BIOLOGIA MOLECOLARE IN ONCOLOGIA: EGFR nel NSCLC …tecnlab/Materiale Didattico/2016/Oncologia...
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Laboratorio di Biologia Molecolare S.C. Oncologia Medica
Azienda Ospedaliera-Universitaria Perugia
Siggillino Annamaria “Corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico”
Perugia, 12 Aprile 2016
BIOLOGIA MOLECOLARE IN ONCOLOGIA: EGFR nel NSCLC-tecniche di analisi mutazionale
TKD
EGFR 1
The EGFR Family
Recettore per il fattore di crescita dell’epidermide (EGFR)
Recettori tirosino-chinasici
• stimolazione della proliferazione cellulare (attivazione via delle MAPK) • inibizione dell’apoptosi (attivazione di PI3K)
Attivazione di EGFR
EGFR-TK inhibitors di I e II generazione Gefitinib Erlotinib Afatinib
• Mutazioni di EGFR: esoni 18-19-20-21 (codificano per il dominio tirosino-chinasico)
• Mutazioni di EGFR: attivazione costitutiva del recettore
• Mutazioni conferiscono sensibilità ai TKI: causano una modificazione conformazionale che consente un miglior legame del farmaco nella tasca di legame per l’ATP
• L’ATP non potrà legarsi e non potrà attivare la cascata degli eventi a valle
Attivazione di EGFR
Più elevata frequenza di mutazioni: • Sesso femminile • Non fumatori • Istotipo adenocarcinoma • Etnia asiatica pazienti asiatici: nel 40% dei ADC pazienti caucasici: 10-15% degli ADC
Mutazioni di EGFR
Raccomandazioni AIOM‐SIAPEC 2014
Indicazioni cliniche Pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) in stadio IIIB e IV.
Istotipo adenocarcinoma, carcinoma a grandi cellule, carcinoma misto con adenocarcinoma, e NSCLC non altrimenti specificato (NAS).
Campioni Istologici
Campioni Citologici
ctDNA
Cellule Tumorali Circolanti
2014:… EMA (European Medicines Agency ) approva , per la somministrazione dell’IRESSA, l’uso della determinazione delle mutazioni di EGFR nel ctDNA (circulating tumour DNA) ottenuto dal sangue, in quei pazienti dove il tessuto tumorale non è disponibile o è esaurito.
Il materiale biologico per l’analisi molecolare
Citoinclusi, strisci su vetrino
Pezzo operatorio Prelievo bioptico del tumore primitivo e/o della metastasi
Determinazione mutazioni di EGFR usata ancora solo per ricerca
Limite minimo: 100 cellule tumorali
BIOPSIA LIQUIDA
BIOPSIA SOLIDA
Estrazione e quantificazione del DNA
Valutazione quali/quantitativa
spettrofotometrica-fluorimetrica
Purezza DNA: A260/A280 : 1.7-1.9
• Ematossilina-eosina con l’area tumorale
cerchiata e la % di cellule tumorali
• 5 sezioni bianche da 10µm
Macrodissezione Manuale Microdissezione Laser
EGFR: tecniche di analisi mutazionale
Lindeman et al. 2013, CAP, ASLC, AMP ; ESMO Consensus 2013, AIOM 2014
Metodo Sensibilità (% di DNA mutato)
Tecniche di screening Sequenziamento diretto (Sanger) 10-15%
Pirosequenziamento 5-10%
High resolution melting analysis 5%
Tecniche a bersaglio molecolare
ARMS Real-Time PCR 1-5%
Strip hybridization 1%
PNA/LNA Clamp 0.1%-1%
ME PCR/Sequencing 0.1%-1%
Digital PCR 0.01%
EGFR: tecniche di analisi mutazionale
• Sequenziamento diretto (Sanger)
Percentuale di cellule tumorali
> 30%
• Real-Time PCR Therascreen EGFR RGQ Kit
Percentuale di cellule tumorali
< 30%
PER SEQUENZIARE…
Conoscere la sequenza dove è localizzata la mutazione
Disegnare dei primers che amplificano la regione in esame
Mettere a punto il protocollo di amplificazione (tm-mgcl2-specificità)
Purificare il prodotto di pcr
Mettere a punto il protocollo di sequenziamento
Purificare il prodotto di sequenza
Sequenziamento automatizzato diretto
PCR e Nested PCR
Viene eseguita una prima PCR che amplifica la sequenza di interesse, e a seguire una nested PCR, che mediante l’utilizzo di una coppia di primers che coprono una zona più interna della sequenza target, che amplifica ulteriormente il prodotto di PCR ottenuto.
Sequenziamento automatizzato diretto
ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO
AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR E ELETTROFORESI
Raccomandazioni:
Operare in una cappa a flusso laminare
Ambienti dedicati
Controllo di amplificazione positivo e negativo
Effettuare un controllo qualitativo/quantitativo del prodotto di amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio
PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO DI PCR
mediante l’utilizzo di ExoSAP esonucleasi I e Shrimp Alkalin Phosphatase
Sequenziamento automatizzato diretto
PCR di sequenza • Per ogni amplicone da sequenziare è necessario effettuare 2 reazioni: una
per filamento FW, una per filamento RW
• Viene eseguita una PCR, che si differenzia per la presenza (oltre che dNTPs) dei deossidNTPs (ddNTP), terminatori di catena (sprovvisti dell’ossidrile in 3’, necessario per l’allungamento della catena)
• I 4 ddNTPs, vengono aggiunti in concentrazione tale da formare frammenti di diversa lunghezza, corrispondenti ognuno ad ogni nucleotide della sequenza
• I 4 ddNTP saranno distinguibili perché ognuno legato a un fluorocromo diverso: ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP
Sequenziamento automatizzato diretto
Purificazione per eliminare i dye non incorporati (segnali aspecifici)
Denaturazione e risospensione del campione in Hi-Di Formammide
Elettroforesi capillare su Genetic Analyzer 3500
Sequenziamento automatizzato diretto
Analisi della sequenza • Ordinando questi frammenti per
lunghezza, tramite elettroforesi capillare, si avrà la sequenza del DNA stampo
• Durante l’elettroforesi un raggio laser eccita i fluorocromi che emetteranno una fluorescenza
• La fluorescenza viene rilevata da un detector e analizzata da un software
• L’output creato dal software è l’elettroferogramma
• Elaborazione ed interpretazione dei dati ottenuti mediante SeqScape v.2.7 Software
Sequenziamento automatizzato diretto
Esone 21: c.2573 T>G p.Leu858Arg
Esone 19: c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC p.Glu746_Ala750del ELREA (Ac. Glut,Leu,Arg,Ac. Glut., Ala)
EGFR: mutazioni sensibilità
ELETTROFEROGRAMMI
• Il software confronta la sequenza target con una sequenza consensus (di riferimento), in base alla quale riconosce ed evidenzia eventuali mutazioni
• La presenza di un doppio picco indica la presenza di una mutazioni in eterozigosi
Filamento FW
Filamento RW
Esone 20: c.2281G>T p.Ser768Ile
Esone 20: c.2369 C>T p.Thr790Met
EGFR: mutazioni resistenza
Filamento FW
Filamento RW
Filamento FW
Filamento RW
VANTAGGI
• Tecnologia disponibile in molti laboratori
• Tutte le mutazioni, incluse mutazioni non note possono essere identificate
SVANTAGGI
• Lunga e laboriosa
• Sensibilità tende ad essere più bassa di altre metodiche
• Il metodo non è standardizzato (ci sono diversi punti critici)
Allestire sempre due
PCR indipendenti
Sequenziare sempre
entrambi i filementi
FW e RW
Se vengono identificate
nuove mutazioni,
devono essere sempre
riconfermate
Sequenziamento automatizzato diretto
EGFR: tecniche di analisi mutazionale
• Sequenziamento diretto (Sanger)
Percentuale di cellule tumorali
> 30%
• Real-Time PCR Therascreen EGFR RGQ Kit
Percentuale di cellule tumorali
< 30%
Therascreen EGFR RGQ PCR Kit
CE-IVD Certificato per scopi diagnostici Rilevare 29 mutazioni somatiche dell’oncogene EGFR
Individuare fino all’1% delle mutazioni (minimo 5-10 copie DNA mutato)
8 saggi:
Saggio di controllo (Ctrl) amplifica una regione dell’esone 2 del gene EGFR
7 Saggi di mutazione: T790M, Delezioni es19, L858R, L861Q, G719X, S768I, Inserzioni es20
Le mutazioni sono rilevate dalle sonde marcate in FAM Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo interno (controllo interno) marcato con HEX. In questo modo viene verificata la presenza di eventuali inibitori, che potrebbero generare risultati falsi negativi.
Rotor-Gene Q
Therascreen EGFR RGQ PCR Kit
Ogni riga corrisponde a uno degli 8 specifici saggi di reazione Ogni colonna corrisponde ad un singolo campione In ogni seduta analizzare un Controllo Positivo PC e un Controllo Negativo NTC Massimo 7 campioni (5 µL di DNA 20ng/ µL) Ogni campione verrà analizzato per ogni singolo saggio di mutazione e per il saggio del controllo
Per ognuno degli 8 saggi: Per il numero dei campioni da analizzare +1 volume morto
Tecnologia ARMS (Amplification Refractory Mutation System sistema di mutazioni refrattarie all’amplificazione) consente l’amplificazione allele-specifica e mutazione-specifica. La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere e efficace per distinguere tra un appaiamento corretto e un appaiamento errato. Tecnologia Scorpion marcata con il fluoroforo FAM, consente di rilevare il risultato dell’amplificazione. La progettazione delle scorpion probes è simile a quella delle molecular probes, con la differenza che al 3’ terminale del probe vi è un primer, che è specifico per l’ estensione del target al quale è legato per mezzo di un blocker.
Therascreen EGFR RGQ PCR Kit DUE TECNOLOGIE:
SONDA SCORPION
Therascreen EGFR RGQ PCR Kit
Step2: Durante il processo di denaturazione si verifica l’allontanamento del quencher dal reporter e del primer di innesco dal DNA target .
Step 3: Raffreddandosi lo Scorpions steso subisce un riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera target specifica.
Step 1: Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA
Therascreen EGFR RGQ PCR Kit
VANTAGGI
• Semplice da interpretare
• Veloce
• Elevata sensibilità
• Metodo standardizzato
SVANTAGGI
• Costosa
• Riconosce solo mutazioni note
Mutazione Controllo
Ct= ciclo corrispondente al punto il
cui la curva di amplificazione
incontra la Threshold
Curve di amplificazione: una per ogni saggio
Per ogni saggio:
ΔCT
mutation Ct – control Ct