Biologia Molecolare e Biochimica Monica Bianchini Dipartimento di Ingegneria dellInformazione e...

Biologia Molecolare Biologia Molecolare e Biochimicae Biochimica

Monica BianchiniMonica Bianchini

Dipartimento di Ingegneria dell’Informazione e Scienze MatematicheDipartimento di Ingegneria dell’Informazione e Scienze Matematiche

[email protected]@diism.unisi.it

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“La scienza non può risolvere il mistero ultimo della natura. E ciò perché, in ultima analisi, noi stessi facciamo parte del mistero che stiamo cercando di risolvere.” (M. Planck)

SommarioSommario

IntroduzioneIntroduzione

Il materiale geneticoIl materiale genetico

Struttura del gene e contenuto informativoStruttura del gene e contenuto informativo

Struttura e funzione proteicaStruttura e funzione proteica

La natura dei legami chimiciLa natura dei legami chimici

Strumenti per la biologia molecolareStrumenti per la biologia molecolare

Contenuto informativo del genomaContenuto informativo del genoma

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Introduzione Introduzione 1 1

La caratteristica dominante degli organismi vi-venti è la loro capacità di conservare, utilizzare e trasmettere le informazioni

La BioinformaticaBioinformatica mira a:determinare quali informazioni sono biologicamente significative decifrare come vengono usate per il controllo della chimica degli organismi viventi

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La BioinformaticaBioinformatica è una disciplina che si situa all’incrocio tra la BiologiaBiologia, l’InformaticaInformatica e le nuove nuove tecnologietecnologieÈ caratterizzata dall’applicazione di metodi mate-matici, statistici, computazionali all’analisi di dati biologici, biochimici e biofisici Principale soggetto di studio è il DNADNA, ma con il diffondersi di tecniche sempre più economiche ed efficaci per acquisire dati proteicidati proteici, anch’essi sono diventati disponibili all’analisi bioinformatica

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Nella BioinformaticaBioinformatica, si possono individuare tre principali sottosettori:

Sviluppo e implementazione di strumenti per conservare, analizzare e gestire dati

Creazione di biobanche, database management

Analisi e interpretazione dei dati per individuare informazioni

Data mining

Sviluppo di nuovi algoritmi per estrarre/verificare le relazioni tra un gran numero di informazioni

Metodi statistici, intelligenza artificiale

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La BioinformaticaBioinformatica è quindi…l’insieme di metodi e strumenti informatici e delle ricerche di base e applicate che li utilizzano, che si sviluppano nei diversi settori della Biologia, della Chimica e della Medicina

Sono oggetto della BioinformaticaBioinformatica:le tecniche di realizzazione di banche dati utili alla ricerca biomedica ed i software necessari per la loro interrogazionegli strumenti, tipici dell’intelligenza artificiale e della statistica, che consentono l’analisi di tali dati e l’individuazione/estrazione automatica di informa-zioni originali

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Il materiale genetico Il materiale genetico 1 1

Il DNADNA (acido desossiribonucleicoacido desossiribonucleico) è il materiale materiale geneticogeneticoÈ infatti l’informazione contenuta nel DNA che permette l’organizzazione di molecole inanimate in cellule viventi e in organismi capaci di regolare la propria composizione chimica interna e la propria crescita e riproduzioneÈ inoltre il DNA che ci garantisce l’ereditarietà delle caratteristiche somatiche dei nostri avi, tramite la trasmissione dei genigeni

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I geni contengono l’informazione, sotto forma di specifiche sequenze nucleotidiche sequenze nucleotidiche che costituisco-no le molecole del DNALe molecole del DNA utilizzano solo quattro basi basi azotateazotate, guaninaguanina, adeninaadenina, timinatimina e citosinacitosina (G,A,T,C), a cui sono attaccati un gruppo fosfato gruppo fosfato (PO4) ed uno zucchero desossiribosio zucchero desossiribosio (C5H10O4), a formare un nucleotidenucleotide

CitosinaCitosinaGuaninaGuanina AdeninaAdenina TiminaTimina 8

Il materiale genetico Il materiale genetico 3 3Tutta l’informazione contenuta nei geni deriva dal-l’ordine in cui i quattro nucleotidi si trovano lungo la molecola di DNAGeni complicati possono essere composti da centinaia di nucleotidiIl codice genetico di un organismo, detto genomagenoma, è conservato in milioni/miliardi di nucleotidi

Struttura chimica dell’Adenosina 5’ monofosfato: ogni nucleotide è composto Struttura chimica dell’Adenosina 5’ monofosfato: ogni nucleotide è composto da tre parti, un gruppo fosfato, uno zucchero desossiribosio centrale ed una da tre parti, un gruppo fosfato, uno zucchero desossiribosio centrale ed una delle quattro basi azotatedelle quattro basi azotate

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Stringhe di nucleotidi possono essere unite tra loro a formare lunghe catene polinucleotidichecatene polinucleotidiche e, su larga scala, un cromosomacromosomaL’unione di due nucleotidi avviene attraverso la formazione di legami fosfodiesterelegami fosfodiestere, che uniscono il gruppo fosfato di un nucleotide allo zucchero desossiribosio di un altro nucleotideI legami estereestere coinvolgono collegamenti mediati da atomi di ossigeno

I legami fosfodiestere si hanno quando un atomo di fosforo di un gruppo fosfato lega due molecole tramite due legami estere

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I nucleotidi del DNA sono uniti tra loro mediante legami covalenti fra i gruppi ossidrile I nucleotidi del DNA sono uniti tra loro mediante legami covalenti fra i gruppi ossidrile ((OH) in 5’ e 3’: l’alternanza dei residui fosfato e dei pentosi forma lo scheletro degli OH) in 5’ e 3’: l’alternanza dei residui fosfato e dei pentosi forma lo scheletro degli acidi nucleici acidi nucleici 11


Tutti gli esseri viventi formano legami fosfodie-stere esattamente allo stesso modoOgnuno dei cinque atomi di carbonio del desossi-ribosio pentosiopentosio ha assegnato un numero d’ordine (da 1’ a 5’)

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I gruppi fosfato di ogni nucleotide libero si trova-no sempre legati al carbonio 5’ dello zucchero

I gruppi fosfato fanno da ponte tra il carbonio 5’ del desossiribosio di un nuovo nucleotide e il carbo-nio 3’ di una catena polinucleotidica preesistente

Una stringa di nucleotidi termina sempre con un Una stringa di nucleotidi termina sempre con un carbonio 5’, mentre all’altra terminazione della carbonio 5’, mentre all’altra terminazione della molecola vi è un carbonio 3’ liberomolecola vi è un carbonio 3’ libero

L’orientamento della molecola del DNA è fonda-mentale per decifrare il contenuto informativo della cellula

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Un tema comune a tutti i siste-mi biologici, ed a tutti i livelli, è l’idea che struttura e funzione siano intimamente correlateLa scoperta di J.J. WatsonWatson e F. F. CrickCrick (1953) che la molecola di DNA all’interno delle cellule so-litamente esistesse come mole-cola a doppio filamento fornì un inestimabile indizio su come il DNA potesse agire come mate-riale genetico

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J. Watson e F. Crick (Nobel J. Watson e F. Crick (Nobel per la Medicina con M. per la Medicina con M. Wilkinson, 1962)Wilkinson, 1962)

Il materiale genetico Il materiale genetico 9 9Il DNA è dunque costituito da due filamenti e l’informazione contenuta in un filamento è ridondante rispetto all’infor-mazione contenuta nell’altro

Il DNA può essere replicato e Il DNA può essere replicato e trasmesso fedelmente da una trasmesso fedelmente da una generazione all’altra separan-generazione all’altra separan-do i due filamenti e usandone do i due filamenti e usandone ciascuno come stampo per la ciascuno come stampo per la sintesi di un nuovo filamentosintesi di un nuovo filamento

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Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento viene separato per mezzo Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento viene separato per mezzo dell’elicasi; ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo dell’elicasi; ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento, prodotto grazie alla DNA polimerasifilamento, prodotto grazie alla DNA polimerasi

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(Single Strand Binding Protein)


Più esattamente: l’informazione contenuta nei due filamenti del DNA è complementare

Per ogni G di un filamento si trova una C sul filamento complementare e viceversaPer ogni A di un filamento si trova una T sul filamento complementare e viceversaL’interazione tra G e C e tra A e T è specifica e stabile

Nello spazio presente fra due filamenti di DNA (11Å), la guanina, con la sua struttura a doppio anello, è troppo grande per accoppiarsi con il doppio anello dell’adenina o di un’altra guaninaLa timina, con la sua struttura ad anello singolo, è troppo piccola per interagire con un’altra base a singolo anello (citosina o timina)

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Lo spazio tra i due filamenti di DNA non è una barriera all’interazione tra G e T, né tra A e C, ma la loro natura chimica le rende incompatibili

Tre legami idrogenoTre legami idrogeno

Due legami idrogenoDue legami idrogeno

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L’interazione chimica che si forma tra i due diversi tipi di coppie è così stabile ed energeticamente favorevole che da sola è responsabile dell’unione dei due filamenti complementari


I due filamenti della molecola di DNA non hanno lo stesso orientamento (5’/3’): sono antiparalleliantiparalleli, con l’estremità 5’ di un filamento che corrisponde all’estremità 3’ del filamento complementare e viceversa

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EsempioEsempioSe la sequenza nucleotidica di un filamento è 5’GTATCC3’, la sequenza del filamento comple-mentare sarà 3’CATAGG5’ (o, per convenzione, 5’GGATAC3’)

Sequenze caratteristiche poste in posizione 5’ rispetto ad un dato punto di riferimento sono comunemente definite upstreamupstream (a monte), quel-le in posizione 3’ si dicono invece downstream downstream (a valle)

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Il dogma centrale della biologia molecolare Il dogma centrale della biologia molecolare 1 1

Benché la specifica sequenza nucleotidica di una molecola di DNA contenga importanti informa-zioni, sono gli enzimienzimi che, agendo come cataliz-cataliz-zatorizatori, compiono il lavoro di modifica della chimi-ca della cellula

I catalizzatori sono molecole che permettono a specifiche reazioni chimiche di procedere più velocemente: non si consumano, né si alterano, e possono quindi essere utilizzati più volte per catalizzare la stessa reazione

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I genigeni contengono le istruzioni necessarie per realizzare i catalizzatori enzimatici prodotti dalla cellulaIl processo di estrazione dell’informazione dalla sequenza nucleotidica di un gene per la costru-zione degli enzimi è comune a tutti gli esseri viventiPiù in dettaglio: l’informazione conservata nel l’informazione conservata nel DNA è utilizzata per sintetizzare una molecola DNA è utilizzata per sintetizzare una molecola transitoria polinucleotide a singolo filamento, det-transitoria polinucleotide a singolo filamento, det-ta ta RNARNA (acido ribonucleico), che è a sua volta (acido ribonucleico), che è a sua volta utilizzata per sintetizzare le utilizzata per sintetizzare le proteineproteine

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Il processo di copia di un gene in RNA è chiamato trascrizionetrascrizione ed è realizzato attraverso l’attività enzimatica di una RNA polimerasiRNA polimerasi

Corrispondenza unoaduno tra i nucleotidi G, A, U (uracileuracile), C dell’RNA e G, A, T, C del DNA

Il processo di conversione dalla sequenza nucleo-tidica dell’RNA alla sequenza aminoacidica che costituisce le proteine è chiamato traduzionetraduzione, ed è svolto da un complesso di proteine ed RNA, detto ribosomaribosoma

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DNA-polimerasi

RibosomiRNA-polimerasi

Trascrizione da DNA a RNA tramite RNA Trascrizione da DNA a RNA tramite RNA polimerasipolimerasi

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La struttura del gene La struttura del gene 1 1

Tutte le cellule interpretano le istruzioni gene-tiche allo stesso modo, grazie alla presenza di segnali specifici usati come segni di interpunzione fra geniIl “linguaggio” del DNA è stato elaborato all’inizio della storia della vita sulla terra ed ha subito poche modifiche nel corso di milioni di anni

Sia gli organismi Sia gli organismi procariotiprocarioti (batteri), sia gli (batteri), sia gli eucariotieucarioti (organismi complessi) utilizzano lo stes- (organismi complessi) utilizzano lo stes-so alfabeto di nucleotidi e lo stesso formato ed so alfabeto di nucleotidi e lo stesso formato ed approccio per immagazzinare e utilizzare l’infor-approccio per immagazzinare e utilizzare l’infor-mazione genetica mazione genetica

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Struttura di una cellula procariotica (a sinistra) e di una cellula eucariotica Struttura di una cellula procariotica (a sinistra) e di una cellula eucariotica animale (a destra)animale (a destra)

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L’espressione genicaespressione genica è il processo che utilizza l’informazione conservata nel DNA per costruire una molecola di RNA che codifica a sua volta una proteina

Costo energetico significativo per la cellula

Gli organismi che esprimono proteine inutili competono sfavorevolmente per la sopravvivenza rispetto agli organismi che regolano la propria espressione genica in modo più efficaceLe RNA polimerasi sono responsabili dell’attiva-zione dell’espressione genica attraverso la sintesi di copie di RNA del gene

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La struttura del gene La struttura del gene 4 4Le RNA polimerasi devono:

distinguere in modo affidabile l’inizio del genedeterminare quali geni codificano proteine necessarie

L’RNA polimerasi non può cercare un particolare nucleotide perché ogni nucleotide si trova casual-mente in qualsiasi parte del DNA

Le RNA polimerasi procariotiche esaminano una sequenza di DNA cercando uno specifico insieme di 13 nucleotidi

1 nucleotide serve come sito d’inizio per la trascrizione6 nucleotidi sono posti 10 nucleotidi a monte del sito d’inizio6 nucleotidi sono posti 35 nucleotidi a monte del sito d’inizio

Sequenza promotrice del geneSequenza promotrice del gene

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Poiché i genomi procariotici sono lunghi solo pochi milioni di nucleotidi, le sequenze promo-trici, che si possono trovare casualmente solo una volta ogni 70 milioni di nucleotidi, permet-tono all’RNA polimerasi di identificare in modo statisticamente affidabile l’inizio del gene

Il genoma degli eucarioti è di diversi ordini di grandezza più lungo: le RNA polimerasi devono riconoscere sequenze promotrici più lunghe e complesse per individuare l’inizio di un gene

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La struttura del gene La struttura del gene 6 6Due biochimici francesi, F. Jacob e J. Monod, furono i primi ad ottenere evidenza sperimentale su come le cellule distinguano tra geni che debbano o meno essere trascrittiIl loro lavoro sulla regolazione dei geni procariotici (Nobel 1965) rivelò che l’espressione dei geni strutturali (che codificano per proteine coinvolte nella struttura o nel metabolismo cellulare) è controllata da specifici geni regolatori

Le proteine codificate dai geni regolatori sono in grado di legarsi al DNA cellulare solo vicino alla sequenza promotrice e solo se lo richiede l’interazione con l’am-biente esterno dei geni strutturali la cui espressione esse controllano

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Quando il legame fra DNA e proteine rende più facile l’inizio della trascrizione da parte dell’RNA polimerasi, si dice che è avvenuta una regolazioregolazio-ne positivane positiva, negativanegativa quando il legame impedisce invece la trascrizione

I geni strutturali procariotici sono attivati/disattivati da una o due proteine regolatriciGli eucarioti utilizzano un complesso di sette (o più) proteine

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Il codice genetico Il codice genetico 1 1

Mentre i nucleotidi sono le unità fondamentali utilizzate dalla cellula per conservare le informa-zioni (DNA) e per costruire le molecole atte a trasferirle (RNA), gli aminoacidiaminoacidi sono le unità fondamentali costitutive delle proteineLa funzione di una proteina è fortemente dipen-dente dall’ordine in cui gli aminoacidi sono legati dai ribosomi durante la traduzione

Struttura chimica di un aminoacido: il gruppo amminico, Struttura chimica di un aminoacido: il gruppo amminico, il carbonio il carbonio , ed il gruppo carbossilico sono identici per , ed il gruppo carbossilico sono identici per tutti gli aminoacidi, che si differenziano invece in base tutti gli aminoacidi, che si differenziano invece in base al gruppo R (catena laterale)al gruppo R (catena laterale)

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Il codice genetico Il codice genetico 2 2Tuttavia, se per costruire le molecole di DNA ed RNA vengono utilizzati solo 4 nucleotidi, per la sintesi delle proteine si hanno 20 aminoacidi

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Pertanto, non vi può essere corrispondenza uno auno tra i nucleotidi dei geni e gli aminoacidi delle proteine che essi codificano, ne vi può essere corrispondenza fra coppie di nucleotidi (16 al più) e aminoacidi

È necessario che i ribosomi utilizzino un È necessario che i ribosomi utilizzino un codice a codice a triplettetriplette

Con tre sole eccezioni, ogni gruppo di tre nucleotidi, un codonecodone, in una copia di RNA della porzione codificante di un gene corrisponde ad uno specifico aminoacidoI tre codoni che non indicano al ribosoma di inserire un aminoacido sono i codoni di stopcodoni di stop

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Per un limitato numero di geni batterici, il codone UGA codifica un ventunesimo Per un limitato numero di geni batterici, il codone UGA codifica un ventunesimo aminoacido, la selenocisteina; un ventiduesimo aminoacido, la pirrolisina, è aminoacido, la selenocisteina; un ventiduesimo aminoacido, la pirrolisina, è codificata da UAG in qualche specie batterica ed eucarioticacodificata da UAG in qualche specie batterica ed eucariotica


Gli aminoacidi sono classificati in quattro diverse categorie

Gruppi R non polariGruppi R non polari, idrofobiciidrofobici: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina

Gruppi R polariGruppi R polari, idrofiliciidrofilici: serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina, glutammina

AcidiAcidi (carica elettrica negativa): acido aspartico, acido glutammico

BasiciBasici (carica elettrica positiva): lisina, arginina, istidina

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Ben 18 aminoacidi su 20 sono codificati da più di un codone: questa caratteristica del codice gene-tico è detta degenerazionedegenerazione

Un singolo cambiamento all’interno di un codone Un singolo cambiamento all’interno di un codone non è di solito sufficiente a causare la codifica di un non è di solito sufficiente a causare la codifica di un aminoacido di categoria diversaaminoacido di categoria diversa

Ovvero, durante la replicazione/trascrizione del DNA Ovvero, durante la replicazione/trascrizione del DNA si possono compiere errori che non hanno effetto si possono compiere errori che non hanno effetto sulla composizione aminoacidica della proteinasulla composizione aminoacidica della proteina

Il codice genetico è molto robusto e minimizza le Il codice genetico è molto robusto e minimizza le conseguenze dei possibili errori presenti nella conseguenze dei possibili errori presenti nella sequenza nucleotidica, evitandone il ripercuotersi sequenza nucleotidica, evitandone il ripercuotersi sulla funzione della proteina codificatasulla funzione della proteina codificata

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Il codice genetico Il codice genetico 8 8La traduzione, ad opera dei ribosomi, avviene a partire da un sito d’inizio, posto sulle copie di RNA di un gene, e procede fino al primo codone di stopIl codone d’inizio codone d’inizio è costituito dalla tripletta AUGAUG (che codifica anche la metionina), sia negli eucarioti che nei procariotiLa traduzione è accurata solo quando i ribosomi esaminano i codoni all’interno della cornice di letturacornice di lettura (delimitata da codone d’iniziocodone di stop)

L’alterazione della cornice di lettura di un gene cambia ogni aminoacido posto a valle dell’alterazione stessa e causa solitamente la produzione di una versione troncata della proteina

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Il codice genetico Il codice genetico 9 9La maggior parte dei geni codificano per proteine lunghe centinaia di aminoacidiDato che, in una sequenza generata casualmente, i codoni di stop si hanno circa ogni 20 triplette (3 codoni su 64), le cornici di lettura dei geni presentano solitamente sequenze molto lunghe in cui non si presentano codoni di stop

Cornici di lettura aperte Cornici di lettura aperte (Open Reading Frame Open Reading Frame ORFORF): sono una caratteristica distintiva di molti geni procariotici ed eucariotici

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Introni ed esoni Introni ed esoni 1 1Le copie di RNA messaggero, mRNAmRNA, dei geni procariotici corrispondono perfettamente alle sequenze di DNA presenti nel genoma, con l’eccezione dell’ura-cile, che viene utilizzato al posto della timina, mentre le fasi di trascrizione e traduzione sono parzialmente sovrapposteNegli eucarioti, le due fasi dell’espressione genica sono fisicamente separate dalla membrana nucleare: la trascrizione avviene nel nucleo, la traduzione solo dopo che l’mRNA è stato trasportato nel citoplasma

Le molecole di RNA trascritte dalla polimerasi Le molecole di RNA trascritte dalla polimerasi eucariotica possono essere modificate prima che i eucariotica possono essere modificate prima che i ribosomi le traducanoribosomi le traducano

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Introni ed esoni Introni ed esoni 2 2

Molti geni eucariotici hanno un numero di introni assai elevato

Esempio:Esempio: il gene associato al-la fibrosi cistica ha 24 introni ed è lungo più di un milione di coppie di basi, mentre l’mRNA tradotto dai ribosomi è costi-tuito da circa mille coppie di basi

La modificazione più evidente che subisce il trascritto primario dei geni eucariotici è lo splicingsplicing, che prevede il taglio degli introniintroni ed il ricongiungimento degli esoniesoni che li affiancano

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Introni ed esoni Introni ed esoni 3 3

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Introni ed esoni Introni ed esoni 4 4La grande maggioranza degli introni eucariotici è conforme alla regola GTAG, secondo cui gli introni iniziano con il dinucleotide GT e terminano con il dinucleotide AGIl fallimento del corretto splicing degli introni dal trascritto primario di RNA eucariotico può:

introdurre uno spostamento della cornice di letturagenerare un incontro prematuro con un codone di stop

Inutilizzabilità della proteina tradottaInutilizzabilità della proteina tradotta

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Introni ed esoni Introni ed esoni 5 5Le coppie di nucleotidi sono statisticamente troppo frequenti per essere considerate un segnale sufficiente per il riconoscimento degli introni da parte dello splicesomasplicesoma

Si esaminano altri sei nucleotidi addizionali alle termi-nazioni 5’ e 3’, che possono essere diversi per cellule diverse

Splicing alternativoSplicing alternativo: incremento della diversità proteica causato da modificazione dello splicesoma e delle proteine accessorie responsabili del riconoscimento del vicinato degli introni/esoni

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La funzione delle proteine La funzione delle proteine

I compiti delle proteineproteine sono incredibilmente diversificati

Le proteine strutturaliproteine strutturali, come il collagenecollagene, forniscono supporto alle ossa ed ai tessuti connettiviGli enzimienzimi agiscono come catalizzatori biologici, come la pepsinapepsina che regola il metabolismoLe proteine sono inoltre responsabili del trasporto di atomi e molecole nell’organismo (emoglobinaemoglobina), dei segnali e delle comunicazioni intercellulari (insuliinsuli-nana), dell’assorbimento dei fotoni per i processi visivi (rodopsinarodopsina), etc.

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La struttura primaria La struttura primaria 1 1

Seguendo le istruzioni contenute nell’mRNA, le proteine vengono tradotte dai ribosomi in un polimero lineare (catena) di aminoacidiI 20 aminoacidi hanno una struttura chimica simile e si diversificano solo in base al gruppo R

La regione costante di ogni aminoacido è detta catena principalecatena principale, mentre i diversi gruppi R vanno a costituire le catene lateralicatene laterali

L’ordine in cui i diversi aminoacidi sono assem-blati in una proteina ne costituisce la struttura struttura primariaprimaria

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La struttura primaria La struttura primaria 2 2La catena proteica ha una direzione

Un’estremità della catena ha un gruppo amminico libero (NH), mentre l’altra estremità termina con un gruppo carbossilico (COOH)La direzione della catena va dal terminale amminicoterminale amminico (che è il primo ad essere sintetizzato) fino al terminale terminale carbossilicocarbossilico

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Dopo la traduzione, la proteina collassa, cioè si piega e si modella in una complessa struttura globulare, assumendo la struttura nativastruttura nativa, che dipende comunque dalla disposizione degli amino-acidi nella catena primaria

La struttura nativa definisce la funzionalità della proteina

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La chimica stessa della catena principale di una proteina ne forza la forma fondamentalmente planare

Questi due legami permettono una rotazione circolare, dando origine agli angoli diedri ( e )Tutte le varie conformazioni in cui può ripiegarsi la proteina derivano da tali rotazioni


I soli segmenti “mobili” della catena principale sono i legami fra l’azoto ed il carbonio e tra il carbonio ed il carbonio carbonile

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La struttura secondaria La struttura secondaria 1 1

L’esame della struttura delle proteine conosciute rivela che esiste un piccolo numero di motivi strutturali locali comuniLa posizione e la direzione di tali motivi strutturali regolari definiscono la struttura secondariastruttura secondaria della proteinaLe strutture più comuni sono l’elica elica (che ha for-ma elicoidale simile ad una molla, 60°, 3.6 aminoacidi per giro) ed il foglietto foglietto (135°, 135°)

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La struttura secondaria La struttura secondaria 2 2

Foglietto Foglietto

elicaelica 52

Strutture terziaria e quaternariaStrutture terziaria e quaternaria

Le regioni di struttura secondaria di una proteina si impacchettano insieme e si combinano con altre regioni meno strutturate della catena principale a formare una figura tridimensionale che è chiama-ta struttura terziaria struttura terziaria della proteina

Spesso un enzima attivo è composto da due o più catene proteiche che si compongono insieme in un unico grande complesso, detto struttura struttura quaternariaquaternaria dell’enzima

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Le strutture proteicheLe strutture proteiche

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La natura dei legami chimiciLa natura dei legami chimici

Molto di ciò che noi consideriamo essenziale per la vita può essere ricondotto ad un insieme di rea-zioni chimiche ed alle caratteristiche degli enzimi che ne controllano la velocitàPer definizione, elementoelemento è ciò che non può essere ulteriormente ridotto attraverso reazioni chimiche

Gli elementi sono atomiatomi (dal greco àtomosàtomos: indivisibi-le, a [alfa privativo] e tométomé, divisione) singoli compo-sti da particelle subatomiche più piccole che posso-no essere separate solo tramite reazioni fisiche

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Esistono centinaia di particelle subatomiche, ma solo tre sono stabili e particolarmente importanti per la chimica degli organismi viventi:

neutronineutroni (1.71024 grammi, senza carica)

protoni protoni (1.71024 grammi, con carica positiva)

elettronielettroni (8.51028 grammi, con carica negativa)

Anatomia dell’atomo Anatomia dell’atomo 1 1

Il numero di protoni presenti nel nucleo determina il tipo di elemento (e definisce il numero numero atomicoatomico)

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Tavola periodica degli elementiTavola periodica degli elementi

Anatomia dell’atomo Anatomia dell’atomo 2 2Per ogni protone nel nucleo esiste un elettrone posto in un orbitaleorbitale relativamente lontano dal nucleo che ruota ad una velocità prossima a quella della luce

Grandi spazi vuoti all’interno dell’atomoGrandi spazi vuoti all’interno dell’atomo

Gli elettroni non hanno orbite prevedibili: l’orbitale è lo Gli elettroni non hanno orbite prevedibili: l’orbitale è lo spazio tridimensionale in cui l’elettrone passa il 90% del spazio tridimensionale in cui l’elettrone passa il 90% del suo temposuo tempo

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Anatomia dell’atomo Anatomia dell’atomo 3 3A livello atomico, l’energia è suddivisa in “pacchetti” di luce, i fotonifotoni: più l’elettrone si trova lontano dal nu-cleo, maggiore è la sua energia potenziale:

UkZe2/r

dove k è la costante di Coulomb Ze è la carica positiva contenuta nel nucleo (Z numero atomico) e r è la distanza dell’elettrone dal nucleoGli elettroni emettono luce quando passano da un orbitale più distante ad uno più prossimo al nucleo

La quantità di energia richiesta è un quantoquantoSi dice infatti che effettuano un salto quanticosalto quantico

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La valenza La valenza 1 1

Poiché le cariche negative degli elettroni fanno sì che si respingano, solo due elettroni possono con-dividere un orbitale ad un certo istante

Gli elettroni ad energia più bassa si trovano nell’orbitale (sferico) più vicino al nucleo, indicato con 1s1sIl secondo livello di elettroni è costituito da quattro or-bitali: un orbitale sferico 2s2s e tre orbitali “a manubrio” 2p2p…

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La valenza La valenza 3 3Le proprietà chimiche di un atomo dipendono dal suo guscio di elettroni più esterno

Mentre il numero di protoni nel nucleo non cambia durante una reazione chimica, la posizione relativa degli elettroni, e talvolta anche il loro numero, è variabile

Sebbene sia una regola fondamentale in Natura quella del bilanciamento delle cariche, vi è anche, tuttavia, la tendenza a mantenere gli orbitali atomici più esterni completamente pieni o completamente vuoti

Regola dell’ottetto:Regola dell’ottetto: Nella formazione di legami, ogni atomo tende, attraverso la cessione, l’acquisto o la messa in comune di elettroni, a raggiungere la configurazione elettronica dei gas nobili, corrispondente alla presenza di 8 elettroni negli orbitali s e p dello strato più esterno

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Queste due priorità, potenzialmente conflittuali, si risolvono permettendo agli orbitali di un atomo di sovrapporsi a quelli di altri atomiLa condivisione di elettroni, che deriva dalla so-vrapposizione degli orbitali, è alla base del legame legame covalente covalente

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La valenza La valenza 5 5Gli elementi, come l’elio (2He), che non presen-tano elettroni spaiati nell’orbitale più esterno, non sono chimicamente reattivi e non sono mai legati covalentemente ad altri atomiViceversa, atomi con valenze simili hanno pro-prietà chimiche simili (14Si, 6C)

Il numero di elettroni spaiati nell’orbitale più ester-no di un atomo, la sua valenzavalenza, rappresenta la sua capacità di legame (1H1, 8O2, 7N3, 6C4)

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c

Due esempi di legame covalente: Acqua (a) e Metano (b); nella molecola di Due esempi di legame covalente: Acqua (a) e Metano (b); nella molecola di acqua esiste un legame covalente fra due atomi di idrogeno ed uno di acqua esiste un legame covalente fra due atomi di idrogeno ed uno di ossigeno; nella molecola di metano, quattro atomi di idrogeno formano legami ossigeno; nella molecola di metano, quattro atomi di idrogeno formano legami covalenti con un solo atomo di carboniocovalenti con un solo atomo di carbonio

(b)(b)

(a)(a)

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La forma e la dimensione di un composto dipen-dono dalla valenza degli atomi da cui è formato

L’elettronegatività L’elettronegatività 1 1

L’elettronegativitàelettronegatività di un atomo è una funzione del numero di elettroni che l’atomo deve acquisire o donare per completare o svuotare gli orbitali più esterniPer esempio, sia 1H che 6C hanno lo shell di elettroni più esterno pieno per metà

Hanno uguale elettronegativitàNei legami covalenti tra idrogeno e carbonio gli atomi partecipano allo stesso modo

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La situazione è molto diversa nei legami con l’ossigeno; dato che 8O deve acquisire due elet-troni o perderne sei, esso è molto più elettro-negativo rispetto a idrogeno e carbonioGli elettroni coinvolti nei legami covalenti dell’ac-qua, per esempio, tendono a passare più tempo tendono a passare più tempo nelle vicinanze dell’atomo di ossigenonelle vicinanze dell’atomo di ossigenoI legami polari legami polari provocano pertanto una leggera separazione delle cariche, che rende l’ossigeno nell’H2O leggermente negativo e gli idrogeni leg-germente positivi

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La leggera separazione di cariche derivante dai legami polari genera una particolare interazione tra molecole, chiamata legame idrogenolegame idrogeno

Ogni molecola di acqua è debolmente associata ad una rete di altre molecole di acqua, perché le legge-re cariche positive degli idrogeni generano affinità con le leggere cariche negative degli atomi di ossi-geno posti nelle vicinanze

È richiesta molta meno energia per rompere un legame idrogeno che un legame covalente, dato che nel primo caso non vi è condivisione fra gli atomi

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I legami idrogenoI legami idrogeno

La molecola d’acqua (a) e l’interazione tra molecole tramite legami idrogeno (b)La molecola d’acqua (a) e l’interazione tra molecole tramite legami idrogeno (b)

(b)(b)

(a)(a)

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Idrofilicità e idrofobicità Idrofilicità e idrofobicità 1 1

I composti chimici possono essere divisi in due categorie, quelli che interagiscono e quelli che non interagiscono con l’acquaI composti idrofiliciidrofilici sono costituiti da molecole dotate di legami polari, capaci di formare legami idrogeno con l’acqua

Si disciolgono facilmente in soluzioni acquose

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I composti che hanno atomi legati solo da legami covalenti non polari sono detti idrofobiciidrofobici e non interagiscono con le molecole d’acqua

La loro presenza fisica induce le molecole dell’acqua ad interagire fra di loro e impedisce la compen-sazione delle loro cariche parzialiDi conseguenza, molecole come i grassi (con legami carboniocarbonio e carbonioidrogeno) sono esclu-se dalle soluzioni acquose e costrette ad associarsi le une con le altre (es. doppio strato lipidico che costituisce la membrana cellulare)

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Strumenti per la biologia molecolare Strumenti per la biologia molecolare 1 1

Il riconoscimento dell’informazione contenuta nel-la sequenza di DNA del genoma procariotico è molto più facile rispetto al compito equivalente sul più complesso genoma eucarioticoInoltre, negli eucarioti, il problema di identificare l’informazione che codifica una proteina è ulte-riormente complicato dal fatto che un introne in un particolare tipo di cellula può essere un esone in un’altraTuttavia… i problemi associati alla decifrazione del contenuto informativo del genoma non sono in-sormontabili quando si conoscono le “regole” utilizzate dalle cellule allo scopo 73


È compito della bioinformatica riconoscere/estrarre le regole dai patternpattern, che si osservano dall’enorme quantità di dati disponibiliSorprendentemente piccolo è invece il numero di stru-menti comunemente usati dai biologi molecolari per:

generare i dati grezzi necessari per tali analisi……verificare il significato biologico delle possibili re-gole estratte

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Sei principali tecniche di laboratorio definiscono l’intera disciplina della biologia molecolare:

Enzimi di restrizioneEnzimi di restrizione

Elettroforesi su gelElettroforesi su gel

Blotting e ibridazione, microarrayBlotting e ibridazione, microarray

ClonaggioClonaggio

Reazione a catena della polimerasi (PCR)Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Sequenziamento del DNASequenziamento del DNA

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Enzimi di restrizione Enzimi di restrizione 1 1

Il lavoro originale di Wilkinson, Watson e Crick (1953), che valse loro il Nobel nel 1962, spiegava come il DNA fungesse da materiale geneticoMa fu solo venti anni dopo che H. Smith et al. scoprirono gli enzimi di restrizioneenzimi di restrizione, che permisero di manipolare le molecole di DNA in modo spe-cifico per decifrare il loro contenuto informativo Nel corso dello studio sulla causa che portava alcune cellule batteriche a migliorare la propria difesa contro le infezioni virali, infatti, rilevarono che i batteri producevano degli enzimi capaci di rompere le molecole di DNA in corrispondenza di particolari stringhe di nucleotidi 76

Enzimi di restrizione Enzimi di restrizione 2 2Gli enzimi di restrizione possono essere isolati dalle cellule batteriche ed utilizzati come “forbici”, che permettono ai biologi di tagliare/incollare le molecole di DNA

Di solito le molecole di DNA a doppio filamento vengono scisse in modo da lasciare una breve sequenza di DNA a singolo filamento all’estremità di ogni frammentoTale sequenza è, per natura, complementare con la sequenza di qualunque altra estremità prodotta dallo stesso enzimaLe due sequenze hanno dunque terminazioni coesive terminazioni coesive o “appiccicoseappiccicose”, in grado di tenere insieme i due frammenti fino a che un altro speciale enzima, detto ligasiligasi, li ricongiunge in modo permanente, ricostruendo i legami fosfodiestere tagliati dall’enzima di restrizione 77


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Gli enzimi di restrizione possono dare origine an-che a terminazioni piatteterminazioni piatte, che si legano a moleco-le di DNA con uguali terminazioni

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Scinde la molecola di DNA tra i nucleotidi G ed A ogniqualvolta li incontra nella sequenza (che si verifi-ca in media ogni (1/4)61/4096 cop-pie di basi) 5’GAATTC3’ La stringa di nucleotidi riconosciuta da EcoRI è il suo sito di restrizionesito di restrizione

Provoca la terminazione coesiva 5’AATT3’, la cui sequenza com-plementare è 5’AATT3’

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EsempioEsempio EcoRI (Escherichia Coli batterio che vive nella parte infe-riore dell’intestino di animali a sangue caldo, Restrizione, I)


Comunque… tagliando una molecola di DNA e determinando l’ordine dei tagli (ottenuti con più enzimi) ed il numero di frammenti, si può comprendere la specifica organizzazione e sequenza della molecola mappe di restrizionemappe di restrizionecon gli enzimi di restrizione si possono isolare e manipolare sperimentalmente i singoli geni

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Elettroforesi su gel Elettroforesi su gel 1 1

Per genomi composti da milioni (come il genoma di E.coli) o da miliardi di coppie di basi (come il genoma umano), la scissione completa tramite enzimi di restrizione può fornire centinaia di migliaia di frammenti di DNAL’elettroforesielettroforesi su gel su gel di agarosioagarosio (o poliacrilammipoliacrilammi-dede) è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare tali frammenti

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L’elettroforesi su gel sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (la catena principale è carica negativamente, grazie alla presenza dei fosfati) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso il gel Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, che consentono di separare le mole-cole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi

si avrà una separazione in funzione della velocità

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Blotting ed ibridazione Blotting ed ibridazione 1 1

Individuare il singolo frammento di DNA che con-tiene uno specifico gene tra centinaia di migliaia di frammenti, anche se divisi per dimensione, è un compito impossibileL’ibridazioneibridazione è una tecnica che consente di verifi-care la complementarietà esistente tra due mole-cole di acidi nucleici in base alla loro omologia di sequenzaCiò è possibile perché le proteine a funzione biolo-gica fondamentale, come l’emoglobina, l’insulina, l’ormone per la crescita, hanno sequenze molto simili tra di loro in organismi filogeneticamente vicini 85


L’appaiamento di basi può avvenire tra due DNA, due RNA o un DNA ed un RNAIl principio della reazione consiste…

…nell’esporre l’una all’altra due preparazioni di acido nucleico a singolo filamento (di cui uno marcato radioattivamente) e, successivamente, nel visualizzare (autoradiogra-fia o colorazione) oppure misurare la quantità di materiale a doppio filamento che si è formato (quantificandone la radioattività incorporata)

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La tecnica di ibridazione su filtro o membranaibridazione su filtro o membrana, detta blottingblotting, è la più utilizzata per verificare la presenza di sequenze particolari (e quindi di geni) di diversa origine, provenienti ad esempio da un altro animale o da un’altra specieSi utilizzano a questo scopo delle sondesonde mole-colari, cioè frammenti di DNA che codificano per la proteina da analizzare

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La sonda viene marcata con un isotopo radioattivo e mescolata in soluzione, ed a temperatura prossima ai 100° (per ottenere la denaturazione dei 2 filamenti di DNA) con un filtro (nitrocellulosa o nylon) su cui è fissato un frammento di DNA che dovrebbe contenere la sequenza complementare

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Al termine della procedura di ibridazione, la sonda non legata viene lavata via e la membrana viene esaminata per vedere dove è avvenuto l’accoppia-mento tra la sonda e la sequenza bersaglioL’esposizione del filtro ad una lastra fotosensibile (o la colorazione) permetterà di rilevare una trac-cia che confermerà l’appaiamento, mentre se non sussiste omologia non avverrà nessuna ibrida-zione

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Blotting: ibridazione su membranaBlotting: ibridazione su membrana

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Microarray Microarray 1 1

Una variante del sistema di ibridazione mediante membrana è la tecnologia del microarraymicroarray, o chip a chip a DNADNA, o biochipbiochipIn questo caso, decine di migliaia di sequenze nucleotidiche vengono fissate una per una in una specifica posizione sulla superficie di un piccolo chip di silicioI microarray sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, che consiste nel fissare tutti i segmenti di DNA, detti probeprobe, su un supporto e nel marcare invece l’acido nucleico che vogliamo identificare, detto targettarget

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È una tecnica che è stata sviluppata negli anni ‘90 e oggi permette l’analisi dell’espressione genica monitorando in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni Sforzi computazionali significativi sono necessari sia per costruire i chip sia per interpretarne i risultati

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Clonaggio Clonaggio 1 1

Mentre per le cellule è normale estrarre infor-mazione dalle singole molecole di DNA, in biologia molecolare occorrono quantità di materiale da analizzare tali da essere quasi visibili a occhio nudo (molti milioni di molecole)

Invocare l’aiuto delle cellule nella generazione di sufficienti quantità di specifiche molecole di DNA

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Nel genoma di un organismo diploide, ad esempio in una cellula umana, un gene è presente in ge-nere in duplice copia, “diluito” in mezzo a moltis-sime altre sequenze di DNATramite il clonaggio molecolare clonaggio molecolare è possibile isolare un singolo gene o, più in generale, un frammento di DNA dal genoma di un organismo, e produrne molte copie identicheLa disponibilità di un gene in forma pura e in grande quantità ne consente lo studio a livello molecolare

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Il clonaggio coinvolge l’inserimento di frammenti specifici di DNA all’interno di trasportatori simili ai cromosomi, chiamati vettorivettori, che ne permettono la replicazione e l’isolamento all’interno di cellule viventiI primi vettori che furono utilizzati derivavano da virus batterici e da piccoli pezzi di DNA extra-cromosomale, detti plasmidiplasmidi, presenti nelle cellule procariotiche

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Tutti i vettori devono possedere le seguenti caratteristiche:

Disporre di una zona in cui può essere inserito il DNA esogeno (detta polylinkerpolylinker)Contenere le sequenze che permettono al vettore di replicarsi all’interno della cellula viventeContenere le sequenze che conferiscono alla cellula ospite la capacità di rilevarne la presenzaDimensioni e forma tali da permettere al vettore di essere separato dal DNA della cellula ospite

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Clonaggio Clonaggio 6 6Tutte le copie identiche dei frammenti, i cloni molecocloni moleco-larilari, possono essere utilizzate per uno studio immedia-to o conservate in librerie genomichelibrerie genomicheUna libreria genomica ideale dovrebbe contenere una copia per ogni segmento del DNA di un organismo

Il numero di cloni (dato dalla dimensione del genoma diviso la lunghezza media dei frammenti) definisce un equivalente genomicoequivalente genomico

EsempioEsempio: E.coli ha un genoma lungo 4.600.000 coppie di basi; se fosse completamente digerito da un enzima di restrizione come EcoRI, per la costruzione di una libreria genomica completa dovrebbe essere clonato ogni fram-mento di DNA, su un totale di più di 1000 frammenti di lunghezza media pari a 4.096 coppie di basi

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Sfortunatamente, però, la libreria non può essere costruita con una semplice digestione del DNA genomico di una singola cellula e quindi con la costruzione di cloni per ogni frammentoIl processo di clonaggio non è efficiente e di solito è necessario raccogliere DNA da migliaia di cellule per clonarne un singolo frammentoInoltre, la natura casuale del processo di clona-zione fa sì che qualche frammento venga clonato più volte, mentre altri non sono rappresentati nell’equivalente genomico

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Aumentare il numero di cloni in una libreria geno-mica equivale ad aumentare la probabilità che essa possa contenere almeno una copia di ogni segmento di DNAUna libreria genomica contenente da quattro a cinque equivalenti genomici ha, in media,

da quattro a cinque copie di ogni frammento di DNA il 95% di probabilità di contenere almeno una copia di ogni porzione del genoma dell’organismo

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Implicazioni pratiche:I vettori che permettono il clonaggio di lunghi frammenti di DNA sono i migliori per la realiz-zazione di librerie genomiche, perché richiedono pochi cloni per realizzare l’equivalente genomicoIl clonaggio dell’ultimo 5% di un genoma è spesso un’operazione difficile quanto il clonaggio del primo 95%

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Alternativa:Alternativa: libreria di cDNAlibreria di cDNALa porzione di genoma di maggior interesse è quella che corrisponde alle regioni che codificano per le proteine, che vengono quindi trascritte preventiva-mente in mRNAGli mRNA possono essere separati dagli altri poli-nucleotidi presenti nella cellula tramite un enzima, la trascrittasi inversatrascrittasi inversa, che converte le sequenze di mRNA in DNA complementare (cDNA) e quindi clona i cDNA come parte di una libreriaTuttavia… si perde il contenuto genomico relativo a sequenze regolatrici, introni, etc.

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Reazione a catena della polimerasi Reazione a catena della polimerasi 1 1

La tecnica della reazione a catena della polimerasi reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction, PCRPCR, K. Mullis, 1985) ha rivoluzionato le metodiche dell’ingegneria genetica, offrendo uno strumento straordinaria-mente potente nell’amplificare in vitro e in poco tempo particolari sequenze di DNAQuesta tecnica consente di ottenere centinaia di migliaia di copie del DNA di interesse per succes-sive caratterizzazioni (determinazione della lun-ghezza, della sequenza nucleotidica, etc.) senza dover ricorrere ai comuni metodi di clonaggio né all’uso di enzimi di restrizione

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La PCR sfrutta la reazione di sintesi in vitro del DNA, reazione catalizzata dalla DNA polimerasi DNA polimerasi Questo enzima richiede per il suo funzionamento uno stampo (templatetemplate), rappresentato da un fila-mento di DNA a cui deve trovarsi appaiato un primerprimer, che funge da innesco per la replicazione del DNA I primer sono necessari perché molte DNA poli-merasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento “ex novo”, ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento preesistente

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La PCR si basa sull’uso di due primer di lunghez-za pari a 1820 nucleotidi, che sono disegnati in modo da essere esattamente complementari alle corrispondenti sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da amplificareI due primer sono diretti in direzione opposta ma convergente e definiscono le estremità del futuro prodotto dell’amplificazioneL’attività della DNA polimerasi determinerà la sintesi di nuovi filamenti a partire da ciascun primer

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La reazione è divisa in tre stadi, ciascuno condotto ad una tempe-ratura diversa

denaturazionedenaturazione (94°C) per separare i due filamenti della molecola stampo

annealingannealing (5060°C) durante la qua-le i primer si appaiano ai filamenti denaturati, determinando il punto di innesco della sintesi di DNA

polimerizzazionepolimerizzazione (estensioneestensione, allunallun-gamentogamento, 72°C)

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Il ciclo di denaturazioneappaiamentoestensione viene ripetuto 2030 volte in modo tale da otte-nere una grande amplificazione del DNA compreso nella regione di appaiamento dei due primerI primi prodotti “di buona qualità” di PCR si formano a partire dal terzo ciclo e si accumulano con un andamento di tipo esponenziale (N2n2, dove N è il numero di molecole di partenza e n il numero di cicli di amplificazione)

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Le molecole di DNA amplificate sono prodotte molto più velocemente ed efficacemente rispetto a quelle ottenibili dai cloniIl maggior vantaggio della PCR, tuttavia, consiste nel poter iniziare con quantità di materiale (come quelle tipicamente associate a campioni prove-nienti da musei, o fossili o forensi) molto minori di quanto non siano solitamente disponibili (e neces-sarie) negli esperimenti di clonaggio

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Sequenziamento del DNA Sequenziamento del DNA 1 1

Il termine sequenziamentosequenziamento indica il processo per la determinazione della struttura primaria esatta di un biopolimero (una macromolecola), cioè del-l’ordine delle basi nel caso di un acido nucleico, o degli aminoacidi nel caso delle proteineLa caratterizzazione molecolare finale di un fram-mento di DNA consiste, infatti, nella determina-zione dell’ordine, o sequenza, dei suoi nucleotidi

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Tutte le strategie di sequenziamento del DNA comprendono tre passi1) Generazione di un insieme completo di sottofram-

menti della regione in esame, che differiscono l’uno dall’altro per un singolo nucleotide

2) Marcatura di ogni frammento con una delle quattro differenti etichette (tagtag) che dipendono dal nucleo-tide posto al termine del frammento

3) Separazione dei frammenti sulla base delle loro di-mensioni (mediante elettroforesi su gel) per leg-gere la sequenza in base al riconoscimento del-l’ordine in cui sono posti i diversi tag

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Metodo di A. M. Maxam e W. Gilbert (1977): degradazione chimica del DNAdegradazione chimica del DNAMetodo di F. Sanger (1978): a terminazione di a terminazione di catenacatena

Hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base

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Metodo di Maxam e GilbertMetodo di Maxam e GilbertBasato sulla degradazione chimica di frammenti di DNA, è ormai poco utilizzato perché impiega com-posti chimici dannosi alla salute e perché non adat-to al sequenziamento automaticoSi differenzia dal metodo di Sanger perché non uti-lizza sintesi enzimatiche, ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidiÈ basato sull’abilità di alcuni composti chimici idrazina, N2H4, acido formico, HCOOH, dimetilsolato, (CH3)2SO4 di modificare in modo specifico le basi all’interno del DNA e di altri piperidina, (CH2)5NH di catalizzare la rottura del filamento di DNA a li-vello dei nucleotidi modificati

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Metodo di SangerMetodo di SangerIl sottogruppo di frammenti necessari per il sequen-ziamento è generato attraverso l’incorporazione di nucleotidi modificati che impediscono l’aggiunta di ulteriori basi alla catena da parte della DNA polimerasiTali nucleotidi differiscono dalla loro controparte standard per la mancanza del gruppo idrossile alla terminazione 3’, a cui dovrebbe attaccarsi il nucleo-tide successivo in un normale frammento di DNA che cresce

Sono dotati di tag (colorante fluorescente) per individuarli quando vengono frazionati per dimensione

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Il paradosso del valore C Il paradosso del valore C 1 1

Nel 1948 fu scoperto che la quantità di DNA all’interno di ogni cellula di uno stesso organismo è la stessaTale quantità è detta valore Cvalore C, termine coniato nel 1950 da Henson Swift“Sono spiacente per il fatto che la lettera C non stia per nulla di più emozionante di costantecostante, con riferimento ad esempio all’ammontare del DNA caratteristico di un parti-colare genotipo” (H. Swift a Michael Bennett)

È interessante notare che, mentre la grandezza del genoma di una specie è costante, si osservano forti variazioni tra le varie specie, ma senza una correlazione con la complessità dell’organismo

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L’assenza di correlazione tra la complessità e la dimensione del genoma origina il paradosso del paradosso del valore Cvalore CLa quantità totale di DNA spesso differisce di un fattore maggiore di cento tra specie molto similiL’implicazione chiara ma difficile da provare è che una lunga porzione di DNA presente in alcuni organismi è in eccesso e, apparentemente, non fornisce un contributo significativo alla comples-sità dell’organismo

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Cinetica di riassociazione Cinetica di riassociazione 1 1

Quando i filamenti complementari della doppia catena di DNA sono separati, o denaturati, per mezzo del calore o di trattamenti alcalini, possono facilmente rinaturarsi nella struttura a doppio fila-mento quando le condizioni all’interno della cellula tornano alla normalitàSi può comprendere qualcosa della struttura di un genoma dal modo in cui si riforma il DNA dena-turato

Più una sequenza genomica è unica, maggiore sarà il tempo necessario affinché ogni filamento trovi e ibridizzi con il suo filamento complementare

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Britten e Kohne, nel 1968, hanno descritto l’equaequa-zionezione cotcot che definisce la cinetica di riassociazione del DNA nella forma:

c/c0=1/(1+kc0t)

dove c è la concentrazione di DNA a singolo fila-mento al tempo t (c0 concentrazione iniziale) e k è una costante (dipendente dalla concentrazione di cationi, dalla temperatura, dalla dimensione del frammento e dalla complessità della sequenza nucleotidica)

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L’equazione cot equazione cot stabilisce una relazione di propor-zionalità inversa fra la frazione rimanente di DNA a singolo filamento e c0t

Da tale equazione si può ricavare per ogni organismo uno specifico valore c0t1/2, che è diretta-mente proporzionale al numero di nucleotidi delle sequenze non ripetutePertanto, la misura del tempo t1/2 richiesto da me-tà dei singoli filamenti di DNA per rinaturarsi (c/c00.5) permette la determinazione sperimentale della quantità totale di informazione genetica uni-ca codificata in un genoma

121


Dato che c0t1/2 è il prodotto tra la concentrazione ed il tempo necessario per la rinaturazione di me-tà della quantità totale di DNA, un valore grande di c0t1/2 implica una reazione lenta e riflette la si-tuazione in cui ci sono poche copie di una parti-colare sequenza dentro una data massa di DNAIl valore c0t1/2 è una misura della lunghezza totale di sequenze diverse all’interno del genoma e “ne descrive la complessità”

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Mentre il valore C non è in generale indicativo della complessità di un organismo, il valore c0t1/2 solitamente lo èLa disparità fra i due valori di solito indica la presenza di copie multiple di sequenze di DNA inutili, chiamate junk DNAjunk DNASequenze ripetute all’interno del DNA spazzatura differiscono molto in termini di complessità (da uno o due a migliaia di nucleotidi) e distribuzione (raggruppamenti locali o casuale sparsità) all’in-terno del genoma

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Concludendo… Concludendo… 1 1

Il DNA è la molecola che contiene l’informazione conservata all’interno della cellulaL’ordine specifico dei quattro differenti nucleotidi è trascritto dalla RNA polimerasi in mRNA, che viene tradotto in proteinePer costruire le proteine vengono utilizzati venti diversi aminoacidi e l’ordine e la composizione specifica di questi “mattoni” giocano un ruolo importante nella costruzione e nel mantenimento della struttura e della funzione delle proteine

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Concludendo… Concludendo… 2 2I biologi molecolari hanno a disposizione un numero piuttosto limitato di strumenti per studiare il DNA e l’informazione contenuta al suo interno

Gli enzimi di restrizione tagliano la molecola di DNA quando riconoscono una determinata stringa di nucleotidiL’elettroforesi permette la separazione dei frammenti di DNA in base alla loro lunghezza ed alla loro caricaLe tecniche di blotting e ibrididazione garantiscono il reperi-mento di specifici frammenti di DNA in una misturaIl clonaggio permette la propagazione di sequenze specifiche, per un utilizzo ripetutoLa PCR garantisce una rapida amplificazione e caratterizzazione di specifici frammenti di DNAIl sequenziamento, infine, determina l’ordine dei nucleotidi, garantendo la caratterizzazione della molecola di DNA

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Concludendo… Concludendo… 3 3

La cinetica di riassociazione ha rivelato che il contenuto di DNA di una cellula, il suo valore C, non sempre corrisponde direttamente al contenu-to informativo di un organismo

Negli organismi complessi vi sono ampie zone di DNA spazzatura

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Biologia Molecolare e Biochimica Monica Bianchini Dipartimento di Ingegneria dellInformazione e...

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