BCR e immunoglobuline

Cellula B

I B attivati si differenziano in plasmacellule

Plasmacellula

Morfologia della plasmacellula

La plasmacellula matura ha un nucleo eccentrico ed un abbondante citoplasma basofilo.

Immunoglobuline o anticorpi(proteine che legano l’Ag)

•Effettori specifici della RI adattativa umorale


• Glicoproteine multimeriche• Di membrana o secrete


Anticorpo: termine coniato da Karl Landsteiner nel 1900 per definire la sostanza che reagiva in maniera specifica con i batteri

•Esiste componente nel siero in grado di precipitare le tossine ed agglutinare i batteri: (antitossina, agglutinina, precipitina)

• siero di conigli precedentemente immunizzati per la tossina tetanica potevano trasferire la loro immunità ad animali non immunizzati

• Paul Ehrilich studio analogo sulla difterite • Emile Roux (Istituto Pasteur) dimostra

efficacia dell’antitossina nel trattamento dei bambini esposti al contagio da bacillo difterico

Emil Von Behring (premio Nobel 1901) e Shibasaburo KitasatoBerlino

Elettroforesi su carta

Molecole con carica netta positiva → catodo (-)

Molecole con carica netta negativa → anodo (+)

La mobilità elettroforetica dipende da:

• Intensità del campo elettrico

• Coefficiente frizionale (dimensione e carica della particella)

1939 A. Tiselius E.A. Kabat•Misero a punto un metodo elettroforetico per separare le

diverse proteine del siero.

Volendo effettuare in siero-elettroforesi si

impiega un tampone a pH alcalino il quale

conferisce alle molecole proteiche una carica negativa rendendole

solubili senza sottoporle a denaturazione.

Elettroforesi delle proteine del siero

Siero, non plasma, per eliminare l’interferenza del fibrinogeno

Separazione delle proteine in base alla loro carica

• Questa tecnica ha permesso di separare le albumine e le altre frazioni del siero, le alfa, beta e gamma globuline

in ordinata i valori

dell'assorbanza ed in ascissa la posizione delle

bande.

1939 A. Tiselius E.A. Kabat

• La frazione delle gamma globuline era presente in quantità più elevata nei sieri di animali immunizzati.

Le immunoglobuline sono presenti nella frazione delle gamma globuline del siero

Bande α , β e γ

•Gli anticorpi presenti in questa frazione di globuline immuni sono stati chiamati

immunoglobuline

Separazione delle proteine plasmatiche

Harvard University, Cohn e alcuni colleghi intrapresero una ricerca finalizzata a individuare il metodo migliore per la separazione delle proteine plasmatiche in frazioni stabili dotate delle loro

proprietà biologiche naturali,

(la tecnica più efficiente consisteva nel sottoporre il plasma a centrifugazione e poi a raffreddamento a 0°C. Dopo aggiunta di etanolo e tampone, la temperatura andava ridotta ulteriormente fin quasi al punto di congelamento; poi si aumentava il contenuto di etanolo fino a raggiungere il livello dell’8% in volume, si portava la temperatura a –3°C, il pH a 7,2 e la forza ionica a 0,14. In questa maniera si otteneva la precipitazione di tutte le componenti biologiche del sangue in quattro frazioni, in una sola delle quali (la seconda) si localizzava la quantità maggiore di gamma-immunoglobuline, nel 1964 ridenominate IgG.)

Gli anticorpi possono essere separati in base al PM

Ultracentrifugazione delle immunoglobuline su gradiente di saccarosio

ha permesso di risalire al peso delle immunoglobuline rappresentato come coefficiente di sedimentazione S

(maggiore è il peso della molecola più è elevato il valore di S)

La porzione gamma globulinica venne separata in due frazioni al elevato coefficiente di sedimentazione a 20°C in acqua:19S (PM 950.000 dal)7S (PM 150.000 dal)

Purificazione con resina a scambio anionico di carbossimetilcellulosa che consente di separare le proteine in base alla loro carica

Proteina purificata: 150.000 dal

Digestione proteolitica con papaina

Le frazioni I e II erano in grado di legare l’antigene ma non di ma non di precipitarlo

o agglutinarlo mentre la frazione III di formare cristalli a bassa forza ionica e a

pH neutro

50kDa 50kDa

50kDa

Rodney Porter Gerald Edelman (anni ’50-’60) (Premio Nobel 1972)Digestione proteolitica della frazione 7s (150.000) con papaina (enzima

derivato dalla papaya oggi usata come tenerizzatore della carne)

Rodney Porter Gerald Edelman (anni ’50-’60) (Premio Nobel 1972)

Alfred Nisonoff( 1923-2001)

continua il lavoro di Rodney Porter


Digestione proteolitica con pepsina

Prodotto di 2/3 delle gamma globuline totali in grado di precipitare l’antigene

indicando che doveva essere almeno bivalente

F(ab)’2

F(ab)’2 = frammento dimerico dell’Ig in contenente i due siti di legame dell’antigene

La digestione delle IgG con papaina o pepsina, ha permesso di costruire un modello di struttura delle Ig, perchéa determinati frammenti proteolitici corrispondono funzioni ben definite

Proteolytic fragments of an IgG molecule. IgG molecules are cleaved by the enzymes papain (A) and pepsin (B) at the sites indicated by arrows. Papain digestion allows separation of two antigen-binding regions (the Fab fragments) from the portion of the IgG molecule that binds to complement and Fc receptors (the Fc fragment). Pepsin generates a single bivalent antigen-binding fragment, F(ab¢)2.


gel filtrazione: 50.000 dal + 25.000 dal

Riduzione e alchilazione per rompere ponti disolfuro

Per rompere la struttura

quaternaria (dissociare le

subunità)

• 2 Catene leggere 25kD• 2 Catene pesanti 50-70kD

capra

capra

Ab riconoscevano solo catene H

Ab riconoscevano catene H e catene L

coniglio

Rodney Porter

Anticorpi prodotti contro il frammento fab riconoscevano sia le catene L che le catene H mentre anticorpi prodotti

contro il frammento fc riconoscevano solo le catene H

Sequenza aa di tutti i mielomi disponibili

Tutte le catene leggere variano tra di loro nella

parte NH3+ terminale ma non nella COO- terminale

Mieloma multiploNeoplasia plasmacellule secernenti

anticorpi

Proteine di Bence-jones

(<65000dal)

VL

CL

NH3+

COO-

VL

CL

NH3+

COO-

K (60%)

λ(40%)

Sequenza aa

Plasmacitomi coltivati in vitroNeoplasia plasmacellule

secernenti anticorpi

VH

CH

NH3+

COO-

δ , γ , α

(330aa)

1) Sequenza aa

2) Produzione di anticorpi monoclonali per determinare la classe diversa o isotipo

CH

CH

µ , ε(440aa) ISOTIPO

classe Catena pesante

sottoclassi Catena leggera

IgG γ γ 1, γ 2, γ 3, γ 4

κ , λ

IgM µ κ , λ

IgA α α 1, α 2 κ , λ

IgE ε κ , λ

IgD δ κ , λ

Classi (o isotipi) anticorpali

Markers isotipici:• permettono di classificare le

catene pesanti di una specie animale in classi e sottoclassi e quelle leggere in tipi e sottotipi.

• Se iniettati in un’altra specie si

creano Ab.

Markers allotipici:• esistono alleli multipli di

geni isotipici, piccole differenze aa. Non si creano Ab in animali.

• Politrasfusi e poligravide vedono queste piccole differenze.

Sito di legame con l’antigene

Regioni variabili o cornice (FR1, FR2, FR3, FR4) ed ipervariabili (CDR1, CDR2, CDR3)

Markers idiotipici:• determinanti antigenici

presenti sulle regioni variabili ed ipervariabili.

• Noi stessi fabbrichiamo Ab che riconoscono questi siti.

• Rete idiotipica.

• Ab anti zona cornice (inducono una modificazione

conformazione: azione inibitoria o nulla)

• Ab anti parte ipervariabile (competono con Ag, possono inibire il

legame)

Network idiotipico

Flessibilità della regione cerniera

• Conferisce l’adattabilità della molecola alle diverse strutture antigeniche

IgA, IgD, IgG IgE, IgM

CH1/ CH1 CH1/ CH1

Regione cerniera CH2/ CH2

CH2/ CH2 CH3/ CH3

CH3/ CH3 CH4/ CH4

Regione cerniera

Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc: Fissazione del complemento

Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:opsonizzazione

Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:ADCC (antibody dependent cell cytotoxicity)

Recettori Fc dei leucociti

MASTCELLULE

BASOFILI

sCD23 induce un aumento della produzione di IgE da parte di B linfociti

classe Catena pesante

sottoclassi Catena leggera

IgG γ γ 1, γ 2, γ 3, γ 4

κ , λ

IgM µ κ , λ

IgA α α 1, α 2 κ , λ

IgE ε κ , λ

IgD δ κ , λ

Struttura delle classi (o isotipi) anticorpali

180.000 Da

(Catena J = 15kDa)

• Primo isotipo secreto nel corso della RI primaria e prime ad essere espresse come Ig di membrana dai linfociti B che maturano nel fegato fetale e nel midollo osseo

• Concentrazione sierica 1 mg/ml• Bassa affinità ed elevata avidità• Molto efficaci nell’attivare il C• Mucose e latte materno• Esameri molto più potenti nell’attivare il

C

PM 900.000Da (19s)

IgG

• PM 150.000 (7s)• Concentrazione sierica 10 mg/ml • 1/3 territori extravascolari• Attivano il C• Poco avide ma molto affini • (rimuovono tossine e virus)

Concentrazione sierica: 3mg/ml (monomeriche 160.000-170.000 Dal 8% zuccheri)

latte, saliva, lacrime, muco(dimeri 400.000 Dal o tetrameri 600.000 Dal)

70.000Dal

IgA2 circa 20aa in meno nella zona cerniera di IgA1

Endocitosi R-dip

30µ g/ml

Nessuna funzione effetrice nota

Zona cerniera

1u internazionale = 2,4 ng/ml

80-100IU

Difesa contro i parassiti

Allergie

IgG 10 mg/ml

IgA 3 mg/ml

IgM 1 mg/ml

IgE 100IU1 IU=2,4ng/ml

IgD 30µ g/ml

Glicosilazione

• Importante per l’EMIVITA

• CITOFILIA• Mantengono la

conformazione allosterica

Superfamiglia delle immunoglobuline

CH1

CH2

CH3

CH4

I CINQUE ISOTIPI (O

CLASSI)DELLE

IMMUNO-GLOBULINE

nella forma di membrana

IgM

CH2

CH3

CH1

IgD

CH1

CH2

CH3

CH4

IgE

CH2

CH3

CH1

IgAIgG

CH2

CH3

CH1

• è necessaria la presenza di più fattori sierici per uccidere i batteri

• Il siero immune fresco contro il Vibrio Cholerae era in grado di distruggere i batteri ma se preriscaldato a 58°C non era più in grado di eliminare il patogeno

• L’aggiunta di siero fresco non immune ricostituiva l’attività litica• (gli anticorpi prendono parte alla fase di riconoscimento

specifico mentre la funzione effettrice dipende dal reclutamento di altre proteine sieriche)

Jules Bordet 1890

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