Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
-
Upload
mazinges-ajesa -
Category
Documents
-
view
227 -
download
0
Transcript of Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
1/47
CINÉTICA
ENZIMÁTICA
Dra. Maria Mercedes Soberón Lozano
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
2/47
Concepto - Cinética
Estudia:
• Las velocidades dereacciónenzimática.
• Mecanismos de
reacción deenzimas.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
3/47
Concentración de sustrato quedesaparece por unidad de tiempo.
¿Cómo se “ visualiza” la acción
catalítica de una enzima ?
Concentración de producto que se formapor unidad de tiempo.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
4/47
Unidad de actividad enzimática (U)
Cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato en un
minuto.
¿Cómo se expresa la veloc idadenzimática?
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
5/47
katal (kat): Cantidad de enzima quetransforma 1 mol de sustrato por segundo.
1 katal = 60 x 106 U.Esta unidad es muy grande, por lo que seutilizan submúltiplos como
el microkatal (µkat, 10-6 kat), o
el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Sistema Internacional de Unidades (SI)
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
6/47
Hipótesis que intentaron explicar elmecanismo de acción de las enzimas
Leonor Michaelis y Maud Menten (1913)
(1) Condición equilibrio rápido
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
7/47
George E. Briggs y
John B. S Haldane(1925)
Hipótesis que intentaron explicar elmecanismo de acción de las enzimas
John B. S Haldane
(2) Condición estado estacionario
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
8/47
k 1 , k -1 y k cat constantes cinéticasindividuales de cada proceso.
También denominadas constantesmicroscópicas de velocidad.
E + S E-S E + P k 1
k -1
k cat
Mecanismo cinético
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
9/47
Hipótesis Michaelis-Menten(Condición equilibrio rápido)
E + S E-S P + Ek1
k-1
kcat (1)
Deducción Ec. (1):
- Complejo E-S piedra angular de la cinéticaenzimática.- Complejo E-S en equilibrio rápido conrespecto a E y S (kcat < k -1)
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
10/47
Hipótesis Michaelis-Menten(Condición equilibrio rápido)
E + S E-S P + Ek1
k-1
kcat
Velocidad de reacción (v)
v = k cat E-S
k cat = constante catalítica de velocidad
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
11/47
E + S E-S P + E
k1
k-1
kcat
Pasos para resolver esquema (1):
(1)
[E][S] k-1Ks = ---------- = -------
[ES] k1
- Constante de disociación aparente (Ks):
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
12/47
Dividiendo ec (2) entre ec (3) (Et) : v kcat [E-S]
---- = -------------- (4)
Et [E] + [E-S]
Et = E + [E-S], Conc. de S >> Et (3)
Velocidad de reacción (2)v = kcat [E-S]
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
13/47
Hipótesis Michaelis-Menten
Pero, k cat [Et] = V max
Reordenando la ec. 4, se llega a la ec.Michaelis- Menten:
K s = K m
v
V max
S
K s + S ----------- = ----------- v
V maxS
K s + S = --------------ó
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
14/47
L im itac iones de la Ec.Michael is-Menten
Válida mayormente para sistemas
enzimáticos uni-reactivos sencillos.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
15/47
Para reacciones enzimáticas con más de un
complejo E-S, el significado REAL y EXACTO
de Km y Vmax cambia.
E + S (E-S E-S1 E-P) P + E
k2
k-1
kcatk1
k-2
k3
k-3
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
16/47
Hipótesis de Briggs-Haldane(Condición estado estacionario)
Como siempre,
v = kcat [E-S]
E + S (E-S1 E-S
2 E-P) P + E
k1
k-1
kcat
E-S
k2
k-2
k3
k-3
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
17/47
E + S E-S P + E
k1
k-1
kcat
E-S permanece constante:
Vel. de formación E-S = Vel. de desaparición E-S
k1[E][S] = k-1[E-S] + kcat[E-S]
k1[E][S] = (k-1 + kcat) [E-S] Reordenando:
(5)
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
18/47
Despejando E-S de ec (5):
E-S = ------------------E S
k-1 + k cat /k1
------------
k-1
k1
+ ------------kcat
k1
------------
kcat
k1
Ks +
Km = Ks + kcat /k1 Km > Ks
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
19/47
Hipótesis de Briggs-Haldane(Condición estado estacionario)
v
V max
S
K m + S
-----------
=----------- v
V maxS
K m + S
=--------------
ó
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
20/47
Cuando k cat K m v = k cat Et
k 1 k catE + S E-S P + E
k -1
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
21/47
En la práctica...... Gráfica
Michaelis-Menten
v
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
22/47
Gráfica de Lineweaver-Burk 1/v = Km/Vm x 1/[S] + 1/Vm
Pendiente de línea
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
23/47
¿Por qué determinar Km?
Establece el valor aprox. deconcentración de sustrato en la célula.
Identificación de isoenzimas
Regulación a nivel de enzimas porcambios en Km, inducidos por ligandos.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
24/47
Conociendo Km podemos “in vitro”trabajar la enzima en condiciones de
[S] > Km
Cuando [S] >100 Km Vmax, valor
que permite conocer la [E]total presenteen el sistema de reacción.
¿Por qué determinar Km?
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
25/47
¿Por qué determinar Km?
Si kcat
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
26/47
Glucosa
Glucosa-6-P
ATP
ADP
Hexoquinasa
Glucoquinasa
Km hexoquinasa = 0.2 mM
Km glucoquinasa = 10 mM
[glucosa] sangre = 4 - 5 mM
[glucosa]intracelular = 0.2 – 2 mM
Después de ingerir dieta rica en carbohidrato, [glucosa]sangre, es alta.
Glucosa es transportada al hígado para ser convertida en
Glu-6-P.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
27/47
Etanol y metanol compiten por la
enzima alcohol deshidrogenasa.
Km Et < Km Met
Esta enzima prefiere metabolizar el
etanol (afinidad 20 veces mayor que
metanol)
¿Puede el s ign if icado de Km exp licar el
t ratam iento con etano l para casos de
intox icación con metano l?
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
28/47
Administrar etanol para saturar la alcohol
deshidrogenasa y evitar que ésta degrade al
metanol
¿Puede el s ign if icado de Km exp licar el
t ratam iento con etano l para casos deintox icación con metano l?
Tratamiento:
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
29/47
¿Por qué determinar Vm?
Centros activos de enzima, saturados consustrato ( [S]>>Km).
Varía de una enzima a otra.
Si mecanismo de reacción es de dos omás pasos, Vm será SIEMPRE equivalente a
kcat[Et].
Permite calcular la [E]total presente en lareacción.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
30/47
Significado de kcat
Constante de velocidad de primerorden.
Denominada también “número derecambios” (turnover number) ,cantidad máxima de moléculas (S, P)transformadas / tiempo, por moléculade enzima o por número de sitiosactivos.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
31/47
Enzima Sustrato Kcat (s-1)
Catalasa H2O2 40 000 000
Anhidrasa carbónica HCO3 - 400 000
Acetilcolinoesterasa Acetilcolina 14 000
Β-Lactamasa Benzilpenicilina 2 000
Fumarasa Fumarato 800
Valor kcat de Algunas Enzimas
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
32/47
Enzima Sustrato Kcat/Km
(M-1 S-1)
Acetilcolinoesterasa Acetilcolina 1.6 x 108
Anhidrasa carbónica
CO2 8.3 x 107
HCO3- 1.5 x 107
Catalasa H2O2 4 x 107
Crotonasa Crotonil-CoA 2.8 x 108
Fumarasa
Fumarato 1.6 x 108
Malato 3.6 x 107
Eficiencia catalítica de algunas enzimas
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
33/47
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
34/47
Características
Disminuir o bloquear la velocidad de
reacción, uniéndose a la enzima.
Son específicos.
Alteran grupos importantes para lafunción catalítica, o
Alteran ligeramente conformación dela enzima sin llegar a desnaturalizarla.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
35/47
Aplicaciones
Identifica aminoácidos presentes en elsitio catalítico de la enzima y su
probable rol en catálisis.
Fundamento de fármacos antivíricos,antibacterianos y antitumorales
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
36/47
Tipos Inhibición
Unión irreversible por enlaces covalentes,
provocando modificación química de
grupos en centros de fijación y sitio
activo de la enzima.
1. Inhibición Permanente
I hibi ió t d l í
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
37/47
Compuesto organofosforadoque inhibe la actividad de
ACETILCOLINESTERASA
Gas sarín
Inhibición permanente del gas sarín
Los organofosforados forman un éster estable con el OH
de la SER del centro activo de la enzima y la reacción no
prospera; la enzima queda bloqueada e inactiva.
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
38/47
2. Inhibición reversible
Competitiva
Acompetitiva
No competitiva
Tipos:
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
39/47
Inhibición Competitiva
I y S compiten por sitiocatalítico.
Análogo o derivadono metabolizable del
verdadero sustrato.Actúa sólo
aumentando
el Km
(Km app
) para S.
Vm permaneceinalterable
Ks k3
E + S E-S E + P
+
I
kI
EI
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
40/47
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
41/47
Acción Bioquímica de Agentes Quimioterapéuticos
Tetrahidrofolato
5, 10-metilentetrahidrofolato
UMP dTMP
7, 8dihidrofolato
NADPH + H+
NADP+Serina
Glicina
Dihidrofolatoreductasa
Timidilatosintasa
Fluorouracil
Metotrexato
Inhibición
FdUMP
DNA
Serina hidroximetiltransferasa
Ácido fólico
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
42/47
Las posiciones 7 y 8 llevanhidrógeno formando el
DIHIDROFOLATO
8
7
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
43/47
Trimetoprim (TMP) y
sulfametoxazol (SMX) actúan de
forma sinérgica.
Trimetoprim inhibe de formacompetitiva la dihidrofolato
reductasa.
TMP-SMX inhibe 50,000 veces
más la dihidrofolato reductasa
bacteriana que la de los
mamíferos
1968 Introducción en mercado de BACTRIM (combinaciónde trimetoprim-sulfametoxasol).
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
44/47
Inhibición No Competitiva
I se une tanto a la enzimacomo al complejo E-S.
Km no se altera (KI = Km ).
Vm varía. Disminuye amedida que aumenta [I].
I, podría impedir la
conformación de centro
catalítico.
No puede ser superada
aumentando [S].
Ks k3
E + S E-S E + P
+ +I I
EI + S ESI
Ks
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
45/47
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
46/47
Inhibición Acompetitiva
I sólo se une alcomplejo E-S.
I no se une al centro
activo sino a cualquierotro sitio.
No se puede superarla inhibición
aumentando la [S].Km es más pequeño
(aparente afinidad)
Ks k3
E + S
E-S
E + P
+
I
kI
ESI
-
8/17/2019 Cinetica Enzimatica Para Los Alumnos
47/47
¿Entendieron
la cinética delas enzimas?