Caratterizzazione di composti bioattivi da canapa e lino

Monica Mattana

Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria CNR-IBBA

Regione Lombardia – Accordo Istituzionale n.14840/RCC 2011-2013

Milano, Palazzo Pirelli, 3 febbraio 2014

Metaboliti primari e secondari

METABOLITA PRIMARIO

composto sintetizzato da ogni cellula di un organismo vivente, è essenziale alla vita e alla sopravvivenza della cellula stessa:

PROTEINE, ZUCCHERI, LIPIDI, ACIDI NUCLEICI.

METABOLITA SECONDARIO composto sintetizzato principalmente da cellule vegetali a partire dalle vie del metabolismo primario, che non è fondamentale per la vita e la sopravvivenza della cellula ma che concorre alla sopravvivenza e all’adattamento dell’intero organismo nell’ambiente in cui lo stesso si trova. Spesso è specie-specifico.

DIFESA DA STRESS AMBIENTALI, PATOGENI, ERBIVORI RESPONSABILI DEL COLORE E PROFUMO

FENILPROPANOIDI, TERPENI, ALCALOIDI

Uso dei metaboliti secondari

STORIA: •Lascaux caves (Francia): Pitture rupestri di piante usate come rimedi terapeutici (25000 – 13000 a.C.) • Sumeri (5000 a.C.): Prima testimonianza scritta sull’uso di timo e alloro quali rimedi curativi • I popoli antichi usavano estratti di piante medicinali come antitosse, sedativi, veleni… •Socrate nel 399 a.C. bevve un estratto di cicuta contenente coniina •La regina Cleopatra usava estratti contenenti iosciamina per dilatare le pupille e apparire più attraente agli occhi dei suoi rivali

Conium maculatum

Atropa belladonna

Oggi circa il 75% dei medicinali e il 60% dei medicinali anticancro sono prodotti naturali o loro analoghi

CANAPA e LINO

Caratterizzare diverse cultivar di Canapa e Lino per la produzione di metaboliti secondari mediante: valutazione dell’espressione e dell’attività di geni ed enzimi della via biosintetica dei fenilpropanoidi analisi dei metaboliti prodotti

Obiettivi

Gene

Analisi di espressione genica mediante qPCR

Analisi delle attività enzimatiche

Proteina

Analisi dei metaboliti secondari

Metabolita

NH2

O

OH

L-Fenilalanina

PAL

Ac. trans cinnamico

O

OH

OH

C4H

O

OH

Ac. p- cumarico

O

OH

OHNH2

TAL

4CL

O

SCoA

OH

p- cumaroil CoA

CHS + CHR

OH OH

O

OH

Tri-idrossi-calcone

isoflavonoidi

OH OH

O

OH

OH

Tetra-idrossi-calcone

OH

OH

OH

resveratrolo

STS

flavoni

flavonoli antociani, tannini condensati

flobafeni

O

OH

OH

O

CH3

Ac. ferulico COMT

O

OH

OH

O

CH3

OCH3

Ac. sinapico F5H +COMT

4CL 4CL

O

SCoA

OH

O

CH3 O

SCoA

OH

O

CH3

OCH3

Feruloil-CoA Sinapoil-CoA

CCRD+ CAD+ …..

Guaiacil lignina

CCRD+ CAD+ …..

Siringil lignina

p-idrossi-fenil lignina CCRD+ CAD+ ?

HCT+C3H+ CCaOMT+ …..

F5H +COMT

3- malonil CoA + CHS

Via biosintetica fenilpropanoidi

Biosintesi lignine e lignani

Biosintesi flavonoidi

La via dei fenilpropanoidi

Set up sperimentale Lino : • Varietà: Linoal, Valoal, Natural, Festival, Merlin, Solal, Kaolin • Tessuti: Foglie da piante adulte e semi • Analisi di espressione dei geni: PAL e 4CL mediante qPCR • Analisi delle attività enzimatiche dei corrispondenti prodotti genici • Preparazione di estratti di foglie e semi per analisi NMR

Set up sperimentale Canapa: • Varietà: Fedora, Fibranova, Ferimon, Futura, Carmagnola, Felina e Cs • Tessuti: Foglie da piante adulte e semi • Analisi di espressione dei geni: PAL, 4CL e CHS mediante qPCR • Analisi delle attività enzimatiche dei corrispondenti prodotti genici • Preparazione di estratti di foglie e semi per analisi NMR

Studio della via dei fenilpropanoidi in canapa e lino

0

2

4

6

8

PAL

0

2

4

6

8 4CL

0

2

4

6

8 CHS

Rel

ativ

e ex

pre

ssio

n

PAL

C4H

4CL

CHS

Fenilalanina Acido cinnamico Acido p-cumarico 4 Cumaroil CoA+ Malonil CoA Naringenina calcone Flavonoidi

CANAPA – Foglie: espressione genica

• Futura: miglior genotipo per livello di espressione • Le attività enzimatiche presentano una minor variabilità tra le cultivar

Rel

ativ

e ex

pre

ssio

n

Rel

ativ

e ex

pre

ssio

n

CANAPA – Foglie: metaboliti identificati

A: apigenina-7-glucoside L: luteolina-7-glucoside

A

A A

A

L

A,L

L

L L

1: trigonellina, 2: formiato, 3: apigenina-7-O-glucoside, 4: citidina, 5: n.d., 6: luteolina-7-O-glucoside, 7: fumarato, 8: n.d., 9: n.d.

F.M.

F.G.

Fusto

Rad.

Docimo T., Consonni R, Coraggio I, Mattana M.,“Early Phenylpropanoid Biosynthetic Steps in Cannabis sativa: Link between Genes and Metabolites”. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 13626-13644

Canapa var. Futura: geni e metaboliti

0

5

10

15

20

25

30

35

40

mg

G-1

DM

Lignin content Fenilalanina Acido cinnamico Acido p-cumarico 4 Cumaroil CoA+ Malonil CoA Naringenina calcone

Flavonoidi

PAL

C4H

4CL

CHS

Lignine

0

1

2

3

4

5

6

4CL

Rel

ativ

e ex

pre

ssio

n

0

2

4

6

8

10

12

PAL

CANAPA – semi: espressione genica

Rel

ativ

e ex

pre

ssio

n

Rel

ativ

e ex

pre

ssio

n

0

2

4

6

8

CHS

• Carmagnola presenta il livello di espressione dei geni più alto rispetto alle altre varietà •Le attività di PAL e 4CL seguono lo stesso andamento dei geni

Contenuto Fenolico totale: Test di Folin-Ciocalteu

0

5

10

15

20

25

30

Semi Treviglio Semi Cavriana

Mg Ac.Gallico/kg estratto

0

20

40

60

80

100

120

Semi Treviglio Semi Cavriana

Contenuto in flavonoidi: Test con sodio nitrito

Mg Rutina/kg estratto

Carmagnola Ferimon Fibranova Fedora Felina

Carmagnola

Felina

Futura

Carmagnola

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

Semi Treviglio Semi Cavriana

Futura

Potere antiossidante: Test con DPPH

IC50

Proprietà Nutraceutiche dei Semi

Estrazione in MeOH/H2O (8:2) 80°C – 3 h x 3 volte

Semi macinati degrassati

Evaporazione del solvente Separazione in colonna (Sephadex LH-20)

Frazioni arricchite

Analisi HPLC-MS

Analisi 1H e 13C NMR Mono e bidimensionale (prodotti puri o in miscela)

PRODOTTI NOTI CARBOIDRATI

α-Glucosio β-Glucosio Saccarosio Xilosio Arabinosio Ribosio Mioinositolo Acido Galatturonico

ALCALOIDI Trigonellina

ACIDI GRASSI Acido Oleico Acido Linoleico Acido Linolenico

AMINOACIDI Valina Alanina Glutammato

LIGNANAMIDI Cannabisina A Cannabisina E Cannabisina F Cannabisina G

AMMIDI FENOLICHE N-trans-caffeoiltiramina N-trans-feruloiltiramina N-trans-coumaroiltiramina

Confronto HPLC con standard autentici

Metodica

CANNABISINA G-LIKE DEMETIL-CANNABISINA G

DEMETIL-CANNABISINA F CANNABISINA A RIBOSIDE

SINTESI TOTALE:

SINTESI IN CORSO:

Nuovi prodotti

Lino: espressione genica e attività enzimatica

• Valoal: livello di espressione di PAL più elevato rispetto alle altre varietà. •L’espressione di 4CL risulta simile nelle varietà analizzate. • Le attività enzimatiche rispecchiano l’andamento dei relativi messaggeri.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

PAL

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,24CL

Rel

ativ

e e

xpre

ssio

n

Rel

ativ

e e

xpre

ssio

n

FOGLIE

SEMI

•Il gene PAL risulta maggiormente espresso in Solal e Valoal. •Il trascritto per 4CL non è stato rilevato nella maggior parte delle varietà in esame.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Linoal Valoal NaturalFestival Merlin Solal Kaolin

PAL

4CLR

elat

ive

exp

ress

ion

-tocoferolo

esperidina

LINO – Foglie: metaboliti identificati

esperidina

-tocoferolo

LINO – Foglie: varietà analizzate

merlin

natural

valoal

festival

kaolin

solal

linoal

Flavonoide degli agrumi, proprietà antiossidanti e antiflogistiche

Esperidina:

Caratteristiche dei composti identificati

Apigenina: Flavonoide di sedano, prezzemolo, cipolla, camomilla, proprietà antiox, anticancro, antivirali, fitoestrogeniche

Caffeoiltiramina: Ammide fenolica, proprietà antiossidanti

Cannabisine: Lignano ammidi con potenziale attività citotossica

Luteolina:

Flavonoide di carote, sedano, peperone ed erbe aromatiche con proprietà antiox, antinfiammatorie e anticancro

Conclusioni e Prodotti della Ricerca

Canapa

Lino • Foglie: dai dati ottenuti la varietà Valoal risulta la migliore • Metaboliti identificati: Tocoferolo ed Esperidina

• Foglie: dai dati ottenuti la varietà Futura risulta la migliore • Metaboliti identificati: Apigenina e Luteolina • Semi: dai dati ottenuti la varietà Carmagnola risulta la migliore • Metaboliti identificati: Cannabisine, ammidi fenoliche

Prodotti • Registrazione sequenze PAL e 4CL da canapa in EMBL database • Pubblicazione peer-review: Docimo et al., Int. J. Mol. Sci., 2013. • Comunicazione al XIII Congresso della Società di fitochimica italiana

Lo studio effettuato sulla via biosintetica dei fenilpropanoidi in queste specie permette di selezionare varietà per un utilizzo biotecnologico

Oli essenziali

Carta Fibra tessile

Cibo

Farmaci

Nutraceutica/additivi alimentari

Edilizia

Prospettive e applicazioni

Progetto Filagro ottimizzare la produzione di composti bioattivi da colture cellulari di canapa e lino

CNR-IBBA Teresa Docimo (Assegnista) Immacolata Coraggio Franca Locatelli Annamaria Genga

NMR - Lab

Roberto Consonni Laura Ruth Cagliani

Giordano Lesma Claudia Remuzzi Vito Vece (Assegnista) Alessandra Silvani Gabriella Roda

Dipartimento di Chimica

Ringraziamenti

Grazie per l’attenzione