p53 is the “guardian of the genome”

• germline p53 mutations are found in Li-Fraumeni syndr ome

• p53 is frequently found mutated in human tumors

• the p53 protein functions as a transcription factor that

regulates cell-cycle and DNA repair genes

• UV irradiation causes cell-cycle arrest in G1 that is dependent

on p53; cells that contain a mutated p53 cannot arr est

and go into S phase and replicate damaged DNA

• p53 loss-of-function mutations result in the replic ation of

cells with damaged DNA and to the further accumulat ion

of other mutations affecting oncogenes and tumor

suppressor genes, and to an increased

likelihood of cancer

45

Functions of selected proto-oncogenes

Proto-oncogene Biochemical property

1. Secreted growth factorsc-sis Platelet derived growth factor

2. Growth factor receptorsc-erbB Epidermal growth factor receptor

3. Signal transduction proteinsc-abl Protein kinasec-src Protein kinaseH-ras Small G-proteinK-ras Small G-protein

4. Nuclear proteinsc-myc Transcription factorc-fos Transcription factor

46

Le mutazioni a carico delle proteine Ras costituiscono un tipico

esempio: infatti, una mutazione puntiforme nel gene, che codifica

per questa proteina, riduce la sua attività GTPasicarendendola

costitutivamente attiva.

Guadagno di funzione

47

Ras family proteins

• the c-ras family contains three genes: H-ras, K-ras, and N-ra s

• the Ras proteins encoded by these genes are small G- proteins

• the proteins transmit growth signals from cell surf ace receptors

• the Ras proteins are activated by binding GTP

• the proteins are inactivated by GTP to GDP hydrolys is

• mutations in the c-ras genes inactivate the Ras GTPase

• mutated Ras proteins are constitutively active

• constitutively active Ras proteins result in uncontr olled cell growth

48

amino acid positionRas gene 12 59 61 Tumor

c-ras (H, K, N) Gly Ala Gln normal cells

H-ras Gly Ala Leu lung carcinomaVal Ala Gln bladder carcinoma

K-ras Cys Ala Gln lung carcinomaArg Ala Gln lung carcinomaVal Ala Gln colon carcinoma

N-ras Gly Ala Lys neuroblastomaGly Ala Arg lung carcinoma

Murine sarcoma virus

H-ras Arg Thr Gln Harvey strainK-ras Ser Thr Gln Kirsten strain

Amino acid substitutions in Ras family proteins

49

Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato

per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un

gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente.

I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non

presentano mutazioni in questo marcatore.

Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie

sempre più mirate e su misura per il paziente.

51

Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la

proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola

costitutivamente attiva.

52

Cetuximab è un anticorpo

monoclonale che blocca il

recettore dell’EGF.

La proteina Ras si trova a valle

di EGFR, quindi anche bloccando

il recettore non si ottiene la

risposta desiderata (blocco della

proliferazione cellulare)

53

Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras

nella biopsia del paziente

Codon Mutation; Aminoacid

change Nucleotide substitution

12 GGT TGT; G12C G T

GGT GTT; G12V G T

GGT GAT; G12D G A

GGT GCT; G12A G C

GGT AGT; G12S G A

GGT CGT; G12R G C

13 GGC GAC; G13D G A

54

Metodologia

Preparazione del DNA dalla biopsia

Amplificazione (PCR) della regione genomicadi interesse

Sequenziamento dei frammenti ottenuti

Saggi di discriminazione allelica mediante Real-Time PCR

56

Chromosomal rearrangements or translocations

Neoplasm Translocation Proto-oncogene

Burkitt lymphoma t(8;14) 80% of cases c-myc 1

t(8;22) 15% of casest(2;8) 5% of cases

Chronic myelogenous t(9;22) 90-95% of cases bcr-abl 2

leukemia

Acute lymphocytic t(9;22) 10-15% of cases bcr-abl 2

leukemia

1c-myc is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression2bcr-abl fusion protein is produced, which results i n a constitutively active abl kinase

57

La proteina, codificata da c-myc attiva la trascrizione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare

dalla fase G1 alla fase S.

Normalmente, sia l’ mRNA trascritto dal protooncogene, che la proteina sono molto instabili.

Le cellule il cui genoma contiene le mutazioni sono costitutivamenteindotte a proliferare.

58

sono tipiche le traslocazioni che interessano il cromosoma 8, dove è

localizzato il gene c-myc, ed uno dei tre cromosomi in cui sono

localizzati i geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle

immunoglobuline.

La traslocazione più frequente è la [t (8:14)], che si riscontra nel

90% dei BL:

la traslocazione, spostando cMyc in prossimità dell’enhancer del

gene che codifica per una delle catene delle immunoglobuline, causa

la sua continua espressione e di conseguenza le cellule sono

costitutivamente stimolate a proliferare.

59

c-myc is translocated to the IgG locus,which results in its activated expression

bcr-abl fusion protein is produced,which results in a constitutively active abl kinase

bcr-abl

bcr

abl

c-myc IgGIgG enhancerc-myc is activated bythe IgG enhancer in

lymphocytes

60

A chromosome translocation that forms

Bcr-Abl in a hematopoietic stem cell

forms the diagnostic “Philadelphia”

chromosome and results in the initial

chronic phase of human chronic

myelogenous leukemia (CML),

characterized by an expansion in the

number of well-differentiated

granulocytes, a type of white blood cell.

A second mutation in one such cell (e.g.,

in p53) leads to acute leukemia.

62

The chromosomal translocation results in fusion of a portion of the bcr gene (whose function is unknown but whose N-terminal segment

forms a coiled-coil domain that links several bcr polypeptides together) with part of the c-abl gene, which encodes a protein-

tyrosine kinase whose normal substrates are not known.

The chimeric polypeptides expressed from the resulting Bcr-Abloncogene form a tetramer that exhibits constitutive Abl kinase

activity. Although Abl is normally localized to the nucleus, addition of the Bcr segment causes the Bcr-Abl oncoprotein to be localized to the

cytosol.

Bcr-Abl binds to many intracellular signal-transduction proteins and then phosporylates them, proteins that Abl would not normally

activate.As a consequence, these signaling proteins become activated in the

absence of growth factors.

64

microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG

82

Affinché si sviluppi un tumore non è sufficiente la mutazione di un

singolo gene, bensì è necessario che si accumulino all’interno della

stesso genoma differenti mutazioni (il cui numero esatto varia in

dipendenza dello specifico tipo di neoplasia):

infatti, il controllo della proliferazione e del differenziamento

cellulare sono caratteristiche fenotipiche estremamente complesse e

multigeniche.

87

Tumor cells differ from their normal counterparts in many respects:

growth control, morphology, cell-to-cell interactions, membrane properties, cytoskeletal structure,

protein secretion, and gene expression.

88

How can researchers hope to identify and study all the changes that occur in so many different

cancers?

How can they explain why some people respond to treatment and not others?

How can they explain why some smokers get lung cancer, and others do not?

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