BIOLOGIA MOLECOLARE IN ONCOLOGIA: EGFR nel NSCLC …tecnlab/Materiale Didattico/2016/Oncologia...

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Laboratorio di Biologia Molecolare S.C. Oncologia Medica Azienda Ospedaliera-Universitaria Perugia Siggillino Annamaria “Corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico” Perugia, 12 Aprile 2016 BIOLOGIA MOLECOLARE IN ONCOLOGIA: EGFR nel NSCLC-tecniche di analisi mutazionale

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Laboratorio di Biologia Molecolare S.C. Oncologia Medica

Azienda Ospedaliera-Universitaria Perugia

Siggillino Annamaria “Corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico”

Perugia, 12 Aprile 2016

BIOLOGIA MOLECOLARE IN ONCOLOGIA: EGFR nel NSCLC-tecniche di analisi mutazionale

TKD

EGFR 1

The EGFR Family

Recettore per il fattore di crescita dell’epidermide (EGFR)

Recettori tirosino-chinasici

• stimolazione della proliferazione cellulare (attivazione via delle MAPK) • inibizione dell’apoptosi (attivazione di PI3K)

Attivazione di EGFR

EGFR-TK inhibitors di I e II generazione Gefitinib Erlotinib Afatinib

• Mutazioni di EGFR: esoni 18-19-20-21 (codificano per il dominio tirosino-chinasico)

• Mutazioni di EGFR: attivazione costitutiva del recettore

• Mutazioni conferiscono sensibilità ai TKI: causano una modificazione conformazionale che consente un miglior legame del farmaco nella tasca di legame per l’ATP

• L’ATP non potrà legarsi e non potrà attivare la cascata degli eventi a valle

Attivazione di EGFR

Mutazioni di EGFR

Sharma et al, Nature 2007;7:168-181

L858R

Ex 19 Deletion

Più elevata frequenza di mutazioni: • Sesso femminile • Non fumatori • Istotipo adenocarcinoma • Etnia asiatica pazienti asiatici: nel 40% dei ADC pazienti caucasici: 10-15% degli ADC

Mutazioni di EGFR

Raccomandazioni AIOM‐SIAPEC 2014

Indicazioni cliniche Pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) in stadio IIIB e IV.

Istotipo adenocarcinoma, carcinoma a grandi cellule, carcinoma misto con adenocarcinoma, e NSCLC non altrimenti specificato (NAS).

Campioni Istologici

Campioni Citologici

ctDNA

Cellule Tumorali Circolanti

2014:… EMA (European Medicines Agency ) approva , per la somministrazione dell’IRESSA, l’uso della determinazione delle mutazioni di EGFR nel ctDNA (circulating tumour DNA) ottenuto dal sangue, in quei pazienti dove il tessuto tumorale non è disponibile o è esaurito.

Il materiale biologico per l’analisi molecolare

Citoinclusi, strisci su vetrino

Pezzo operatorio Prelievo bioptico del tumore primitivo e/o della metastasi

Determinazione mutazioni di EGFR usata ancora solo per ricerca

Limite minimo: 100 cellule tumorali

BIOPSIA LIQUIDA

BIOPSIA SOLIDA

Estrazione e quantificazione del DNA

Valutazione quali/quantitativa

spettrofotometrica-fluorimetrica

Purezza DNA: A260/A280 : 1.7-1.9

• Ematossilina-eosina con l’area tumorale

cerchiata e la % di cellule tumorali

• 5 sezioni bianche da 10µm

Macrodissezione Manuale Microdissezione Laser

EGFR: tecniche di analisi mutazionale

Lindeman et al. 2013, CAP, ASLC, AMP ; ESMO Consensus 2013, AIOM 2014

Metodo Sensibilità (% di DNA mutato)

Tecniche di screening Sequenziamento diretto (Sanger) 10-15%

Pirosequenziamento 5-10%

High resolution melting analysis 5%

Tecniche a bersaglio molecolare

ARMS Real-Time PCR 1-5%

Strip hybridization 1%

PNA/LNA Clamp 0.1%-1%

ME PCR/Sequencing 0.1%-1%

Digital PCR 0.01%

EGFR: tecniche di analisi mutazionale

• Sequenziamento diretto (Sanger)

Percentuale di cellule tumorali

> 30%

• Real-Time PCR Therascreen EGFR RGQ Kit

Percentuale di cellule tumorali

< 30%

PER SEQUENZIARE…

Conoscere la sequenza dove è localizzata la mutazione

Disegnare dei primers che amplificano la regione in esame

Mettere a punto il protocollo di amplificazione (tm-mgcl2-specificità)

Purificare il prodotto di pcr

Mettere a punto il protocollo di sequenziamento

Purificare il prodotto di sequenza

Sequenziamento automatizzato diretto

PCR e Nested PCR

Viene eseguita una prima PCR che amplifica la sequenza di interesse, e a seguire una nested PCR, che mediante l’utilizzo di una coppia di primers che coprono una zona più interna della sequenza target, che amplifica ulteriormente il prodotto di PCR ottenuto.

Sequenziamento automatizzato diretto

ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO

AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR E ELETTROFORESI

Raccomandazioni:

Operare in una cappa a flusso laminare

Ambienti dedicati

Controllo di amplificazione positivo e negativo

Effettuare un controllo qualitativo/quantitativo del prodotto di amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio

PURIFICAZIONE DEL PRODOTTO DI PCR

mediante l’utilizzo di ExoSAP esonucleasi I e Shrimp Alkalin Phosphatase

Sequenziamento automatizzato diretto

PCR di sequenza • Per ogni amplicone da sequenziare è necessario effettuare 2 reazioni: una

per filamento FW, una per filamento RW

• Viene eseguita una PCR, che si differenzia per la presenza (oltre che dNTPs) dei deossidNTPs (ddNTP), terminatori di catena (sprovvisti dell’ossidrile in 3’, necessario per l’allungamento della catena)

• I 4 ddNTPs, vengono aggiunti in concentrazione tale da formare frammenti di diversa lunghezza, corrispondenti ognuno ad ogni nucleotide della sequenza

• I 4 ddNTP saranno distinguibili perché ognuno legato a un fluorocromo diverso: ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP

Sequenziamento automatizzato diretto

Purificazione per eliminare i dye non incorporati (segnali aspecifici)

Denaturazione e risospensione del campione in Hi-Di Formammide

Elettroforesi capillare su Genetic Analyzer 3500

Sequenziamento automatizzato diretto

Analisi della sequenza • Ordinando questi frammenti per

lunghezza, tramite elettroforesi capillare, si avrà la sequenza del DNA stampo

• Durante l’elettroforesi un raggio laser eccita i fluorocromi che emetteranno una fluorescenza

• La fluorescenza viene rilevata da un detector e analizzata da un software

• L’output creato dal software è l’elettroferogramma

• Elaborazione ed interpretazione dei dati ottenuti mediante SeqScape v.2.7 Software

Sequenziamento automatizzato diretto

Esone 21: c.2573 T>G p.Leu858Arg

Esone 19: c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC p.Glu746_Ala750del ELREA (Ac. Glut,Leu,Arg,Ac. Glut., Ala)

EGFR: mutazioni sensibilità

ELETTROFEROGRAMMI

• Il software confronta la sequenza target con una sequenza consensus (di riferimento), in base alla quale riconosce ed evidenzia eventuali mutazioni

• La presenza di un doppio picco indica la presenza di una mutazioni in eterozigosi

Filamento FW

Filamento RW

Esone 20: c.2281G>T p.Ser768Ile

Esone 20: c.2369 C>T p.Thr790Met

EGFR: mutazioni resistenza

Filamento FW

Filamento RW

Filamento FW

Filamento RW

VANTAGGI

• Tecnologia disponibile in molti laboratori

• Tutte le mutazioni, incluse mutazioni non note possono essere identificate

SVANTAGGI

• Lunga e laboriosa

• Sensibilità tende ad essere più bassa di altre metodiche

• Il metodo non è standardizzato (ci sono diversi punti critici)

Allestire sempre due

PCR indipendenti

Sequenziare sempre

entrambi i filementi

FW e RW

Se vengono identificate

nuove mutazioni,

devono essere sempre

riconfermate

Sequenziamento automatizzato diretto

EGFR: tecniche di analisi mutazionale

• Sequenziamento diretto (Sanger)

Percentuale di cellule tumorali

> 30%

• Real-Time PCR Therascreen EGFR RGQ Kit

Percentuale di cellule tumorali

< 30%

Therascreen EGFR RGQ PCR Kit

CE-IVD Certificato per scopi diagnostici Rilevare 29 mutazioni somatiche dell’oncogene EGFR

Individuare fino all’1% delle mutazioni (minimo 5-10 copie DNA mutato)

8 saggi:

Saggio di controllo (Ctrl) amplifica una regione dell’esone 2 del gene EGFR

7 Saggi di mutazione: T790M, Delezioni es19, L858R, L861Q, G719X, S768I, Inserzioni es20

Le mutazioni sono rilevate dalle sonde marcate in FAM Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo interno (controllo interno) marcato con HEX. In questo modo viene verificata la presenza di eventuali inibitori, che potrebbero generare risultati falsi negativi.

Rotor-Gene Q

Therascreen EGFR RGQ PCR Kit

Ogni riga corrisponde a uno degli 8 specifici saggi di reazione Ogni colonna corrisponde ad un singolo campione In ogni seduta analizzare un Controllo Positivo PC e un Controllo Negativo NTC Massimo 7 campioni (5 µL di DNA 20ng/ µL) Ogni campione verrà analizzato per ogni singolo saggio di mutazione e per il saggio del controllo

Per ognuno degli 8 saggi: Per il numero dei campioni da analizzare +1 volume morto

Tecnologia ARMS (Amplification Refractory Mutation System sistema di mutazioni refrattarie all’amplificazione) consente l’amplificazione allele-specifica e mutazione-specifica. La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere e efficace per distinguere tra un appaiamento corretto e un appaiamento errato. Tecnologia Scorpion marcata con il fluoroforo FAM, consente di rilevare il risultato dell’amplificazione. La progettazione delle scorpion probes è simile a quella delle molecular probes, con la differenza che al 3’ terminale del probe vi è un primer, che è specifico per l’ estensione del target al quale è legato per mezzo di un blocker.

Therascreen EGFR RGQ PCR Kit DUE TECNOLOGIE:

SONDA SCORPION

Therascreen EGFR RGQ PCR Kit

Step2: Durante il processo di denaturazione si verifica l’allontanamento del quencher dal reporter e del primer di innesco dal DNA target .

Step 3: Raffreddandosi lo Scorpions steso subisce un riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera target specifica.

Step 1: Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA

Therascreen EGFR RGQ PCR Kit

VANTAGGI

• Semplice da interpretare

• Veloce

• Elevata sensibilità

• Metodo standardizzato

SVANTAGGI

• Costosa

• Riconosce solo mutazioni note

Mutazione Controllo

Ct= ciclo corrispondente al punto il

cui la curva di amplificazione

incontra la Threshold

Curve di amplificazione: una per ogni saggio

Per ogni saggio:

ΔCT

mutation Ct – control Ct