Caratteristiche microbiologiche, patogenetiche Caratteristiche microbiologiche, patogenetiche ed epidemiologiche di ed epidemiologiche di LegionellaLegionella spp. spp.

Paola Borella

Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica

Università degli Studi di Modena e Reggio E.

e-mail: borella.paola@unimore.it

Giornata di studio “LA LEGIONELLOSI NELLE STRUTTURE OSPEDALIERE E TURISTICO-ALBERGHIERE” Perugia, 29 ottobre 2005

Aula Magna della Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Perugia

Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica

Nell’estate del 1976 a Philadelphia si verificò un’epidemia di polmonite tra i partecipanti ad una riunione dell’American Legion: tra i 4.000 veterani

del Vietnam presenti ( “Legionnaires”), 221 si ammalarono e 34 morirono

scoperta di un “nuovo” batterio denominato Legionella

La storiaLa storia

Famiglia: Legionellaceae

Genere: Legionella

Specie: Legionella pneumophila e altre 47 specie

ClassificazioneClassificazione

Specie e sierogruppi di Specie e sierogruppi di LegionellaLegionella

1. L. pneumophila 152. L. bozemanii 23. L. dumoffii 14. L. micdadei 15. L. longbeachae 26. L. jordanis 17. L. wadsworthii 18. L. hackeliae 29. L. feeleii 210. L.maceachernii 111. L.birminghamensis 112. L.cincinnatiensis 113. L.gormanii 114. L.sainthelensi 215. L.tucsonensis 116. L. anisa 117. L. lansingensis 118. L. erythra 219. L. parisiensis 120. L. oakridgensis 121. L. spiritensis 222. L. jamestowniensis 123. L. santicrucis 124. L. cherrii 1

25. L. steigerwaltii 126. L. rubrilucens 127. L. israelensis 128. L. quinlivanii 229. L. brunensis 130. L. moravica 131. L. gratiana 132. L. adelaidensis 133. L. fairfieldensis 134. L. shakespearei 135. L. waltersii 136. L. genomospecies 137. L. quateirensis 138. L. worsleiensis 139. L. geestiana 140. L. natarum 141. L. londoniensis 142. L. taurinensis 143. L. lytica 144. L. drozanskii 145. L. rowbothamii 146. L. fallonii 147. L. gresilensis 148. L. beliardensis 1

Fields BS. Legionella and Legionnaires’ disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev 2002;15(3):506-26.

Victor L. Yu et al. Distribution of Legionella species and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an international collaborative survey. J Infect Dis. 2002 Jul 1;186(1):127-8.

This international collaborative survey identified culture-confirmed legionellosis in 508 patients with sporadic community-acquired legionellosis.

Legionella pneumophila constituted 91.5% of the isolates.Serogroup 1 was the predominant serogroup (84.2%), and serogroups 2–13 (7.4%) accounted for the remaining serogroups.

The Legionella species most commonlyisolated were L. longbeachae (3.9%) and L. bozemanii (2.4%), followed by L. micdadei, L.dumoffii, L. feeleii, L. wadsworthii, and L. anisa (2.2% combined). L. longbeachae constituted 30.4% of the community-acquired Legionella isolates in Australia and New Zealand.

Caratteristiche morfologiche e tintorialiCaratteristiche morfologiche e tintoriali

• Dimensioni di 0,3-0,9 m x 2-4 m (forme filamentose di 20 m e oltre in coltura)

• Non sporigeni, non capsulati

• Gram-negativi, si colorano debolmente in rosso con safranina

• Microrganismi di forma bastoncellare o coccobacillare (osservazione prelievi clinici)

• Immobili o mobili per mezzo di un flagello polare

• Possiedono fimbrie

Temperatura di crescitaTemperatura di crescita

RespirazioneRespirazione

Sono batteri aerobi, ma la loro crescita in terreni artificiali è favorita dalla microaerofilia ( presenza del 2,5% di CO2 ) soprattutto nel primo isolamento

PH di crescitaPH di crescita

Il pH ottimale di crescita è leggermente acido ( tra 6,85 e 6,95 ), ma è tollerato un pH sino a 5,5

Legionella si moltiplica tra 25°C e 42°C con temperatura ottimale di 35°C

Caratteristiche di crescitaCaratteristiche di crescita

Esigenze nutritiveEsigenze nutritive

• Le esigenze nutritive sono soddisfatte dal citoplasma dei protozoi all’interno dei quali si riproducono alle adatte temperature

• Per la loro moltiplicazione in terreni sintetici richiedono vari fattori di crescita: ferro organico, cisteina e fattori presenti nell’estratto di lievito

Tabella - Caratteristiche delle specie di Legionella________________________________________________________________________________________________

Crescita su Catalasi Ossidasi Riduzione Ureasi Acidificazione Gelatinasi -lattamasi BCYE Agar-sangue di NO3 del glucosio

________________________________________________________________________________________________L.pneumophila + - + + - - - + +L.micdadei + - + + - - - + +L.bozemanii + - + - - - - + +/-L.dumoffii + - + - - - - + +L.gormanii + - + + - - - + +L.longbeachae + - + + - - - + +L.wadsworthii + - + - - - - + +____________________________________________________________________________________________________________________

In terreni artificiali, le legionelle sono biochimicamente poco attive.

Terreni zuccherati: non acidificati

Urea: non idrolizzata

Nitrati: non ridotti

Gelatina: idrolizzata (tranne L. feeleii )

Caratteri biochimiciCaratteri biochimici

- Fiumi

- Laghi

- Stagni

- Raccolte d’acqua superficiali di qualsiasi entità

- Suolo umido

Ambiente naturaleAmbiente naturale

Le legionelle sono batteri dell’ambiente naturale acquatico. Sono presenti in:

La concentrazione delle legionelle nell’ambiente è usualmente bassa

La scoperta del ruolo dei protozoi (14 specie di amebe, tra cui Naegleria e Acanthamaebae, due specie di flagellati tra cui Tetrahymena ed una specie di muffa gelatinosa) come serbatoio per la moltiplicazione e la sopravvivenza delle legionelle ha permesso di comprendere l’epidemiologia e l’ecologia di questi batteri.A 20 °C, i protozoi fagocitano le legionelle e le digeriscono in gran numero.A 35°C, le legionelle fagocitate si moltiplicano all’interno dei protozoi.

Legionella sopravvive negli ambienti acquatici come parassita intracellulare di protozoi a vita libera

Ciclo vitale di Ciclo vitale di L. pneumophilaL. pneumophila

Vita libera: batteri flagellati e mobili Aderenza alle cellule ospiti: protozoi o macrofagi Ingestione da parte della cellula ospite Perdita del flagello nel citoplasma Occupazione di un vacuolo e formazione di un unico fagosoma

che non si fonde con il lisosoma Il fagosoma si trasforma in un comparto con reticolo simil-

endoplasmatico Fase replicativa: i batteri non ciliati si moltiplicano nel reticolo

simil-endoplasmatico del fagosoma Fase infettiva: il fagosoma si fonde con il lisosoma e libera batteri

ciliati ed attivamente mobili la cellula ospite muore ( i protozoi per necrosi, i macrofagi e le

cellule alveolari per apoptosi o per necrosi).

• Le legionelle, di per se stesse, sono poco resistenti agli agenti fisici e chimici

• All’interno dei protozoi, e soprattutto all’interno delle cisti, sono molto resistenti agli aumenti di temperatura e ai biocidi

• Nell’ambiente sopravvivono per molti mesi se sono all’interno dei protozoi

- Rete di distribuzione dell’acqua

-Sistemi di condizionamento e umidificatori (torri di raffreddamento/condensatori evaporativi)

- Fontane decorative, impianti termali, vasche per idromassaggi, bagni turchi e aree adibite a sauna, sistemi di irrigazione, acque di scarico di impianti igienici

- Piscine e cisterne con acqua stagnante

- Apparecchiature per inalazioni

Ambiente urbanoAmbiente urbano

Gli ambienti idrici artificiali agiscono da amplificatori e disseminatori

• Poche cellule microbiche entrano negli impianti e si riproducono (20-45°C)

RUOLO ESSENZIALE DELL’ACQUA

CALDA

Modalità di contaminazioneModalità di contaminazione

temperatura dell’acqua

fenomeni di ristagno/ostruzione

incrostazioni

torbidità, sostanze organiche, biofilm, Zn

materiali (guarnizioni di gomma)

presenza di alghe e amebe acquatiche

Altri fattori sospettiAltri fattori sospetti

durezza dell’acqua

altri germi e materiali biodegradabili

situazione climatica

vibrazioni/cambiamenti di pressione nel sistema idrico

Fattori favorenti la colonizzazione Fattori favorenti la colonizzazione di ambienti idrici artificialidi ambienti idrici artificiali

BiofilmBiofilm

Un biofilm è costituito da aggregati di batteri, protozoi e miceti che aderiscono a irregolarità delle pareti interne di condutture ed altre strutture a contatto con l’acqua, formando delle stratificazioni che hanno l’effetto di corrodere le pareti stesse, facilitando depositi ed incrostazioni che sporgono e tendono ad occludere le tubazioni

La presenza del biofilm è essenziale per la colonizzazione da parte delle legionelle, che trovano in esso i protozoi entro cui moltiplicarsi e svolgere il loro ciclo vitale

BiofilmBiofilm

Fattori di rischio aggiuntivi nelle strutture Fattori di rischio aggiuntivi nelle strutture turisticheturistiche

Particolarità delle strutture turistiche

- sistema di distribuzione dell’acqua molto complesso (ogni stanza ha il bagno) con percorsi lunghi dal sito di distribuzione ai rubinetti- soggiorni brevi, variabilità nell’uso in base alla stagione:- in alta stagione consumo di acqua concentrato in certe ore del giorno e notte (calo della T° dell’acqua)- in bassa stagione, scarso consumo o albergo chiuso con possibile ristagno che facilita la formazione di biofilm

la qualità dell’acqua erogata può variare e dovrebbe essere monitorata più frequentemente

-scarsa conoscenza del problema da parte del personale dei servizi tecnici dell’hotel

LetteraturaLetteratura

LetteraturaLetteratura

Ruolo della flora batterica acquatica Ruolo della flora batterica acquatica nell’ecologia microbica di nell’ecologia microbica di L. pneumophilaL. pneumophila

INDIRETTE interazioni con i

protozoi

DIRETTE competizione e produzione di batteriocine

INTERAZIONI

Nei confronti dei protozoi batteri possono:

Fungere da nutrimento favorire le legionelle

Parassitarli sfavorire le legionelle

Screening su 72 ceppi di Pseudomonadaceae:

64% PRODUTTORI DI BATTERIOCINE attive contro L. pneumophila

Messi P, Guerrieri E, Bondi M, Borella P. Interferenza microbica: quale ruolo nell’ecologia di Acanthamoeba polyphaga e Legionella pneumophila? Atti del 41° Congresso Nazionale SItI “Obiettivo salute: l’evoluzione cultuale in Europa” Genova, 20-23 ottobre 2004.

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Tempo (giorni)

ufc/

cm2

L.p.L.p. + Pseudomonas aeruginosa

L.p. + Pseudomonas fluorescens L.p. + Acinetobacter lwoffii

Interferenza microbica e sviluppo di Interferenza microbica e sviluppo di biofilm biofilm in vitroin vitro

P. aeruginosa produce PIOCINE ma non influisce su L.p.

P. fluorescens produce una BATTERIOCINA e inibisce L.p.

A. lwoffii non produce alcuna sostanza e promuove L.p.

Messi P, Bondi M, Marchesi I, Borella P, Guerrieri E. “Role of direct bacterial interference and biofilm in Legionella pneumophila water ecology” Atti del 20th Annual Meeting of EWGLI, 2005

Modalità di infezioneModalità di infezione

Per inalazione di aerosol contaminati

Per aspirazione di acqua contaminata

Per inalazione di particelle di polvere da essi derivate per essiccamento

Non si contrae bevendo acqua contaminata

La trasmissione interumana non è stata dimostrataLa trasmissione interumana non è stata dimostrata

La legionellosi si contrae generalmente via respiratoria mediante inalazione o

microaspirazione di aerosol contaminato

L’aerosol si forma attraverso le goccioline generate dagli spruzzi d’acqua o dall’impatto

dell’acqua sulle superfici

Più le goccioline sono piccole (< 5 micron) più facilmente raggiungono le basse vie respiratorie

Modalità di infezioneModalità di infezione

Fattori di rischio per l’infezioneFattori di rischio per l’infezione

•ESPOSIZIONE: tipo e intensità: carica batterica, grado di aerosolizzazione dell’acqua, vicinanza alla sorgente di aerosol

•VIRULENZA DEL CEPPO: diversa capacità di sopravvivere e moltiplicarsi nei serbatoi ambientali ed umani (macrofagi)

•SUSCETTIBILITA’ INDIVIDUALE: anziani, fumatori, soggetti con malattie croniche, immunocompromessi e con prolungata degenza ospedaliera

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classi di età

num

ero Femmine

Maschi

Sesso M:F = 2-3:1

Età media =55 aa, il 60% dei pazienti ha più di 50 aa

Rara nei bambini, poco frequente nei giovani adulti

Il 40% dei soggetti ha patologie croniche concomitanti

Fattori di rischio per infezioneFattori di rischio per infezione

Essendo un microrganismo opportunista, la

maggior parte degli individui sani supera

l’infezione senza manifestare sintomi di

malattia conclamata, ma i meccanismi di

protezione e/o suscettibilità non sono

conosciuti

Rapporto infetti/malatiRapporto infetti/malati

Origine dei casiOrigine dei casi

I primi casi di legionellosi sono stati ricondotti ad aerosol provenienti da impianti di climatizzazione

Le infezioni più recenti sono state causate da contaminazione di:

– impianti di distribuzione dell’acqua (docce, – rubinetti, fontane, impianti termali, idromassaggi)– apparecchi per aerosol, ossigenoterapia e per la

respirazione assistita

Numerosi clusters epidemici vengono segnalati per la diffusione di aerosol contaminati da torri di raffreddamento di grandi edifici

Segnalati casi acquisiti attraverso ferite

Segnalato un caso in un bambino a seguito del parto in acqua

La Malattia dei Legionari è la forma più severa dell’infezione

Si presenta come una polmonite acuta purulenta difficilmente distinguibile da altre forme di infezioni respiratorie acute delle basse vie aeree

La Malattia dei Legionari è la forma più severa dell’infezione

Si presenta come una polmonite acuta purulenta difficilmente distinguibile da altre forme di infezioni respiratorie acute delle basse vie aeree

I quadri cliniciI quadri clinici

La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta simil-influenzale che non interessa il polmone

La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta simil-influenzale che non interessa il polmone

•Incubazione da 2 a 10 giorni (forse fino a 15gg)

•Prodromi (malessere, mialgie e cefalea) cui segue febbre alta, tosse non produttiva, sintomi comuni ad altre forme di polmonite

•Possono essere presenti sintomi extrapolmonari utili ad indirizzare la diagnosi, quali manifestazioni neurologiche, renali e digestive

•Il reperto radiologico toracico non è patognomonico

•La diagnosi definitiva può essere raggiunta solo con indagini di laboratorio

Malattia dei LegionariMalattia dei Legionari

Isolamento colturaleIsolamento colturale (escreato, sangue, BAL, tessuti post-mortem) con terreni di coltura selettivi e tempi di crescita lunghi (4-10 giorni)Ricerca Ricerca dell’antigene solubile nelle urinedell’antigene solubile nelle urine di di L. L. pneumophilapneumophila sierogruppi 1-14 sierogruppi 1-14

SieroconversioneSieroconversione (almeno 10gg) (almeno 10gg)

Immunofluorescenza Immunofluorescenza direttadiretta PCR

DIAGNOSI

L’aumentata consapevolezza della malattia fra i medici e l’uso dei test per la ricerca dell’antigene urinario ha incrementato la individuazione dei casi sostenuti da L.pneumophila

Il gold standard resta tuttavia l’isolamento colturale che consente:

a) di riconoscere tutte le infezioni

b) di risalire alle fonti ambientali, attraverso l’analisi molecolare dei ceppi clinici ed ambientali isolati

Alcune osservazioniAlcune osservazioni

I macrolidi quali claritromicina e azitromicina o i

fluorchinolonici (levofloxacina) sono i farmaci più idonei per

la loro capacità di concentrarsi nei macrofagi e nei tessuti

polmonari

La loro associazione è particolarmente utile nei pazienti

fortemente immunocompromessi

La terapia deve essere prolungata per almeno 3 settimane

Terapia

Antibiotici quali la eritromicina, fluorchinolonici e rifampicina possono non risolvere la malattia, ma non sono segnalati fenomeni di resistenza negli isolati clinici di L. pneumophila.

Dalle indagini sperimentali tutti i ceppi saggiati (ambientali e clinici) sono risultati sensibili ai farmaci di elezione.

La mancanza della fase di colonizzazione prima dell’infezione (manca il portatore) minimizza il rischio di resistenza alle Legionellaceae in ambiente ospedaliero.

Manca la pressione selettiva nell’ambiente naturale del microrganismo che è rappresentato dall’acqua contaminata.

La possibilità di comparsa di resistenze suggerisce tuttavia di testare la sensibilità delle legionelle agli antibiotici che si

intendono utilizzare per la terapia.

Antibiotico resistenzaAntibiotico resistenza

• Febbre di Pontiac

La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta simil-influenzale che si risolve in 2-5 giorni, con tosse nel 30-60% dei casi e dolore toracico in assenza di interessamento polmonare. Si pensa sia dovuta ad una reazione ad antigeni batterici inalati, piuttosto che ad una vera e propria infezione.

Incubazione 24-48 ore

• Forme subcliniche

Il frequente riscontro di anticorpi anti-Legionella spp ( 15% nella popolazione generale, dati personali) in assenza di episodi di polmonite fa ritenere che la legionellosi si possa manifestare come forma subclinica

Altre forme di legionellosi Altre forme di legionellosi

Definizione di casoDefinizione di caso

Caso accertatoCaso accertato

infezione respiratoria con E.O. positivo per infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento suggestivo di interessamento polmonare,accompagnato da 1 o più dei polmonare,accompagnato da 1 o più dei seguenti criteriseguenti criteri:

• isolamento isolamento di Legionella da materiale organico (secrezioni, tessuto polmonare, liquido pleurico o sangue)

• aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpaletitolo anticorpale verso L. pneumophila sierogruppo 1 tra 2 sieri prelevati a distanza di almeno 10 giorni

• riconoscimento dell’antigeneantigene specifico solubile nelle urine

Caso presuntoCaso presunto

infezione respiratoria con E.O. positivo per infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento polmonare, suggestivo di interessamento polmonare, accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri:accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri:

• aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale relativo a sierogruppi o specie diverse da diverse da L. L. pneumophilapneumophila sierogruppo 1 sierogruppo 1

• positività all’immunofluorescenza diretta effettuata su materiale patologico

• singolo titolo anticorpalesingolo titolo anticorpale elevato (1:256) verso L. pneumophila sierogruppo 1

Definizione di casoDefinizione di caso

Linee Guida nazionali

Caso confermato da test di laboratorio, in cui il paziente è stato ricoverato continuativamente in ospedale per almeno 10 giorni prima dell’esordio della malattia

Se il periodo di ospedalizzazione è compreso fra 2 e 9 giorni, il caso è considerato di possibile eziologia nosocomiale

Se 2 o più casi si verificano nello stesso ospedale nell’arco di 6 mesi, vengono considerati una epidemia ospedaliera

Definizione di Caso nosocomialeDefinizione di Caso nosocomiale

1 - Casi nosocomialiCasi nosocomiali

• 1999 Europa 9%

• 2004 Italia 16,0%

Rappresentano una % limitata dei casi notificati, ma hanno letalità più elevata (circa 22-30% vs 10% nei casi comunitari)

Classificazione dei casiClassificazione dei casi

2 - Casi associati ai viaggiCasi associati ai viaggi

• 1999 Europa 21% (15% associati a viaggi all’estero)

• 2004 Italia 13,6%

3 - Altri Casi comunitariAltri Casi comunitari• 1999 Europa 70%

• 2004 Italia 70,4%

Per la maggior parte di questi non è possibile risalire alla sorgente di infezione

L’incidenza reale delle legionellosi nella popolazione è sconosciuta:

nonostante l’aumento delle segnalazioni, l’incidenza dei casi notificati resta bassa

Caratteristiche epidemiologiche delle Caratteristiche epidemiologiche delle legionellosilegionellosi

Casi attesi (stima): 1-5% di tutti i casi di polmoniti comunitarie

3-20% di tutte le polmoniti nosocomiali

Sulla base di queste indicazioni in Italia i casi incidenti potrebbero essere

1.000-10.000/anno

la diagnosi etiologica delle polmoniti non è generalmente richiesta la diagnosi di legionellosi richiede test specifici non effettuati di routine

i medici non sono sempre allertati

Motivi della sottostimaMotivi della sottostima

Aumento nella popolazione delle persone a rischio

Aumento negli ospedali di pazienti e procedure a rischio

Difficoltà ad eradicare Legionella dai serbatoi contaminati

Mancanza di metodi ottimali per prevenire la legionellosi

Aumento nella popolazione delle persone a rischio

Aumento negli ospedali di pazienti e procedure a rischio

Difficoltà ad eradicare Legionella dai serbatoi contaminati

Mancanza di metodi ottimali per prevenire la legionellosi

Motivi di preoccupazioneMotivi di preoccupazione

A) difficoltà nella identificazione dei casi e nella A) difficoltà nella identificazione dei casi e nella ricerca delle fonti ambientaliricerca delle fonti ambientali

B) insufficiente conoscenza sulla reale prevalenza B) insufficiente conoscenza sulla reale prevalenza della infezione/malattiadella infezione/malattia

C) poche informazioni sui fattori di rischio C) poche informazioni sui fattori di rischio coinvolti nella infezione/malattia e nessuna sulla coinvolti nella infezione/malattia e nessuna sulla predisposizione geneticapredisposizione genetica

D) limitate conoscenze sugli eventi molecolari e D) limitate conoscenze sugli eventi molecolari e biochimici che permettono la biochimici che permettono la sopravvivenza/moltiplicazione di sopravvivenza/moltiplicazione di LegionellaLegionella nelle nelle cellule umane e nei reservoirs ambientalicellule umane e nei reservoirs ambientali

E) difficoltà a controllare/eradicare E) difficoltà a controllare/eradicare LegionellaLegionella spp spp applicando metodi di disinfezione efficaciapplicando metodi di disinfezione efficaci

Aspetti critici della legionellosi