Breve manuale per l’utilizzo del gas-cromatografo …GC...La dinamica di risposta lineare di...

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Mauro Sabella ISIS Ponti Gallarate/ITIS Facchinetti www.smauro.it

Breve manuale per l’utilizzo del gas-cromatografo

HRGC 5300

Elementi principali del gas-cromatografo HRGC 5300

SISTEMA DI ALIMENTAZIONE GAS DI TRASPORTO: si tratta di bombole di gas inerte (azoto,

elio, argon), talvolta può essere utilizzato anche l’idrogeno. Lo scopo principale è quello di

trascinare i componenti della miscela in analisi lungo la colonna cromatografica

SISTEMA DI ALIMENTAZIONE DEI GAS PER IL RIVELATORE FID: utilizzando questo

rivelatore è necessario alimentare un combustibile ed un comburente (ad esempio idrogeno ed aria).

COLONNA CAPILLARE: Le colonne capillari sono sottilissimi tubi di silice di diametro

generalmente non superiore agli 0,53 millimetri e di lunghezza non inferiore ai 10 metri avvolte a

spirale su un supporto metallico. La fase stazionaria è spalmata in maniera uniforme sulla superficie

interna della colonna, dove forma un film di spessore costante che, a seconda del potere risolutore

della colonna, varia generalmente tra 0,5 e 2,5 µm. Il film è spesso costituito da metil-siliconi

modificati su cui sono inseriti vari gruppi funzionali, in funzione della classe di composti da

analizzare.

CAMERA TERMOSTATICA: camera nella quale è alloggiata la colonna. In genere queste camere

è a circolazione di aria calda per assicurare una buona stabilità di temperatura. Un dispositivo (in

questo caso il programmatore MFC 500) permette all’operatore di fissare la temperatura , la quale

può essere mantenuta costante per tutta la durata d’analisi (isoterma) oppure fatta variare

(programmata).

http://it.wikipedia.org/wiki/Silicone

http://it.wikipedia.org/wiki/Gruppo_funzionale

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CONTROLLO MULTI FUNZIONE MFC 500: questo strumento è la stazione di controllo del gas-

cromatografo HRGC 5300 MEGA SERIES con il quale vengono determinati tutti i parametri

cromatografici necessari ad una buona analisi.

RIVELATORE FID: un rivelatore a ionizzazione di fiamma si dice distruttivo in quanto i

componenti della miscela in analisi, separati dalla colonna cromatografica e trascinati dal gas di

trasporto, solitamente azoto, vengono miscelati ad una debole corrente di idrogeno e quindi avviati

al rivelatore dove vengono combusti all’uscita di un ugello ai cui lati sono disposti due elettrodi. Fra

i due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale di 150-300 V attraverso un’alta

impedenza connessa con un amplificatore elettrometrico. La microfiamma viene mantenuta dal

flusso di idrogeno che brucia in atmosfera d’aria. La debolissima corrente ionica che ne deriva

viene opportunamente elaborata da un amplificatore elettrometrico (E) che la preleva ai capi di una

resistenza ad altissimo valore R e quindi inviata sotto forma di tensione ad un registratore V che ne

traccia le variazioni. Quando nella fiamma oltre all’idrogeno e al gas di trasporto passa un

componente della miscela la ionizzazione aumenta notevolmente per cui si ottengono elevatissime

risposte con ottima stabilità della linea di base.

La sensibilità di questo rivelatore viene espressa in Coloumb/g ed è di circa mille volte superiore a

quella dei rivelatori a conducibilità termica. La dinamica di risposta lineare di questo rivelatore è la

più ampia di tutti i rivelatori fino ad ora conosciuti, infatti la fiamma produce ioni in proporzione

diretta fino a quantità di sostanza nell’ordine di 10-5

g/sec e, tenendo presente che possono essere

rivelate quantità dell’ordine di 10-13

, ne risulta una dinamica di 108.

INIETTORE: ha la funzione di assicurare l’istantanea vaporizzazione del campione, iniettato

attraverso una micro siringa. L’uso di colonne capillari, però, richiede che la quantità di campione

da iniettare è all’ordine dei nanolitri e misurare queste quantità con siringhe è praticamente

impossibile. Per questo motivo, spesso, si utilizza lo split, che consente di far entrare effettivamente

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in colonna solo una parte (ad esempio 1/100) del liquido iniettato. La camera di iniezione è

corredata da un sistema di resistenze variabili attraverso le quali è possibile fissare la temperatura

ritenuta più adatta per la vaporizzazione della miscela. L’introduzione del campione viene effettuata

con un’iniezione su un apposito disco di gomma al silicone, posto tra una ghiera metallica e il

dispositivo di attacco alla colonna.

CAMPIONATORE AUTOMATICO: ha la funzione di campionare automaticamente le miscele da

analizzare, velocizzando le analisi in serie e permettendo una notevole diminuzione dovuto

all’utilizzo della siringa manuale.

CONTROLLO CAMPIONATORE AUTOMATICO HS CONTROL Mod. 250: ha la funzione di

programmare tutti i parametri riguardanti il campionatore, come tempo di iniezione o temperatura

della siringa.

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ELETTROMETRO EL Mod. 580: questo strumento ha lo scopo di amplificare la debolissima

corrente ionica derivante dal FID, trasformarla in tensione elettrica e di inviarla ad un registratore.

INTEGRATORE: il segnale in uscita dal rivelatore passa ad un registratore che ha il compito di

realizzare il tracciato cromatografico. Lo strumento è corredato anche di un integratore che permette

il calcolo automatico delle aree dei picchi, operazione indispensabile per effettuare analisi di tipo

quantitativo.

Impostazione dei parametri per l’analisi

CONTROLLO MULTI FUNZIONE MFC 500

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Sullo strumenti sono presenti: tasti di funzione, tasti di controllo e tasti numerici.

I tasti di funzione sono i seguenti:

TIME SB : Tempo di standbay, cioè tempo di ottimizzazione dello strumento.

SB & TEMP 1: Tempo di ottimizzazione della temperatura

TEMP 1: Primo livello di temperatura programmabile

TIME 1: Tempo di utilizzo di TEMP 1

RATE 1: Prima programmazione di temperatura della prima rampa

TEMP 2: Secondo livello di temperatura programmabile


RATE 2: Seconda programmazione di temperatura della prima rampa

TEMP 3: Terzo livello di temperatura programmabile


RATE 3: Terza programmazione di temperatura della prima rampa

TEMP 4: Quarto livello di temperatura programmabile


RATE 4: Quarta programmazione di temperatura della prima rampa

TIME 5: Tempo utile per il condizionamento e per la preparazione del sistema per un nuovo ciclo

Queste funzioni vengono utilizzate per impostare la programmata, quindi le temperature del forno

nelle rampe e nelle isoterme. Per fare ciò, tenendo premuto il tasto del parametro da inserire,

digitare le nuove impostazioni e confermare con ENTER.

I tasti di controllo sono i seguenti:

START: consente di far partire l’analisi dal punto iniziale o, continuandolo a premere, da qualsiasi

altro punto della programmata.

RESET: premendolo contemporaneamente a ENTER, consente di fermare l’analisi senza alterare i

parametri immessi in precedenza e di tornare all’inizio della programmata. Per far ripartire l’analisi

nuovamente, premere START.

SB COOL: ad analisi terminata, premendolo contemporaneamente a ENTER, consente di

raffreddare in tempi brevi la camera termostatica. E’ possibile attivarlo anche durante un’analisi

resettando prima il programma in corso.

ZONE 1: consente di inserire la temperatura desiderata dell’iniettore di sinistra.

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ZONE 2: consente di inserire la temperatura desiderata dei 2 rivelatori FID.

ZONE 3: consente di inserire la temperatura desiderata dell’iniettore di destra.

ZONE POWER: consente di attivare il riscaldamento delle 3 zone, premendolo

contemporaneamente a ENTER. Conseguentemente si accende una luce rossa che indica che la

funzione si è attivata.

LIST: mostra le temperature e i tempi della programmata.

ACTUAL TEMP: mostra le temperature attuali del forno e delle 3 zone.

I tasti numerici sono i seguenti:

Da 0 a 9: consentono di inserire i parametri nelle varie funzioni.

CLEAR: permette di modificare i parametri inseriti scorrettamente.

K: consente di visualizzare le temperature in Kelvin.

CHRONO: permette di attivare e disattivare il cronometro in secondi. Per azzerarlo premere il

tasto CLEAR.

Ogni funzione ha il proprio display, che indicano i vari parametri attuali. In particolare è utile

descrivere il display della camera termostatica, formato da luci (LEDS) che indicano le sue

condizioni, tra cui:

READY LED informa che si trova alla temperatura impostata;

COND LED informa che sta raggiungendo la temperatura impostata;

COOL LED informa che si trova nella fase di raffreddamento.

Inoltre altri LED particolari sono i READY LEDS, che si accendono nel momento in cui anche le

tre zone hanno raggiunto i parametri impostati.

CONTROLLO ELETTROMETRO EL Mod. 580

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Il EL-580 comprende i seguenti controlli mostrati nella figura sovrastanti, essi sono:

- Il controllo d’ATTENUAZIONE viene effettuato attraverso le frecce (1); è possibile

impostare 11 diversi parametri (da 20 a 2

10), il valore impostato è visibile sul display (2).

- Il RANGE 10n (3) permette di cambiare l’input inviato all’integratore; è possibile impostare

quattro diversi parametri (3). Il valore impostato è visibile sul display (4).

- Il controllo del BACK-OFF READ (5) è attivabile per valutare e misurare il rumore di

fondo del sistema cromatografico.

- Il controllo ZERO OFFSET (6) è attivabile per spostare la linea di base in posizioni più

convenienti. Quando questa funzione è attiva il led corrispondente (10) è acceso.

- Il controllo AUTOZERO serve per eliminare il rumore di fondo tramite un potenziometro

automatico, ottenendo così un aggiustamento della linea di base. Quando il tasto di

AUTOZERO viene premuto il led (8) si accende e dopo il tempo necessario per la

correzione della linea di base (da 2 a 10 set) si spegne.

- Il tasto IGNITION (9) serve per accendere la fiamma nel FID. Il led corrispondente (11) si

accende quando il tasto è premuto.

CONTROLLO CAMPIONATORE AUTOMATICO HS CONTROL Mod. 250

Il campionatore automatico consente di effettuare analisi in modo ripetitivo e autonomo. E’

costituito dalle seguenti parti:

- Un piatto rotante portacampione termostatato, nel quale si possono inserire fino a 40 vials

(tipo di provetta).

- Un braccio pneumatico con siringa, anch’essa termostatata.

- Un controllo per la pressione dei pistoni (il campionatore automatico viene mosso con aria

compressa, il cui valore ottimale è di circa 3 atm.).

- Un modulo che consente di impostare tempi e temperature.

Il modulo è alloggiato sopra al controllo del forno e possiede i seguenti tasti di controllo:

- SYRINGE TEMP: imposta la temperatura della siringa, fino ad un massimo di 199°C

- BATH TEMP: imposta la temperatura del bagno, fino ad un massimo di 199°C (c’è anche la

possibilità di controllare il bagno tramite un sistema esterno). Questi due controlli, che

possono essere esclusi se non necessari, sono molto utili sia per l’analisi di miscele viscose

sia per la tecnica dello spazio di testa.

- TURNTABLE: ruota il piatto portacampioni di una posizione.

- CONDITIONING TIME: imposta il tempo di condizionamento, cioè il tempo d’attesa prima

dell’ inizio dell’analisi.

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- ANALYSIS TIME: imposta la durata dell’analisi, al termine della quale ricomincerà un

nuovo ciclo condizionamento-analisi (con il campionatore è possibile eseguire molte analisi

in successione in modo automatico).

- CLEAN STROKES: imposta i cicli di pulizia che affronterà la siringa prima di prelevare il

campione (da 1 a 7)

Sono inoltre presenti una serie di led che indicano:

- BATH TEMP READY: si accende quando la temperatura del bagno è raggiunta.

- SYRINGE TEMP READY: si accende quando la temperatura della siringa è raggiunta.

- READY: si accende quando tutti i parametri impostati sono raggiunti (l’analisi stessa non

parte se questa spia non è accesa).

Altri pulsanti sono collegati a led e permettono di :

- EVEN: analizzare il contenuto dei vials pari.

- ODD: analizzare il contenuto dei vials dispari.

- STOP: fermare il campionatore.

- MAN: far partire il campionatore con modalità manuale, cioè effettuare soltanto un’analisi.

- AUT: far partire il campionatore con modalità automatica in isoterma (dopo aver

precedentemente impostato i tempi di analisi e di condizionamento).

- REM: far partire il campionatore in modalità automatica con temperatura programmata

(dopo aver precedentemente impostato i tempi di analisi e di condizionamento).

CONTROLLO INTEGRATORE

Al momento dell’accensione (tramite un tasto posto dietro l’integratore stesso) è necessario inserire,

come richiesto dallo strumento, data e ora confermando con ENTER.

Per effettuare un’analisi gas-cromatografica è necessario conoscere i seguenti controlli:

- ZERO: forza la linea di base verso sinistra.

- CHT SP (CHART SPEED): imposta la velocità della carta, con valori da 0,1 a 20 cm al

minuto.

- ATTEN (ATTENUATION): imposta l’attenuazione del segnale in ingresso. I valori sono

potenze di 2 (più il valore è basso minore sarà l’attenuazione e, pertanto, il picco sul

cromatogramma avrà un’altezza maggiore).

- PT EVAL (PEAK THRESHOLD EVALUATION): consente di capire se vi è un buon

rapporto segnale-rumore. Premendo PT EVAL, dopo alcuni secondi verrà stampato un

valore: se questo è compreso tra 12 e 200 l’analisi può partire, se invece ha un valore

maggiore è necessario reimpostare la linea di base.

- INJ A, INJ B: fa partire l’analisi della linea A oppure della linea B; premendolo una seconda

volta ferma l’analisi riportando in tabella i picchi trovati e le loro aree

- ABORT A, ABORT B: ferma l’analisi della linea A oppure della linea B.

- REPORT: alla fine dell’analisi, premuto dopo ABORT, riporta in tabella i picchi trovati e le

aree.

- TIME: riporta l’ora.

- RUN TIME: riporta il tempo trascorso dall’inizio dell’analisi.

- TFN: consente di visualizzare co precisione l’inizio e la fine dei picchi. Questa funzione

risulta molto utile nel caso in cui ci sono 2 picchi uniti. Per attivarla premere in sequenza i

seguenti tasti: TFN, P, M, ENTER, 1, ENTER.

Abbiamo riportato solo alcune funzioni dell’integratore indispensabili per effettuare un’analisi; tutte

le altre sono consultabili sul manuale dell’integratore stesso sito nel laboratorio di analisi tecniche

strumentali.

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Principio della gas-cromatografia

La gas-cromatografia si basa sulla diversa ripartizione di diverse sostanze tra una fase stazionaria ed

una fase mobile, in funzione dell'affinità di ogni sostanza con la fase mobile, costituita da un gas

inerte.

I meccanismi di separazione e le prestazioni delle numerose varianti oggi in uso della GC sono

determinati non tanto dalla fase mobile, quanto dalle caratteristiche chimico-fisiche della fase

stazionaria e della forma in cui essa è presente nella colonna. Questa tecnica conserva una posizione

di primo piano fra le tecniche di separazione di miscele anche molto complesse, infatti è possibile

analizzare campioni gassosi, liquidi o solidi, purchè siano opportunamente solubilizzato e possono

essere vaporizzati. Il gas-cromatografo è praticamente indispensabile in qualsiasi laboratorio di

ricerca e per il controllo di qualità in quanto può essere applicata in tutti i campi della tecnologia e

della ricerca.

Per classificare le tecniche gas-cromatografiche, si usano perlopiù due criteri. Uno fa riferimento

allo stato fisico della fase stazionaria e distingue così fra:

cromatografia gas-solido: il principio di funzionamento è l’adsorbimento, in cui la fase

stazionaria è un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado di stabilire una

serie di legami secondari (dipolo-dipolo, ponte idrogeno, Van der Waals, dipolo-dipolo

indotto, ecc.) con le diverse molecole della miscela da risolvere.

cromatografia gas-liquido: il principio di funzionamento è ripartizione in cui la fase

stazionaria è liquida nella quale si verifica una vera e propria solubilizzazione delle sostanze

nella fase stazionaria che si ripartiscono tra le due fasi immiscibili.

Il secondo prende in considerazione le caratteristiche geometriche della colonna e la collocazione

della fase stazionaria di quest’ultima; si distinguono principalmente così le seguenti varianti:

- GC su colonne impaccate, in cui la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso

o da un liquido depositato su un supporto costituito da particelle porose e inerti, che occupa

tutto il volume disponibile nella colonna. Il carrier percorre la colonna passando attraverso

gli spazi lasciati liberi dalle particelle di riempimento;

- GC su colonne capillari, in cui la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film

sottilissimo sulle parete interne di un capillare con diametro di 0,1- 0,75 mm e lungo da 15 a

100 m. Il carrier percorre il canale centrale lasciato libero dalla fase stazionaria; questo

agevola il flusso del gas e consente un migliore contatto tra le due fasi.

http://it.wikipedia.org/wiki/Legame_chimico

http://it.wikipedia.org/wiki/Molecola

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Le prestazioni di un sistema cromatografico vengono valutate in base a:

SELETTIVITA’: è la capacità di un sistema cromatografico di eliminare specie chimiche diverse a

velocità il più possibile diverse in modo che siano l’una separata dall’altra.

EFFICIENZA: è la capacità di un sistema di eliminare tutte le particelle di una stessa sostanza con

la stessa velocità in modo da vere picchi stretti.

ASIMMETRIA PICCHI: una buona separazione deve fornire picchi simmetrici senza code. Le

cause più probabili di asimmetria sono:

1. introduzione troppo lenta della miscela

2. adsorbimento irreversibile della sostanza sulla fase stazionaria

3. reazioni chimiche in colonna

4. sovraccarico, saturazione dei siti attivi.

5. variazione dalla Kc.

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Tutte le separazioni cromatografiche si concludono con la registrazione del cromatogramma, ovvero

del tracciato che descrive l’andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume

di eluente a partire dall’istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna.

Al passaggio del solo eluente (o del gas di trasporto “carrier”) il segnale è bassissimo, quindi

avremo la linea di base. Al passaggio delle sostanze in esame il segnale amplificato ed il tracciato si

inclina, raggiunge un massimo e ritorna alla linea di base. Ognuno di questi è detto picco

cromatografico.

Il suo andamento in condizioni ideali è quello di una Gaussiana.

h: l’altezza del picco, indica la distanza fra il punto di massimo e la tangente alla linea

di base.

Wb : larghezza del picco: è uguale alla lunghezza delle due tangenti ai punti di flesso.

Wh : larghezza a metà altezza, è uguale alla larghezza a metà altezza del picco (50%

altezza).

A: indica l’area totale ed è proporzionale alla concentrazione o quantità di sostanza

separata. L’area ABCDE corrisponde a circa il 95 % dell’area del picco.

Tr (tempo di ritenzione): è il tempo impiegatola ciascuna sostanza per scorrere nella

colonna (dall’iniezione al punto di max)

Vr: volume di ritenzione questo valore si può misurare ed è tipico di ogni sostanza.

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Altri parametri fondamentali sono:

Tm: indica il tempo morto e corrisponde al tempo di ritenzione di una sostanza che non viene

trattenuta dalla fase stazionaria.

Tempo di ritenzione corretto: indica il tempo di contatto di ogni sostanza con la fase stazionaria e

si calcola T1

R= TR-TM

Costante di distribuzione: durante il passaggio delle sostanze nella colonna si stabilisce un equilibrio fra fase mobile e

stazionaria, se indichiamo con C la concentrazione avremo:

CM CS

cui corrisponde una costante di equilibrio detto anche coefficiente di distribuzione.

KC= CS/CM

KC dipende dalla natura della fase mobile e stazionaria ma anche dalla temperatura di lavoro (è una

grandezza termodinamica).

Se KC è grande, significa che Cs CM quindi la sostanza è molto affine con la fase stazionaria.

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