Moltiplicazione dei germogliE’ la fase che, forse più di altre, influenza l’efficienza della

micropropagazione poiché da essa dipende il numero di nuovi germogli prodotti e la loro qualità. Quindi: importanza della citokinina nel promuovere

la schiusura delle gemme ascellari e rimuovere la dominanza apicale. Tasso di moltiplicazione (o di proliferazione): esprime quanti germogli vengono prodotti in 1 mese da un germoglio di partenza. Alcuni esempi di tasso di moltiplicazione basso, medio ed alto: - basso: 1 ÷ 3 - 5 - medio: 1 ÷ 10-12- alto: 1 ÷ 20-25

Esempio: con tasso di moltipl. 1 ÷ 5: - 1° mese: 5 germogli - 2° mese: 25 germogli - 3° mese: 125 germogli - 4° mese: 625 germogli - 5° mese: 3.125 germogli

Esempio: con tasso di moltipl. 1 ÷ 10:- 1° mese: 10 germogli- 2° mese: 100 germogli- 3° mese: 1000 germogli- 4° mese: 10.000 germogli- 5° mese: 100.000 germogli

Nella camera di crescita possono essere collocati diversi scaffali di varia altezza e larghezza. Capacità produttiva di una camera di crescitaEsempio:- scaffale di 3 m di altezza, - lungo 4 m, - con piani distanti circa 50 cm (totale 5 piani utilizzabili). Se i piani sono larghi 1 m abbiamo a disposizione 4 m2 per piano, in totale 20 m2. Per ciascun piano: due linee di tubi al neon (8 tubi) distanti circa 30 cm.Numero vasi per m2: circa 100; per scaffale: 2.000Numero germogli per vaso: circa 50, per scaffale: 100.000

Importanza della qualità dei germogli

Molti germogli ma qualitativamente scadenti

Germogli in quantità mediamente elevata ma di ottima qualità

Numerosi germogli di buona qualità

Cicli di coltura (Subcolture)

Ogni 15 – 20 giorni le colture vengono trapiantate in vasi contenenti substrato fresco.

Motivo: con la crescita, le colture esauriscono il substrato di alcune componenti che devono essere riportate a concentrazioni ottimali.

In realtà non tutto il substrato si esaurisce ma soprattutto quello a contatto dei tessuti. La presenza dell’agar riduce la diffusione (da zone a maggiore

conc. verso zone a minore conc.) delle varie componenti e le colture vanno incontro a fenomeni di sofferenza. Dunque il rinnovo del substrato deve

avvenire quando questi sintomi stanno per verificarsi.

Per questo motivo, il substrato ritenuto esaurito conterrebbe ancora una discreta quantità di componenti che però non sono più riutilizzabili. Es. del

saccarosio che si aggiunge al substrato (30 g/l): soltanto il 10 % circa è assorbito dalle colture

FASE di Allungamento dei germogli- Non sempre è necessaria (se la citokinina è a bassa conc.)- Migliora la morfogenesi delle foglie- Favorisce l’allungamento dei germogli- Germogli più vigorosi- Migliora la risposta di radicazione dei germogli

Come si effettua:- Si riduce la conc. di citokinina (ad es. a 0,1 – 0,2 mg/l)- Si aumenta la conc. di gibberellina (ad es. a 0,5 mg/l)- Impiego di carbone attivo (ad es. alla conc. di 500 mg/l)

Dopo la fase di allungamento

Alla fine della moltiplicazione dei germogli

Radicazione

Fattori che controllano la rizogenesi dei germogli- Genotipo- Vigoria del germoglio e sviluppo fogliare - Precedente fase di allungamento dei germogli- Contenuto di macroelementi nel substrato di radicazione- Tipo e concentrazione di auxina

- Tipo: acido indolbutirrico (IBA), acido naftalenacetico NAA), acido indolacetico (IAA)- concentrazione: 0,5 – 2 - 3 ppm (non eccedere con la concentrazione per evitare effetti negativi sull’apice del germoglio)

Effetto di una eccessiva concentrazione di auxina sugli apici dei germogli che si sono bloccati:1) per un’azione diretta dell’auxina sull’apice

2) per una elevata competizione tra radici e germogli

Portinnesto di vite

La qualità della radicazione si basa sul numero e sulla distribuzione delle radici avventizie

Germogli radicati di Vite

Germogli radicati di susino

Germogli radicati di Pesco: notare l’elevata qualità del germoglio e delle radici

Dimensioni ottimali delle radici per il trapianto delle nuove piantine: nel momento in cui

alla base dei germogli sono presenti gli abbozzi radicali (1 – 2 mm)

Talvolta alla base del germoglio si forma callo, da solo o in presenza di radici

Possibili cause della mancata radicazione:

- Scarsa attitudine rizogena del genotipo,

- Substrato di radicazione (bioregolatori: tipo e concentrazione) non idoneo

La produzione di callo è da considerare negativa sull’acclimatazione delle piantine

Acclimatazione delle piantine micropropagate

Durante la coltura in vitro i tessuti si assuefanno a:- umidità elevata e costante- temperatura costante- luce costante

L’effetto prevalente è dell’umidità, che determina:- riduzione dello strato ceroso- perdita del meccanismo di chiusura stomatica

Conseguenza:in ambiente esterno al vitro, immediata perdita di acqua dai tessuti con conseguente disidratazione e disseccamento.E’ quindi necessario riabituare gradualmente le piantinealle condizioni esterne.

Come si esegue l’acclimatazione delle piantine micropropagate

- lavaggio in acqua delle piantine per allontanare i residui di agar- trapianto in contenitori alveolari riempiti di torba- trasferimento dei contenitori sotto tunnel- mantenimento di elevata umidità relativa per alcuni giorni (10 – 15) (fino ad attecchimento delle radici nel nuovo substrato)- inizio dell’acclimatazione del germoglio aprendo gradualmente il tunnel per periodi sempre più lunghi

I germogli ben radicati vengono trapiantati in alveoli contenenti torba per iniziare l’acclimatazione

Piantine micropropagate alla fine della fase di acclimatazione

Piantine micropropagate alla fine della fase di acclimatazione

Fattori ambientali e fisiologici che influiscono sulla capacità di acclimatazione delle piantine:

AMBIENTALI- Umidità relativa- Temperatura della serra- Intensità della luce- Fotoperiodo- Tipo di substrato

FISIOLOGICI- Attività fotosintetica (autotrofia)- Vigoria del germoglio radicato- Numero e lunghezza delle radici- Presenza di foglie ben formate, ricche di clorofilla - Funzionalità stomatica- Presenza di cere cuticolari- Accrescimento dell’apice (competizione radici/germoglio)- Attacchi parassitari

Problemi della micropropagazione

• - NECESSITA’ DI ATTREZZATURE COSTOSE• - ELEVATA RICHIESTA DI PERSONALE• - NECESSITA DI CONSERVARE LE COLTURE (celle frigo)• - CONTAMINAZIONI• - VARIABILITA’ GENETICA DELLE PIANTE PRODOTTE• - SCARSA RICHIESTA DI MERCATO

VARIABILITÀ DELLE PIANTE MICROPROPAGATE.Dovuta a: 1) variazioni genetiche : mutazioni ereditabili del DNA. Cause: formazione di germogli avventizi da callo che possono presentare variabilità somaclonale ovvero variabilità trasmessa alle piante rigenerate. Queste presentano caratteristiche morfologiche diverse dalle piante normali, come diversa altezza, numero, colore e dimensione delle foglie o anche differenze fisiologiche come la resistenza ai metalli pesanti etc. Se le piante rigenerate sono in grado di produrre semi vitali, così da poter esaminare le generazioni successive, si osserva che parte di queste differenze morfo-fisiologiche sono conservate.

Queste variazioni nelle colture e nella progenie che ne deriva si definisce variazione somaclonale e può costituire un importante strumento per aumentare la biodiversità. Per la propagazione clonale le variazioni somaclonali sono negative.

2) variazioni chimeriche: possono manifestarsi quando la pianta madre è una chimera (perdita del carattere chimerico) Es: dieffembachia

(3) variazioni fenotipiche transitorie: es. perdita temporanea di alcune caratteristiche come vigore, ramificazione, ecc.

4) variazioni epigenetiche, variabilità epigenetica : mutazioni non ereditabili del DNA. Le alterazioni fenotipiche epigenetiche sono cambiamenti temporanei e reversibili, ma possono persistere per tutta la vita della piantina rigenerata. Comune è il fenomeno del ringiovanimento, soprattutto in specie legnose (Gimnosperme), che porta a differenze morfologiche, fioritura precoce, aumento della formazione di radici avventizie e del vigore della pianta. Le cause di queste alterazioni non ereditabili non sono note, ma probabilmente sono indotte dall'ambiente di coltura.

Una biotecnologia che sta trovando sempre maggiore interesse in campovivaistico è rappresentata dalla induzione della simbiosi micorrizica su piantine micropropagate, grazie alla quale le piante micorrizate acquisiscono un maggiore potenziale di accrescimento:- maggiore capacità di assorbimento di acqua ed elementi nutritivi (fosforo, potassio, ecc),- possibilità di ridurre l’apporto di fertilizzanti- maggiore resistenza ad attacchi di patogeni

Vantaggi derivanti dal’impiego di Funghi Micorrizici in fase di acclimatazione di piantine micropropagate

(vite)

MIC + MIC -

SUSINO

ORGANOGENESI

Capacita di cellule differenziate di de-differenziarsi e riacquisire capacità meristematica

-- Caulogenesi: produzione di germogli avventizi- Rizogenesi: produzione di radici avventizie

La rigenerazione può essere - diretta (dalle stesse cellule dell’espianto) E' una metodologia volta

all'ottenimento di germogli o radici, direttamente da tessuti messi in coltura, senza passare attraverso le fasi di callo. L'assenza di proliferazione disorganizzata assicura una discreta stabilità genetica.

- indiretta (da cellule del callo) Sebbene l'organogenesi "in vitro" possa

avvenire direttamente su espianti primari, in alcuni casi essa avviene su ammassi cellulari denominati "calli".

In questo caso tessuti organizzati come foglie, radici, fusti ecc... perdono la loro struttura specializzata per accrescersi sottoforma di cellule disorganizzate (callo). Il callo è costituito da tessuto parenchimatico, con cellule altamente vacuolate, poco citoplasma appressato alla membrana, nucleo piccolo e situato alla periferia della cellula.

L'induzione e la crescita del callo è favorito dalla presenza nel mezzo di coltura di elevate concentrazioni di auxine e basse concentrazioni di citochinine. Ogni specie necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e di particolari condizioni ambientali.

La morfogenesi è stata osservata in numerose specie, ma non può essere indotta universalmente, anche all’interno di una stessa specie alcuni genotipi sono recalcitranti.Le cellule che hanno (o acquisiscono) capacità morfogenica sono dette COMPETENTI.La competenza è generalmente verso una specifica via di sviluppo:una cellula competente per lo sviluppo dell’embrione somatico nonlo è anche per lo sviluppo del germoglio.Le cellule possono essere indotte a diventare competenti aggiungendo nel mezzo di coltura opportuni regolatori di crescita

Il processo organogenico può essere diviso in due fasi: la prima detta di induzione e la seconda di determinazione. Durante la prima fase una o più cellule riacquistano la capacità di dividersi dando origine a centri meristematici. Nella seconda fase i centri meristematici acquistano una polarità indirizzandosi verso la formazione di un apice radicale o apicale o verso un embrione somatico.

I nuovi organi rigenerati sono caratterizzati da una più o meno elevata variabilità genetica.

La rigenerazione può essere impiegata per la produzione di nuovi genotipi.

Fattori che influiscono sull’organogenesi:- Tipo di espianto: porzione di lamina fogliare, di picciolo, di germoglio (asse), di cotiledoni, di embrione zigotico- Bilancio ormonale del substrato- Condizioni ambientali (luce, temperatura)

Esempio di rigenerazione indiretta di germogli avventizi da callo prodotto da una lamina fogliare

EMBRIOGENESI SOMATICA

Il fenomeno dell'embriogenesi somatica è stato osservato per la prima volta nel 1958 in colture "in vitro" di carota; da diversi anni è molto studiato come sistema di moltiplicazione delle specie di interesse agrario.

Mediante tale processo, cellule somatiche danno origine, attraverso gli stadi embriologici caratteristici, a embrioni somatici (senza fusione dei gameti).

Tale processo implica la formazione di strutture bipolari provviste sia di apice radicale che di apice caulinare indispensabili al normale sviluppo della plantula. A partire dallo stadio globulare, è possibile osservare la progressione della polarità attraverso uno stadio a cuore, a torpedo fino alla formazione dei cotiledoni e la completa differenziazione della plantula.

L’embriogenesi somatica può essere indotta sia direttamente, in cellule appartenenti ad una struttura differenziata (foglie, stelo, radici, cotiledoni ecc.), sia indirettamente in calli allevati su un mezzo agarizzato o in sospensioni cellulari.

Una volta ottenuti gli embrioni somatici è possibile manipolare tali strutture in modo da ottenere semi artificiali.

Condizionamento delle cellule per l’espressione del potenziale embriogenico

Come per l'organogenesi, anche l’embriogenesi prevede due fasi: la prima di induzione, la seconda di determinazione. Con l’induzione le cellule riacquistano la capacità meristematica. In relazione al tipo di trattamento le cellule divengono quindi determinate ed acquisiscono la competenza a produrre l’embrione somatico.

Nella fase di induzione è importante una elevata concentrazione di auxina ed in particolare del 2,4-D.

Si ritiene che gli ES possano originarsi da gruppi di cellule anche senza passare da una fase di de-differenziazione cellulare. Le cellule da cui si originano sono meristematiche, piccole, ricche di citoplasma e provviste di un grosso nucleo.

E’ generalmente accettato che gli ES derivano da una singola cellula al contrario dell’origine pluricellulare degli organi avventizi (radici e germogli).

kalanchoe

Esempio di embriogenesi somatica naturale

Massa proembriogenica in accrescimento in tessuto di callo

Embrioni allo stadio globulare

Embrione allo stadio cotiledonare con forte anomalia

morfologica del cotiledoni

Embrioni allo stadio cotiledonare con forte anomalia

morfologica del cotiledoni

Apici radicali

Apici caulinari

Fig.25 - Embriogenesi somatica indiretta in Pinus radiata. (Da: Aquea et al., 2008)

EMBRIONISOMATICI

Fig. 26 - Embriogenesi somatica in garofano (Da: Seo et al., 2007)

EMBRIONISOMATICI

Fig. 27 - Embriogenesi somatica in castagno.(Da: Sauer e Wilhelm, 2005)

EMBRIONISOMATICI

Fig. 28 – In alcune specie l’embriogenesi somatica può

permettere di produrre un numero elevatissimo di

embrioni come nel caso della

Chamaecyparis obtusa (Da: Maruyama et al., 2005).

Le colture cellulari aumentano il potenziale embriogenico

COLTURE CELLULARIL’utilizzo di colture cellulari permette uno stretto controllo delle condizioni

chimico-fisiche di crescita. Ovviamente per fare ciò è necessario mantenere delle condizioni asettiche; le colture di cellule vegetali sono

particolarmente ricche di materiale organico, come saccarosio (in genere 1-5%) e materiale inorganico, così da essere l’ambiente ideale per la crescita di funghi e batteri contaminanti. Tali organismi crescono più

velocemente delle cellule vegetali, alterano la composizione del mezzo di coltura sia consumando le sostanze in esso contenute, sia producendo

essi stessi metaboliti e tossine che concorrono alla variazione della composizione del medium.

Quindi è essenziale mantenere condizioni di sterilità sia per i terreni di coltura che per i recipienti (capsule Petri, beute, tubi o fermentatori adatti allo scopo), che per gli strumenti (bisturi, lamette pinzette) utilizzati per il

prelievo del tessuto che ovviamente deve essere preventivamente sterilizzato mediante lavaggio con alcol (70% etanolo) o candeggina

(sodio ipoclorito 10%) per alcuni minuti. Le condizioni di crescita sono in genere mantenute con una temperatura di 18-25°C e una illuminazione sufficiente (almeno 200 µE m-2 s-1) con

un opportuno fotoperiodo (in genere 18 h di luce / 8 ore di buio).

SEME ARTIFICIALE

Un ulteriore potenziamento dei metodi di propagazione basati sull’embriogenesi somatica è rappresentato dalla possibilità di realizzare “semi artificiali”, ovvero embrioni somatici incapsulati in una specifica matrice arricchita di nutrienti minerali, carboidrati, vitamine e ormoni, in modo da costituire un rivestimento idoneo per proteggere e conservare gli embrioni e mantenere inalterata la loro capacità di germinazione. L’incapsulamento, inoltre, conferisce al seme artificiale una sufficiente resistenza da poter essere manipolato alla stregua dei semi naturali.

Un notevole impulso all’embriogenesi somatica è stato dato dall’impiego delle colture cellulari e dei bioreattori. Con le colture cellulari è possibile coltivare le cellule singole o riunite in piccoli ammassi, su substrato liquido; in questo modo la capacità di moltiplicazione cellulare è elevatissima. Considerato che ogni cellula può (teoricamente) trasformarsi (totipotenza delle cellule vegetali) in embrione somatico, appare evidente la grande potenzialità di moltiplicazione di questo sistema di coltura.

Bioreattori: complesse apparecchiature che consentono di coltivare in substrato liquido le cellule vegetali. E’ possibile controllare tutti i fattori fisici (temperatura, luce, ecc.) e chimici (pH, ferro, ossigeno, ecc) e stimolare notevolmente l’accrescimento. Sono di grande interesse per la produzione di embrioni somatici in quantità enormi.

Incapsulamento di embrioni somatici in alginato di calcio

Embrioni somatici incapsulati in alginato o in capsule farmaceutiche

Semi artificiali ottenuti mediante incapsulamento di embrioni somatici in gocce di alginato.

Semi artificiali in Chamaecyparis pisifera (Da: Maruyama et al., 2003)