BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Capítulo 18 · 2015. 5. 9. · McGraw-Hill Interamericana Editores...

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McGraw-Hill Interamericana Editores Todos los derechos reservados. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular Técnicas en biología celular y molecular Capítulo 18 18.1 El microscopio óptico 18.2 Microscopia electrónica de transmisión 18.3 Microscopia electrónica de barrido y microscopia de fuerza atómica 18.4 Uso de radioisótopos 18.5 Cultivo celular 18.6 Fraccionamiento del contenido de una célula mediante centrifugación diferencial 18.7 Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas 18.8 Identificación de la estructura de proteínas y complejos multisubunitarios 18.9 Fraccionamiento de ácidos nucleicos 18.10 Hibridación de ácido nucleico 18.11 Síntesis química de DNA 18.12 Tecnología de DNA recombinante 18.13 Amplificación enzimática de DNA por PCR 18.14 Secuenciación de DNA 18.15 Genotecas de DNA 18.16 Transferencia de DNA a células eucariotas y embriones de mamífero 18.17 Determinación de la función de los genes eucariotas por eliminación o desactivación (silenciamiento) génica 18.18 Uso de anticuerpos

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Técnicas en biología celular y molecular

Capítulo 18

18.1 El microscopio óptico 18.2 Microscopia electrónica de transmisión 18.3 Microscopia electrónica de barrido y microscopia de fuerza atómica 18.4 Uso de radioisótopos 18.5 Cultivo celular 18.6 Fraccionamiento del contenido de una célula mediante centrifugación

diferencial 18.7 Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas 18.8 Identificación de la estructura de proteínas y complejos multisubunitarios 18.9 Fraccionamiento de ácidos nucleicos 18.10 Hibridación de ácido nucleico 18.11 Síntesis química de DNA 18.12 Tecnología de DNA recombinante 18.13 Amplificación enzimática de DNA por PCR 18.14 Secuenciación de DNA 18.15 Genotecas de DNA 18.16 Transferencia de DNA a células eucariotas y embriones

de mamífero 18.17 Determinación de la función de los genes eucariotas

por eliminación o desactivación (silenciamiento) génica

18.18 Uso de anticuerpos

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Figura 18.1 Diagrama de un corte a través de un microscopio óptico compuesto, es decir, un microscopio que tiene lentes tanto de objetivo como oculares.

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Figura 18.2 Trayectos que siguen los rayos de luz que forman la imagen de la muestra y los que forman la luz de fondo del campo. Los rayos de luz de la muestra se enfocan en la retina, mientras que los rayos del fondo están fuera de foco, con lo que se produce un campo brillante difuso. Como se explica en el texto, el poder de resolución de una lente del objetivo es proporcional al seno del ángulo α. Las lentes con mayor poder de resolución tienen longitudes focales más cortas, lo que significa que la muestra se sitúa más cerca de la lente del objetivo cuando se enfoca.

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Figura 18.3 Magnificación contra resolución. La transición de (a) a (b) proporciona al observador una mayor magnificación y resolución, mientras que la transición de (b) a (c) sólo produce una mayor magnificación (magnificación vacía). De hecho la calidad de la imagen se deteriora conforme la magnificación vacía aumenta.

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Figura 18.4 El poder de resolución del ojo. Ilustración de la relación entre la estimulación de los fotorreceptores individuales (izquierda) y la imagen que se percibiría (derecha). El diagrama ilustra el valor de que la imagen caiga en un área lo bastante grande de la retina.

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Figura 18.5 La tinción de Feulgen. Este procedimiento de tinción es específico para el DNA, como lo indica la localización del pigmento en los cromosomas en esta célula de la punta de la raíz de cebolla que estaba en la metafase de la mitosis al momento que se fijó. (Por Ed Reschke.)

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Figura 18.6 Comparación de células vistas con diferentes tipos de microscopios ópticos. Micrografías ópticas de un protista ciliado tal como se observa en un campo brillante (a), con contraste de fase (b) y con óptica de contraste por interferencia diferencial (DIC) (o de Nomarski) (c). El organismo apenas es visible con la iluminación de campo brillante, pero se ve con claridad en la microscopia con contraste de fase y con DIC. (Micrografías por M.I. Walker/ Photo Researchers, Inc.)

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Figura 18.7 Uso de variantes de GFP para seguir las interacciones dinámicas entre neuronas y sus células blanco in vivo. (a) Porción de cerebro de un ratón con dos neuronas fluorescentes de colores diferentes. Los ratones se obtienen mediante el apareamiento de animales transgénicos cuyas neuronas se marcan con una u otra proteína fluorescente. (b) Micrografía con fluorescencia de porciones de dos neuronas, una marcada con YFP y otra marcada con CFP. Las flechas indican dos uniones neuromusculares distintas en dos fibras musculares diferentes en las que la rama axonal marcada con YFP venció a la rama marcada con CFP. La tercera unión está inervada con el axón marcado con CFP en ausencia de competencia. (a: Cortesía de N. Kasthuri y J. W. Lichtman, Washington University School of Medicine; b: reimpresa con autorización de Narayanan Kasthrui y Jeff W. Lichtman, Nature 424:429, 2003, fig. 4a.Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd.)

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Figura 18.8 Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Este esquema muestra un ejemplo del uso de la tecnología FRET para seguir el cambio en la conformación de una proteína (PKG) después de la unión con cGMP. Las dos proteínas pequeñas fluorescentes con forma de barril [CFP intensificada (ECFP) y YFP intensificada (EYFP)], se muestran en su color fluorescente. En ausencia de cGMP, la excitación de ECFP con luz de 440 nm produjo la emisión de luz de 480 nm de la proteína fluorescente. Después de la unión con cGMP, un cambio en la conformación en PKG aproxima lo suficiente las dos proteínas fluorescentes para que la FRET ocurra. Como resultado, la excitación del donador de ECFP con luz de 440 nm produce la transferencia de energía al receptor de EYFP y la emisión de luz de 535 nm del receptor. Las versiones intensificadas de estas proteínas tienen mayor intensidad de fluorescencia y tienden a ser más estables que las moléculas proteínicas originales. (Tomada de Moritoshi Sato y Yoshio Umezawa, Analytical Chemistry 72:5924, 2000. © 2000 American Chemical Society.)

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Figura 18.9 Microscopia de fluorescencia confocal con exploración láser. (a) Los trayectos de la luz en un microscopio de fluorescencia confocal. La luz de longitud de onda corta (azul) proviene de una fuente láser, pasa por una abertura diminuta y se refleja en un espejo dicroico (un tipo de espejo que refleja ciertas longitudes de onda y transmite otras) hacia una lente del objetivo y se enfoca en una mancha en el plano de la muestra. Los fluorocromos de la muestra absorben la luz incidente y emiten luz de mayor longitud de onda, la cual puede pasar por el espejo dicroico y enfocarse en un plano que contiene una abertura puntual. Luego, la luz pasa a un tubo fotomultiplicador que amplifica la señal y la transmite a una computadora, la cual forma una imagen procesada digitalizada. Cualquier rayo de luz emitido por arriba o debajo del plano óptico de la muestra no pasa por la abertura diminuta, por lo que no contribuye a la formación de la imagen. Este diagrama muestra la iluminación de un solo punto en la muestra. Distintos sitios de la muestra se iluminan mediante un proceso de barrido con láser. El diámetro de la abertura puntual es ajustable. Mientras menor sea la abertura, es más delgado el corte óptico y mayor la resolución, pero la señal es menos intensa.

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Figura 18.9 Microscopia de fluorescencia confocal con exploración láser. (Continuación) (b) Micrografías con fluorescencia confocal de tres cortes ópticos separados, cada uno de 0.3 μm de grosor, de un núcleo de levadura teñido con dos anticuerpos con marca fluorescente distinta. El anticuerpo fluorescente rojo tiñó el DNA dentro del núcleo y el anticuerpo fluorescente verde tiñó una proteína de unión con el telómero que se localiza en la periferia del núcleo. (a: tomada de Thierry Laroche y Susan M. Gasser, Cell 75:543, 1993, Cell por Cell Press. Reimpresa con autorización de Cell Press en el formato de reproducción como libro de texto, vía copyright Clearance Center.)

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Figura 18.10 Superación del límite de resolución del microscopio óptico. (a) Micrografía de fluorescencia convencional de una porción de una célula cultivada de mamífero con microtúbulos marcados en verde y las vesículas cubiertas con clatrina en rojo. Con este nivel de magnificación, la imagen se ve difusa. Además, la superposición entre las dos marcas fluorescentes produce un color naranja, que sugiere que ambas estructuras están interconectadas. (b) Micrografía STORM de “súper resolución” de un campo similar que muestra los microtúbulos y las vesículas cubiertas con clatrina con buena resolución y separados entre sí. (c) Vista magnificada de una porción de la imagen b. (Los comentarios de esta técnica de súper resolución y otras más se localizan en Nature 459:638, 2009; Ann, Rev. Biochem. 78:993, 2009; Cell 143:1047, 2010; J. Cell Biol. 190:165, 2010; y J. Cell Sci. 124: 1607, 2011.) (Tomada de Mark Bates et al., cortesía de Xiaowei Zhuang, Science 317:1752, 2007; © 2007. Reimpresa con autorización de AAAS.)

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Figura 18.11 Comparación entre la información obtenida en las imágenes tomadas con un microscopio óptico y uno electrónico con una magnificación comparable de 4 500 veces el tamaño real. (a) Fotografía del tejido muscular esquelético que se impregnó en plástico, se cortó a 1 μm y se fotografió con un microscopio óptico con una lente del objetivo para aceite de inmersión. (b) Corte adyacente al empleado para la parte a que se cortó a 0.025 μm y se examinó al microscopio electrónico con una magnificación comparable a la imagen en a. La imagen resultante presenta un aumento de dos a uno en la resolución. Nótese la diferencia en los detalles de las miofibrillas musculares, las mitocondrias y el eritrocito contenido en el capilar. Mientras que el microscopio óptico no puede proporcionar ninguna información adicional a la de a, es posible que el microscopio electrónico brinde mucha más información; por ejemplo, puede producir imágenes de la estructura de membranas individuales dentro de una pequeña porción de una de las mitocondrias (como en la fig. 5.22). (Cortesía de Douglas E. Kelly y M. A. Cahill.)

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Figura 18.12 Comparación del sistema de lentes de un microscopio óptico y uno electrónico. (Reimpresa con autorización de Alan W. Agar, Principles and Practice of Electron Microscope Operation, Elsevier/North-Holland, 1974. Con autorización de Elsevier Ltd.)

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Figura 18.13 Preparación de una muestra para observación en el microscopio electrónico.

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Figura 18.14 Ejemplos de muestras con tinción negativa y sombras metálicas. Micrografía electrónica de un virus cascabel de tabaco después de la tinción negativa con fosfotungstato de potasio (a) o proyección de sombra con cromo (b). (Cortesía de M. K. Corbett.)

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Figura 18.15 Procedimiento utilizado para la proyección de sombras por medio de contraste en el microscopio electrónico. A menudo este procedimiento se emplea para visualizar partículas pequeñas, como los virus que se muestran en la figura previa. Con frecuencia las moléculas de DNA y RNA se hacen visibles por una modificación de este procedimiento que se conoce como formación de sombras rotatorias, en el que el metal se evapora en un ángulo muy bajo mientras se gira la muestra.

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Figura 18.16 Procedimiento para la formación de réplicas por criofractura como se describe en el texto. El procedimiento de congelación y grabado es un paso opcional en el que una capa delgada de hielo que cubre la muestra se evapora para revelar información adicional de la estructura de la superficie de la muestra fracturada.

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Figura 18.17 Réplica de una célula de raíz de cebolla por criofratura que muestra la envoltura nuclear (N.E.) con sus poros nucleares (N.P.), el aparato de Golgi (G), una vacuola citoplásmica (V) y la pared celular (C.W.). (Cortesía de Daniel Branton, Harvard University.)

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Figura 18.18 Grabado profundo. Micrografía electrónica de axonemas ciliares del protozoario Tetrahymena. Los axonemas se fijaron, congelaron y fracturaron, el agua congelada de la superficie del bloque fracturado se evaporó, lo que dejó una porción de los axonemas en relieve, tal como se visualiza en esta réplica metálica. La flecha indica una hilera distintiva de brazos de dineína. (Tomada de Ursula W. Goodenough y John E. Heuser, J. Cell Biol. 95:800, 1982, fig. 3, fotografía de la derecha. Reimpresa con autorización de the Rockefeller University Press.)

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Figura 18.19 Microscopia electrónica de barrido. Micrografías electrónicas de barrido de (a) un bacteriófago T4 (X275 000) y (b) la cabeza de un insecto (X40). (a: tomada de A.N. Broers, B.J. Panessa, y J.F. Gennaro, Science 189:635, 1975; © 1975. Reimpresa con permiso de AAAS; b: por cortesía de H.F. Howden y L.E.C. Ling.)

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Figura 18.20 Microscopia de fuerza atómica de alta velocidad. El esquema señala los elementos básicos de HS-AFM. El operador “coloca” la muestra en un componente (el piezoactuador) unido a la platina del microscopio (no se muestra). Las señales provenientes del actuador hacen que el segmento voladizo oscile hacia arriba y abajo, de modo que de manera intermitente el extremo del AFM contacta la muestra a medida que rastrea la superficie de ella. Las fuerzas que surgen entre la muestra y el extremo del AFM originan deflexiones del extremo, que son detectadas por un haz láser que es reflejado fuera de la superficie trasera del extremo del AFM. Los movimientos de la posición del rayo láser, que reflejan diferencias topográficas en toda la superficie de la muestra, son identificados por un detector de posición, y tal información se utiliza para “elaborar” una imagen de la muestra. La sucesión de imágenes basadas en AFM, propias del movimiento de la molécula de miosina V que se señala en la figura 9.52 fue “filmada” a razón de 7 cuadros por segundo. (Tomada de C. Veigel y C.P. Schmidt, Nature Revs. Mol. Cell Biol. 12:166, 2011; copyright 2011. Nature Reviews Molecular Cell Biology by Nature Publishing Group. Reimpreso con autorización de Nature Publishing Group en el formato de reproducción como libro de texto de copyright Clearance Center.)

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Figura 18.21 Pasos seguidos durante la realización de una autoradiografía con microscopio corriente.

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Figura 18.22 Comparación de la morfología de células que crecen en cultivos 2D y en cultivos 3D. (a) Fibroblasto humano que crece en un sustrato plano cubierto con fibronectina en un cultivo 2D asume una forma muy aplanada con lamelipodios anchos. Las adhesiones que contienen integrina se ven blancas. (b) El mismo tipo de célula cultivada en una matriz 3D asume una conformación fusiforme no aplanada. La matriz de fibronectina extracelular aparece en azul. La barra equivale a 10 μm. (Tomada de Edna Cukierman, Cell 130:603, 2007, fig. 1, reimpresa con autorización de Elsevier. Por cortesía de Kenneth M. Yamada, National Institute of Dental and Craniofacial Research, Nih.)

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Figura 18.23 Purificación de fracciones subcelulares por centrifugación de equilibrio con gradiente de densidad. En este ejemplo particular, el medio se compone de un gradiente de densidad continuo de sacarosa y los distintos organelos se sedimentan hasta que llegan a un sitio en el tubo igual a su propia densidad, donde forman bandas. La pastilla de 20 000 g se obtiene como se muestra en la figura 8.5.

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Figura 18.24 Cromatografía por intercambio iónico. Separación de dos proteínas mediante DEAE-celulosa. En este caso, una resina de intercambio con carga positiva se usa para unirse con la proteína con mayor carga negativa.

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Figura 18.25 Cromatografía de filtración en gel. Separación de tres proteínas globulares con diferente masa molecular, como se describe en el texto. Entre las proteínas con forma básica similar, las moléculas más grandes se eliminan antes que las pequeñas.

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Figura 18.26 Cromatografía por afinidad. (a) Representación esquemática de las perlas de agarosa cubiertas con las que sólo puede combinarse una proteína específica. (b) Pasos del procedimiento cromatográfico.

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Figura 18.27 Uso del sistema de dos híbridos de levaduras. Esta prueba para la interacción entre dos proteínas depende de que una célula sea capaz de reunir dos partes de un factor de transcripción. (a) Las dos partes del factor de transcripción (el dominio para unión con DNA y el dominio de activación), se ven aquí conforme el factor de transcripción se une con el promotor de un gen (lacZ) que codifica la galactosidasa β. (b) En este caso, una célula de levadura sintetizó el dominio para unión con DNA del factor de transcripción unido con una proteína X “carnada”. Este complejo no puede activar la transcripción. (c) En este caso, una célula de levadura sintetizó el dominio de activación del factor de transcripción unido con una proteína Y desconocida “pescada”. Este complejo no puede activar la transcripción. (d) Una célula de levadura sintetizó las proteínas X y Y, lo que reconstituye un factor de transcripción completo y permite la expresión de lacZ, que es fácil de detectar. (e) Si el segundo DNA codificó una proteína, por ejemplo, Z, que no pudo unirse con X, la expresión del gen reportero no se habría detectado.

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Figura 18.28 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Las muestras de proteína suelen disolverse en una solución de sacarosa cuya densidad impide que la muestra se mezcle con el amortiguador y luego se carga en los pozos con una pipeta fina como se muestra en el paso 1. En el paso 2 se aplica una corriente directa al gel, lo que ocasiona que las proteínas se muevan en la poliacrilamida en carriles paralelos. Cuando se realiza en el detergente SDS, como casi siempre sucede, las proteínas se mueven como bandas a velocidades inversamente proporcionales a su masa molecular. Una vez que la electroforesis se completa, el gel se retira del marco de vidrio y se tiñe en una charola (paso 3).

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Figura 18.29 Electroforesis bidimensional en gel. Gel de poliacrilamida bidimensional de proteínas cromosómicas no histonas de la célula HeLa marcadas con [35S]metionina. Con esta técnica pueden resolverse más de mil proteínas diferentes. (Tomada de J. L. Peterson y E. H. McConkey, J. Biol. Chem. 251:550, 1976. © 1976 The american Society for Biochemistry and Molecular Biology.)

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Figura 18.30 Principios de operación de un espectrómetro de masa. (Tomada de J. E. Brady, J. Russell y J. R. Holum, Chemistry 3era. ed.; copyright © 2000, John Wiley and Sons, Inc. Reimpresa con autorización de John Wiley and Sons, Inc.)

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Figura 18.31 Análisis por difracción de rayos X. Diagrama de la difracción de rayos X por átomos de un plano de un cristal en una placa fotográfica. La serie ordenada de los rayos dentro del cristal produce una serie repetitiva de ondas circulares superpuestas que se dispersan e intersectan la película. Como sucede con la difracción de la luz visible, las ondas forman un patrón de interferencia que refuerzan unas a otras en algunos puntos de la película y se cancelan entre sí en otros puntos.

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Figura 18.32 Distribución de densidad electrónica de una pequeña molécula orgánica (dicetopiperacina) calculada con varios niveles de resolución. Con la resolución más baja (a) sólo puede distinguirse la naturaleza anular, mientras que la resolución más alta (d) revela la densidad electrónica alrededor de cada átomo (indicada por las líneas de contorno circular). (Modificada de D. Hodgkin. Reimpresa con autorización de Nature 188:445, 1960; copyright 1960, Nature by Nature Publishing Group. Reimpresa con autorización de Nature Publishing Group en el formato de reproducción como libro de texto, de copyright Clearance Center.)

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Figura 18.33 La combinación de datos de microscopia electrónica y cristalografía de rayos X proporciona información sobre inter acciones entre proteínas y sobre la estructura de complejos multisubunitarios. La reconstrucción basada en micrografías electrónicas de un filamento de actina-ADF se muestra en gris. Las estructuras obtenidas por cristalografía de rayos X de alta resolución de monómeros individuales de actina (rojo) y moléculas de ADF (verde) se ajustaron en la estructura determinada por EM, con menor resolución. (Tomada de Edward H. Egelman, University of Virginia, J. Cell Biol. 163:1059, 2003 fig. 2a. Reimpresa con autorización de the Rockefeller University Press.)

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Figura 18.34 Separación de fragmentos de restricción de DNA por electroforesis en gel. (a) El DNA se incuba con una enzima de restricción, que lo corta en fragmentos (pág. 764). La mezcla de fragmentos se introduce en una ranura o foso en una placa de agarosa y se aplica corriente eléctrica. Las moléculas de DNA con carga negativa emigran hacia el electrodo positivo y se separan por tamaño. (b) Todos los fragmentos de DNA que están presentes en un gel pueden revelarse mediante la inmersión del gel en una solución de bromuro de etidio para luego observar el gel con luz ultravioleta. (B:Phillipe Plailly/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)

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Figura 18.35 Técnicas de sedimentación de ácido nucleico. (a) Separación de moléculas de DNA de diferente tamaño por la velocidad de sedimentación. El gradiente de densidad de la sacarosa se establece dentro del tubo (paso 1) al permitir que una solución de sacarosa de concentración cada vez mayor drene por la pared del tubo. Una vez que el gradiente se forma, la muestra se coloca con cuidado en la parte alta del gradiente (pasos 2 y 3), y el tubo se somete a centrifugación (p. ej., 50 000 rpm durante 5 h) como se ilustra en el paso 4. Las moléculas de DNA se separan con base en su tamaño (paso 5). (b) Separación de las moléculas de DNA por sedimentación de equilibrio con base en las diferencias en la composición. La muestra de DNA se mezcla con la solución de CsCl (paso 1) y se somete a centrifugación prolongada (p. ej., 50 000 rpm durante 72 h). El gradiente de CsCl se forma durante la centrifugación (paso 2) y las moléculas de DNA forman bandas en regiones de densidad equivalente (paso 3).

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Figura 18.35 Técnicas de sedimentación de ácido nucleico. (Continuación) (c) El tubo del experimento b se punciona y se permite que el contenido gotee a tubos sucesivos, lo que fracciona el contenido del tubo. Se mide la absorbancia de la solución en cada fracción y se grafica como se muestra.

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Figura 18.36 Identificación de la localización de fragmentos de DNA específicos en un gel por el método Southern blot. Como se describe en la figura, los fragmentos fraccionados de DNA se desnaturalizan y transfieren a una membrana de nitrocelulosa, que se incuba con sondas de DNA (o RNA) con marca radiactiva o fluorescente. El sitio de los fragmentos hibridados se conoce autoradiográficamente (o con microscopia si las sondas fueron marcadas con tinción fluorescente). Durante el procedimiento de transferencia (blotting), la acción capilar atrae el amortiguador hacia arriba a las toallas de papel. Conforme el amortiguador se mueve por el gel electroforético, disuelve los fragmentos de DNA y los transfiere a la superficie de la membrana adyacente.

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Figura 18.37 Construcción de un mapa de restricción del genoma circular pequeño del virus tumoral de DNA del polioma. (a) Autorradiografías de fragmentos de DNA marcados con 32P que se sometieron a electroforesis en gel. El gel del lado izquierdo muestra el patrón de los fragmentos de DNA obtenidos después de la digestión completa del genoma de polioma con la enzima HpaII. Para determinar cómo se reúnen estos ocho fragmentos para conformar el genoma intacto es necesario tratar el DNA de tal manera que se genere superposición de fragmentos que puede producirse mediante el tratamiento del genoma intacto con una segunda enzima que divide la molécula en sitios diferentes o por el tratamiento del genoma con la misma enzima en condiciones distintas en las que el DNA no se digiera por completo como sucedió en el gel de la izquierda. Las dos muestras de la derecha representan ejemplos de digestiones parciales del genoma del polioma con HpaII. El gel central muestra los fragmentos generados por la digestión parcial del DNA circular súper helicoidal y el gel de la derecha muestra los fragmentos HpaII formados después que el genoma circular se convierte en una molécula lineal por acción de EcoR1 (una enzima que sólo hace un corte en el círculo).

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Figura 18.37 Construcción de un mapa de restricción del genoma circular pequeño del virus tumoral de DNA del polioma. (Continuación) (b) Mapa de restricción del genoma de polioma alineado con base en la división hecha con HpaII. Se ilustran los ocho fragmentos de la digestión completa junto con el DNA en la parte superior. Los fragmentos superpuestos de la digestión parcial se muestran en su disposición ordenada por debajo del mapa. (Los fragmentos L y M migran al fondo del gel en la parte a, lado derecho.) (Tomada de Beverly E. Griffin, Mike Fried y Allison Cowie, Proc. Nat´l. Acad. Sci. U.S.A. 71:2078, 1974.)

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Figura 18.38 Formación de una molécula de DNA recombinante. En este ejemplo una preparación de plásmidos bacterianos se trata con una enzima de restricción que hace un solo corte dentro de cada plásmido bacteriano. Dicha enzima se utiliza para fragmentar una preparación de DNA genómico humano en pequeños fragmentos. Como se trataron con la misma enzima de restricción, el DNA del plásmido dividido y los fragmentos de DNA humano tienen extremos adherentes. Cuando estas dos poblaciones se incuban juntas, las dos moléculas de DNA se unen en forma covalente entre sí y luego se sellan también en forma covalente con la ligasa de DNA, para formar una molécula de DNA recombinante.

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Figura 18.39 Ejemplo de clonación de DNA con plásmidos bacterianos. El DNA se extrae de células humanas, se fragmenta con EcoR1 y los fragmentos se insertan en una población de plásmidos bacterianos. Se cuenta con técnicas para prevenir la formación de plásmidos que carecen del inserto de DNA ajeno. Una vez que la célula bacteriana captó un plásmido recombinante del medio, la célula da origen a una colonia de células que contienen la molécula de DNA recombinante. En este ejemplo la mayor parte de las bacterias contiene DNA de eucariotas con función desconocida (marcados como ?), mientras que uno contiene una porción del DNA que codifica RNA ribosómico y otro contiene DNA que codifica insulina.

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Figura 18.40 Localización de una colonia bacteriana que contiene una secuencia deseada de DNA por réplica en placa e hibridación in situ. (a) Una vez que las células bacterianas se colocaron en placas en medios de cultivo y que proliferaron, la caja se invierte sobre un trozo de papel filtro y se permite que algunas de las células de cada colonia se adsorban al papel. Se inoculan placas de cultivo vacías al presionarlas contra el papel filtro a fin de reproducir réplicas de las placas. (b) procedimiento para revisar las células de una placa de cultivo en busca de las colonias que contengan el DNA recombinante de interés. Los cultivos se pueden “rastrear” con sondas marcadas con elementos radiactivos o fluorescentes. Una vez que las colonias relevantes se identifican, las células pueden retirarse de la placa original y cultivarse por separado para obtener grandes cantidades de los fragmentos buscados de DNA.

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Figura 18.41 Separación del DNA del plásmido del cromosoma bacteriano principal mediante centrifugación de equilibrio con CsCl. Puede verse que este tubo de centrifugación contiene dos bandas, una de DNA del plásmido que tiene un segmento de DNA ajeno que se clonó dentro de las bacterias y la otra contiene DNA cromosómico de estas mismas bacterias. Los dos tipos de DNA se separaron durante la centrifugación (fig. 18.35b). El investigador retira el DNA del tubo con aguja y jeringa. El DNA del tubo se hace visible con el compuesto de unión al DNA bromuro de etidio, que produce fluorescencia bajo luz ultravioleta. (Ted Speigel/© Corbis.)

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Figura 18.42 Protocolo para la clonación de fragmentos de DNA eucariota en un fago lambda. Los pasos se describen en el texto.

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Figura 18.43 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se explica en el texto, el procedimiento emplea la polimerasa de DNA resistente al calor, cuya actividad no se elimina cuando la temperatura se eleva para separar dos cadenas de la doble hélice. Con cada ciclo de duplicación, las cadenas se separan, los segmentos de flanqueo (cebadores) se unen con los extremos de la región seleccionada y la polimerasa copia el segmento intermedio.

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Figura 18.44 Secuenciación de DNA. (a) Pasos básicos en la identificación de la secuencia de un pequeño fragmento hipotético mediante la técnica de Sanger- Coulson (didesoxi), como se describen en el texto. (b) Carriles de gel en que las moléculas hijas con marca fluorescente se separaron. El color de la banda se determina por la identidad del didesoxinucleótido en el extremo 3’ de la cadena de DNA. (c) La secuencia de nucleótidos en la cadena plantilla se interpreta en una computadora que “lee” de abajo hacia arriba en el gel, usando como entrada la intensidad y la longitud de onda de la luz fluorescente. La computadora genera un “electroferograma” que muestra la intensidad y el color de la fluorescencia detectada, junto con la interpretación de la secuencia de DNA. (b,c: tomada de Leroy Hood y David Galas, Nature 421:445, 2003, fig. 1c y 1d. reimpresas con autorización de Macmillan Publishers Ltd.)

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Figura 18.45 Síntesis de cDNA para clonación en un plásmido. (a) En este método de formación de cDNA, un cebador corto poli(dT) se une con el poli(A) de cada mRNA que se transcribe por acción de la transcriptasa inversa (que necesita el cebador para iniciar la síntesis de DNA). Una vez que el híbrido DNA-RNA se forma, se producen muescas en el RNA mediante la RNAasa H y se agrega la DNA polimerasa I para digerir el RNA y sustituir el DNA, justo como ocurre durante la replicación de DNA en una célula bacteriana (pág. 557).

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Figura 18.45 Síntesis de cDNA para clonación en un plásmido. (Continuación) (b) Para preparar cDNA de extremos romos para la clonación se agregan un pequeño fragmento de poli(G) a los extremos 3’ del cDNA y un segmento complementario de poli(C) a los extremos 3’ del DNA plásmido. Los dos DNA se mezclan y se permite que formen recombinantes, que se sellan y usan para transformar las células bacterianas en las que se clonan.

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Figura 18.46 Microinyección de DNA en el núcleo de un huevo de ratón recién fertilizado. El huevo se mantiene en su sitio con una pipeta de succión que se muestra a la derecha, mientras que la pipeta de inyección que penetra el huevo se muestra a la izquierda. (Tomada de Thomas E. Wagner, et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 78:6377, 1981.)

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Figura 18.47 Ratones transgénicos. Esta fotografía muestra un par de hermanos de la misma camada a las 10 semanas de edad. El ratón más grande se desarrolló de un huevo inyectado con DNA que contenía el gen de la hormona de crecimiento de la rata, que se colocó en dirección 3’ del promotor de metalotioneína. El ratón más grande pesa 44 g; el más pequeño, el testigo no inyectado, pesa 29 g. El gen GH de rata se transmitió a los descendientes que también crecieron más que los testigos. (Cortesía de Ralph L. Brinster, de un trabajo publicado en R. D. Palmiter, et al., Nature, 300:611, 1982. Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd.)

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Figura 18.48 Formación de plantas transgénicas con el plásmido Ti. El transgén se incluye en el DNA del plásmido Ti, que se reintroduce en la bacteria hospedadora. Las bacterias que contienen el plásmido recombinante se usan luego para transformar células vegetales, en este caso las células del meristemo en el extremo superior de una punta disectada de la raíz. Los brotes transformados se transfieren a un medio de selección, donde desarrollan raíces. Las plantas enraizadas pueden transferirse a tierra.

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Figura 18.49 Formación de ratones con inactivación génica. Los pasos se describen en el texto.

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Figura 18.50 Determinación de la función génica por RNA interferente. La figura muestra una galería de imágenes por inmunofluorescencia de células cultivadas de Drosophila que se incubaron con varios siRNA de cadena doble. Las células mostradas se acumularon en metafase por un tratamiento separado que bloqueó el avance hacia la anafase. Durante el estudio se examinaron más de 4 millones de células. Fue posible someter a detección a una gran cantidad de células mediante la selección computarizada de las imágenes de células que estuvieran en metafase para luego elegir y ensamblar las imágenes en paneles como el que se muestra en esta fotografía. Así, podía buscarse la presencia de husos mitóticos anormales, ya fuera por observadores humanos o por análisis computarizado con programas diseñados para detectar características específicas de un huso anormal. (Un estudio de mayor tamaño del mismo tipo se publicó en Nature 464:721, 2010.) (Por Cortesía de Gohta Goshima y Ronald D. Vale.)

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Figura 18.51 Determinación de la función génica por interferencia del RNA. (Izquierda) Una célula de mamífero cultivada no tratada en la metafase de la mitosis. (Derecha) El mismo tipo de célula se trató con un dsRNA de 21 nucleótidos diseñado para inducir la destrucción de los mRNA que codifican la cinasa Aurora B, una proteína participante en el punto de comprobación del huso en metafase. Los cromosomas de esta célula se encuentran adyacentes al huso mitótico, lo que sugiere la ausencia de interacciones entre el cinetocoro y el microtúbulo. (Tomada de Claire Ditchfield et al., J. Cell Biol. 161:276, 2003, fig. 8d. Reimpresa con autorización de the Rockefeller University Press.)

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. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular

Figura 18.52 Formación de anticuerpos monoclonales. Los pasos se describen en el texto. El medio HAT se llama así porque contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. Este medio permite el crecimiento de las células con una fosforribosilo transferasa de hipoxantina- guanina (HGPRT), pero no apoya el crecimiento de células que carecen de esta enzima, como las células de mieloma múltiple sin fusionar que se usaron en este procedimiento.