Applicazioni cliniche in Microbiologia - fitelab.it · Microbiology Laboratory Results of analyses...

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Applicazioni cliniche in Applicazioni cliniche in Microbiologia Microbiologia Diamante Paola Microbiologia e Virologia - Pordenone

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Applicazioni cliniche in Applicazioni cliniche in

MicrobiologiaMicrobiologia

Diamante Paola Microbiologia e Virologia - Pordenone

SFIDASFIDA

Ridurre il tempo analiticoRidurre il tempo analiticorispetto alle procedure standard,rispetto alle procedure standard,

in modo da ottenerein modo da otteneresostanziali beneficisostanziali benefici

per la gestione delle malattie infettive.per la gestione delle malattie infettive.

Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.

Camporese A. Inf Med 2004;12:118-125

In questo modo i risultati di In questo modo i risultati di

microbiologia diventano microbiologia diventano

sempre sempre pipiùù utili in termini utili in termini

clinici.clinici.

Raggiungere lRaggiungere l’’obbiettivo obbiettivo èè possibile,possibile,

mediante nuove tecnologie, automazionemediante nuove tecnologie, automazione

e test rapidi in grado di migliorare il flusso e test rapidi in grado di migliorare il flusso

di lavoro provvedendo nello stesso tempodi lavoro provvedendo nello stesso tempo

a mantenere a mantenere ll’’alta qualitalta qualitàà dei risultati. dei risultati.

Camporese A. Inf Med 2004;12:118-125

La rapiditLa rapiditàà delle delle tecniche Molecolari tecniche Molecolari

combinate con lcombinate con l’’automazione e con un piautomazione e con un piùù

facile utilizzo dei software, ha permesso facile utilizzo dei software, ha permesso

anche nella pratica microbiologica,una anche nella pratica microbiologica,una

significativa diffusione di strumentazione significativa diffusione di strumentazione

ad esse dedicate.ad esse dedicate.

Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology. Tang, Yi-Wei; Stratton, Charles W. (Eds), 2006.

PhysiciansPhysicians embracedembraced anan empiricalempirical approachapproach

to the management of to the management of manymany infectiousinfectious

diseasesdiseases, , favouringfavouring overuseoveruse of of antibioticsantibiotics..

Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.

InfectiousInfectious diseasesdiseases diagnosisdiagnosis and and

empiricalempirical approachapproach

Ancor oggiAncor oggi i tempi necessari per giungere alla i tempi necessari per giungere alla

identificazione del patogeno e al rilevamento identificazione del patogeno e al rilevamento

delle relative resistenze, delle relative resistenze, implicano una implicano una

terapia antibiotica empirica ad ampio spettroterapia antibiotica empirica ad ampio spettro

basata sullbasata sull’’epidemiologia del reparto e sui epidemiologia del reparto e sui

fattori di rischio del paziente.fattori di rischio del paziente.

Questo comporta un Questo comporta un aumentato rischioaumentato rischio di di

effetti collaterali avversieffetti collaterali avversi, favorisce , favorisce ll’’insorgenza insorgenza

di resistenzadi resistenza ai farmaci antibatterici,ai farmaci antibatterici,

induce un generale induce un generale incremento della mortalitincremento della mortalitàà

ed ed aumenta i costiaumenta i costi di gestione dei pazienti.di gestione dei pazienti.

•• Evitare un trattamento antibiotico empirico.Evitare un trattamento antibiotico empirico.

•• Permettere un utilizzo piPermettere un utilizzo piùù ristrettoristretto dello dello spettro di spettro di antibiotici disponibili o un uso piantibiotici disponibili o un uso piùù

appropriato appropriato di di farmaci antivirali.farmaci antivirali.

•• Provvedere ad una piProvvedere ad una piùù accurata accurata informazione informazione epidemiologicaepidemiologica per provvedere a formulare per provvedere a formulare raccomandazioni e terapie appropriate.raccomandazioni e terapie appropriate.

•• Diminuire i tempiDiminuire i tempi di ospedalizzazione e di ospedalizzazione e ridurre i costiridurre i costi di gestione.di gestione.

Obbiettivi di una diagnosi eziologicaObbiettivi di una diagnosi eziologica

Ieven, M. J Clin Virol. 2007

LL’’approccio diagnostico basato sui test approccio diagnostico basato sui test

MolecolariMolecolari costituisce il costituisce il principale strumentoprincipale strumento

che può alleviare dal bisogno di colture eche può alleviare dal bisogno di colture e

consentire consentire ll’’dentificazionedentificazione di uno o pidi uno o piùù

patogeni da uno spettro di patogeni da uno spettro di microorganismimicroorganismi

associati ad una sindrome infettiva.associati ad una sindrome infettiva.

Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.

Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.

In casi di sindromi cliniche particolari come In casi di sindromi cliniche particolari come

la la sepsisepsi, possono aiutare a individuare , possono aiutare a individuare

velocemente una situazione in cui la terapia velocemente una situazione in cui la terapia

antibatterica antibatterica èè rilevante.rilevante.

Nelle Nelle infezioni virali deinfezioni virali dellelle basse vie basse vie

respiratorie,respiratorie, può limitare la prescrizionepuò limitare la prescrizione

di terapie antibatteriche e la necessitdi terapie antibatteriche e la necessitàà di di

test addizionali.test addizionali.

Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.

EntranceEntrance intointo the diagnostic the diagnostic cyclecycle ((00––6 6 hourshours): ):

patient patient arrivalarrival, , triagetriage, , primaryprimary evaluationevaluation, , questionnairequestionnaire and and physicalphysical examinationexamination byby physicianphysician, ,

presumptivepresumptive diagnosisdiagnosis, , physicianphysician laboratorylaboratory analysisanalysis requestrequest(s), clinical (s), clinical samplingsampling, transfer to , transfer to laboratorieslaboratories, etc., etc.

ConventionalConventional diagnosticsdiagnosticsMolecularMolecular diagnosticsdiagnostics

in in MicrobiologyMicrobiology and and VirologyVirology

MicrobiologyMicrobiology

LaboratoryLaboratory

Results of Results of analysesanalyses and and healthcarehealthcare decisiondecision processprocess (hours to days):transmissiontransmission of results, of results, interpretationinterpretation, patient management, , patient management, therapeutictherapeutic

interventionintervention, , confirmatoryconfirmatory testingtesting, treatment , treatment adjustmentadjustment, etc., etc.

Positive Positive

culture resultsculture results

IdentificationIdentification

and and drugdrug

susceptibilitysusceptibility

MicrobiologyMicrobiology

LaboratoryLaboratory

ImmediateImmediate healthcarehealthcare decisiondecision

BissonnetteBissonnette L and L and BergeronBergeron MG. CMI 2010. MG. CMI 2010. ModifiedModified..

RapidRapid, ,

multiparametricmultiparametric

teststests

12

h o

r mo

re12

h o

r mo

reA

pp

roxim

ate

lyA

pp

roxim

ate

ly1 h

1 h

24

h o

r mo

re24

h o

r mo

re

Ap

pro

xim

ate

lyA

pp

roxim

ate

ly1 h

1 h

AntigenAntigen teststests and/or and/or

screening screening methodsmethods

12

h o

r mo

re12

h o

r mo

re

SerologicalSerological confirmationconfirmation

ConventionalConventional

MolecularMolecular test test

hours to days

Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate alTecniche di Biologia Molecolare utilizzate al

““S.MariaS.Maria degli Angelidegli Angeli”” di Pordenonedi Pordenone

Laboratorio di Laboratorio di MicrobiologiaMicrobiologia--VirologiaVirologia

•• SEPSISEPSI•• LeptospiraLeptospira

• AntraceAntrace

MMRSARSA

VIRUS VIRUS

H1H1--N1N1

BK MDRBK MDR

Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate alTecniche di Biologia Molecolare utilizzate al

““S.MariaS.Maria degli Angelidegli Angeli”” di Pordenonedi Pordenone

Laboratorio di MicrobiologiaLaboratorio di Microbiologia--VirologiaVirologia

SEPSISEPSI

Sepsi: una complessa cascata di eventi

MEDIATORI ANTIINFIAMMATORI

AUMENTO PAI-1

ATTIVAZIONE TAFI

SOPPRESSIONE FIBRINOLISI

INFEZIONE

MEDIATORI PROINFIAMMATORI

INFIAMMAZIONE

DANNO ENDOTELIALE

ESPRESSIONE FATTORE TISSUTALE

ATTIVAZIONE DELLA COAGULAZIONE

GENERAZIONE DI TROMBINA

CONSUMO DI PROTEINA C

CARENZA DI PROTEINA C

COAGULOPATIA

OCCLUSIONE MICROVASCOLARE

IPOPERFUSIONE/ISCHEMIA

DISFUNZIONE D’ORGANO/SHOCK

MORTE

L’invasione microbica

del circolo ematico non è

indispensabile dal momento

che la diffusione sistemica

dei prodotti microbici è

sufficiente a innescare tale

reazione (LPS, peptidoglicano,

esotossine)

Scatenata dalla presenza di un

processo infettivo grave e

consistente es. polmone,

addome, vie urinarie dovuta

all’interazione tra l’agente

infettivo e l’ospite, che porta

ad una risposta infiammatoria

sistemica e abnorme, con

alterazioni emodinamiche,

respiratorie, metaboliche e

immunologiche.

• E’ una sindrome complessa che è difficile definire, diagnosticare e trattare. Alcuni dei sintomi della sepsi come la febbre o la tachicardia o la dispnea sono generici e si possono riscontrare in una serie di altre situazioni.

• Ciò crea un ritardo nella formulazione della diagnosi o addirittura la formulazione di una diagnosi errata.

L’efficacia complessiva delle emocolture èbassa ed il risultato può essere falsato da molteplici fattori:

� quantità di sangue prelevata

� Momento e frequenza di campionamento.

� Modalità e sede di prelievo dei campioni.

� Presenza di antibiotici nel flacone per terapia antibiotica

in atto

� Germi difficili o germi con esigenze colturali diverse.

� Fenomeni di autolisi (es pneumococco).

� Sviluppo e crescita estremamente lenti.

� Localizzazione endocellulare non si può mettere in

evidenza con i normali sistemi

Paolucci M, Landini MP, Sambri V. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010

EmocoltureEmocolture

Una grande limitazione delle emocolture Una grande limitazione delle emocolture èè

di avere i risultati disponibili non prima di di avere i risultati disponibili non prima di

2 giorni2 giorni..

Questo comporta lQuesto comporta l’’utilizzo di una terapia utilizzo di una terapia

antibiotica empirica.antibiotica empirica.

Turnaround timeTurnaround time mediomedio

emocolture 2010:emocolture 2010:

>90% entro 72 ore>90% entro 72 oreMedia italiana:

80% entro 96 oreGoglio A, Nicoletti P. Microbiol Med 2004; 19: 1-13

•• Nella diagnostica della sepsi laNella diagnostica della sepsi la““variabile tempovariabile tempo”” èè un un

valore di assoluta rilevanza in termini di outcome clinicovalore di assoluta rilevanza in termini di outcome clinico

•• In caso di sepsi grave la probabilitIn caso di sepsi grave la probabilitàà di sopravvivenza e di sopravvivenza e

ll’’outcome clinico si esprimono in termini di oreoutcome clinico si esprimono in termini di ore

•• Ogni giorno perso per la diagnosi aumenta di una Ogni giorno perso per la diagnosi aumenta di una –– due due

volte la probabilitvolte la probabilitàà di decesso del pazientedi decesso del paziente

•Bouza E. e altri Clin Infect Dis 2004

SepsiSepsi

<Medical Information of Eulji General Hospital Pharmacy Department July, 2008>

High-speed testing is essential for the rapid treatment

Increase of

mortality rate8%

Administration

of antibiotics

1 hr delay

Quanto piQuanto piùù ll’’accertamento eziologico in corso accertamento eziologico in corso

di sepsi avviene rapidamentedi sepsi avviene rapidamente

SepsiSepsi

tanto pitanto piùù èè possibile intervenire prontamente possibile intervenire prontamente

con una terapia corretta ed appropriatacon una terapia corretta ed appropriata

arrivare ad una concreta riduzione arrivare ad una concreta riduzione

della mortalitdella mortalitàà

PCR in batteriologiaPCR in batteriologia

�� LL’’usouso della PCR in batteriologia richiede undella PCR in batteriologia richiede un’’attenzione attenzione

differentedifferente rispetto alla PCR in virologia. rispetto alla PCR in virologia.

�� DiversiDiversi microrganismimicrorganismi sonosono presentipresenti sullasulla pellepelle oo

sullesulle superficisuperfici didi lavorolavoro

Attrezzatura di laboratorioAttrezzatura di laboratorio

• Indossare un camice monouso

• Evitare di toccare il palmo e le dita dei guanti indossandoli.

• Evitare l’esposizione della pelle. Indossare i guanti sopra le maniche del camice da laboratorio.

• In caso di contaminazione, sostituire immediatamente i guanti o trattarli con un reagente di decontaminazione del DNA

No

Yes

•• A partire da 3 ml di sangue intero in provetteA partire da 3 ml di sangue intero in provette

contenenti EDTA permette la diagnosi eziologica di contenenti EDTA permette la diagnosi eziologica di sepsi in circa sepsi in circa 55 oreore

•• Il sistema Il sistema èè una PCR una PCR realreal--timetime di tipo multiplex indi tipo multiplex in

grado di rilevare ed identificare a livello di specie ungrado di rilevare ed identificare a livello di specie un

pannello di 25 patogeni batterici e fungini,pannello di 25 patogeni batterici e fungini,

complessivamente responsabili di picomplessivamente responsabili di piùù del 90% del 90%

dei casi di sepsi dei casi di sepsi microbiologicamentemicrobiologicamente confermaticonfermati

Diagnosi molecolare di sepsi con Diagnosi molecolare di sepsi con SeptiFast SeptiFast ®® Roche DiagnosticsRoche Diagnostics

EE’’utilizzato come supportoutilizzato come supporto nella gestione di pazienti con nella gestione di pazienti con

sospetta sepsi ed altre infezioni di natura batterica o sospetta sepsi ed altre infezioni di natura batterica o micoticamicotica

del torrente circolatoriodel torrente circolatorio

in combinazionein combinazione con le evidenze cliniche e con i risultati delle con le evidenze cliniche e con i risultati delle

emocoltureemocolture ((metodo gold standardmetodo gold standard))

�� pipiùù veloceveloce : possibilit: possibilitàà di intervento terapeutico di intervento terapeutico tempestivotempestivo

�� individuaindividua patogeni vivi/morti e acido nucleicopatogeni vivi/morti e acido nucleico liberolibero

�� elevataelevata sensibilitsensibilitàà di di rilevazione dei funghirilevazione dei funghi

�� capacitcapacitàà di rilevare di rilevare infezioni multipleinfezioni multiple

VantaggiVantaggi del test vs emocoltura del test vs emocoltura

E’in grado di rilevare/identificare contemporaneamente

25 diversi patogeni (batteri e funghi) direttamente da un

singolo campione di sangue intero, senza necessità di

coltura preliminare

E’impiegato per l’identificazione di quei batteri che,

essendo già trattati con antibiotici, non potrebbero

essere rilevati con i tradizionali metodi di coltura.

Fornisce i risultati in meno di 5 ore

(contro i 2-5 giorni richiesti dalle tradizionali metodologie).

Gram (-) Gram (+) Funghi

MRSA (mecA)

Sangue intero3 mL

~ 90% ~ 90% deidei microrganismimicrorganismi isolatiisolati

PCR real-time

Purificazione del DNA

Staphylococcus epidermidis1Staphylococcus haemolyticus1Streptococcus agalactiae2Streptococcus pyogenes2Streptococcus mitis2

LightCycler LightCycler ®® SeptiSeptiFastFast

•• PresentePresente in copie multiple > in copie multiple > sensibilitsensibilitàà analiticaanalitica

•• Ben conosciuta Ben conosciuta

•• AdattaAdatta per identificazione di specie per identificazione di specie

LightCyclerLightCycler SeptiSeptiFastFast TestTestRegione target Regione target –– Internal Transcribed SpacerInternal Transcribed Spacer

si trova tra i geni per rRNA 16S e 23S dei batteri o 18S e 28S dei funghi.

primerprimer

primerprimer

Spacer Region (ITS) (Internal Transcribed Spacer)

Interpretazione automatica dei risultatiIdentificazione di specie

SepstiFast Identification Software (SIS)

LightCycler SeptiFast Test

Flusso di lavoro

Mag

NA

Lys

er

Lig

htC

ycle

r 2.0

Estrazione del campione (3 mL sangue-EDTA)

lisi meccanicapurificazione , preparazione MM e dispensazione

PCR Real-time – Analisi di melting

11

22

33

SeptiSeptiFastFast LysTestLysTest11

MagNA Lyser

SeptiSeptiFastFast PrepTestPrepTest

PurificazionePurificazione 11

SeptiSeptiFastFast TestTest 11

Th

e L

igh

tCycle

r

Instr

um

en

t

SampleNegative Control

Purified NA

Lysis Extraction

Gram (-) Gram (+) Fungi

Reagent Control

G+/G-/Fungi

The LightCycler

SeptiFast Kit

11

11

Caroselli percapillari da 100µl e 20µlCapillari

100µl and 20µlAccessoriAccessori

DispensazioneMM

Neg.Control (NC)

Amplificazione PCR in tempo reale del DNA bersaglio in 3 reazioni parallele batteri Gram positivi, batteri Gram negativi, Funghi e rivelazione con sonde di ibridazione rivelazione con sonde di ibridazione

specifiche fluorescentispecifiche fluorescenti

22

LightCycler2.0

LightCycler 2.0 IVDLightCycler 2.0 IVD

CaratteristicheCaratteristiche

Rapida identificazione del prodotto con l’analisi della Melting-Curve

Monitoraggio della fluorescenza in tempo reale

Eliminazione dei rischi di contaminazione

Termociclazione ad alta velocità

Analisi muliplex/

multicolor detection

Software versatile

LightCycler

Termociclazione accurata

e rapida• Riscaldamento ad

aria

• Capillari in borosilicato

Identificazione automatica delle

specie e dei controlli

mediante softwere dedicato.

33

SeptiFast Identification Software SeptiFast Identification Software

InterpretazioneInterpretazione automaticaautomatica deidei datidati

Turnaround timeTurnaround time (TAT) medio (TAT) medio

a confronto in rapporto agli isolati a confronto in rapporto agli isolati

rilevato a Pordenonerilevato a Pordenone

8484±±121236 36 ±±121214 ( 5/29 )14 ( 5/29 )COCCHI GRAM +COCCHI GRAM +

8484±±121236 36 ±±121214 ( 5/29 )14 ( 5/29 )BACILLI GRAM BACILLI GRAM --

96 96 ±±12 12 36 36 ±±121214 ( 5/29 )14 ( 5/29 )FUNGHIFUNGHI

Identificazione Identificazione

biochimicabiochimicaColorazione di Colorazione di

GRAMGRAMSeptiFast SeptiFast

(range)(range)MicrorganismoMicrorganismo

Diamante et al Diamante et al RIMeLRIMeL / IJLaM 2010/ IJLaM 2010

Test molecolare diretto:Test molecolare diretto:

Il tempo necessario per Il tempo necessario per refertarerefertare un un

risultato negativo con lrisultato negativo con l’’emocoltura emocoltura èè

stabilito dagli standard CLSI stabilito dagli standard CLSI (Clinical and (Clinical and

Laboratori Standard Laboratori Standard InstituteInstitute, 2007), 2007) in 7 giorni. in 7 giorni.

risposta negativa in 5 hrisposta negativa in 5 h

�� Il Il valore predittivo negativovalore predittivo negativo èè elevato. E gielevato. E giàà questo questo

giustifica ampiamente lgiustifica ampiamente l’’utilizzo del test.utilizzo del test.

�� Nel caso di SeptiFast, la sensibilitNel caso di SeptiFast, la sensibilitàà appare comunque appare comunque

nettamente superiorenettamente superiore a quella espressa dallaa quella espressa dalla

emocolturaemocoltura. .

�� Non influenzata dalla terapia antibiotica e/o Non influenzata dalla terapia antibiotica e/o antimicoticaantimicotica

�� Non consente Non consente (perch(perchéé non sono disponibili i rispettivi non sono disponibili i rispettivi

target) di identificare alcuni microrganismi. target) di identificare alcuni microrganismi.

�� Consente di ottenere Consente di ottenere solo unsolo un’’identificazione diidentificazione di specie specie

e e non un test di sensibilitnon un test di sensibilitàà..

PCR vs EMOCOLTURA: pro e controPCR vs EMOCOLTURA: pro e contro

Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011

SepsiSIRSInfezione/Trauma

Sepsi

Grave

Shock

Settico

SIRS = Systemic Inflammatory Response Syndromenon necessariamente a eziologia infettiva

Temperatura > 38°C o < 36°C Battito > 90 battiti / minRespirazione > 20 / min o PaCO2 <32 mm HgLeucociti > 12.000/mm3 o < 4.000/mm3 or >10 % immature

SEPSI=risposta infiammatoria sistemica ad una infezione accertataSIRS più infezione e sito di infezione documentato

SEPSI GRAVE= Sepsi associate a disfunzione d’organo e ipoperfusione o ipotensione

MODS

Indicazioni per l'utilizzo delIndicazioni per l'utilizzo del SeptiSeptiFastFast

*Casalta*Casalta et alet al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009

** Varani et al** Varani et al. Journal of Infection 2009

sepsi/sepsi grave/shock setticosepsi/sepsi grave/shock settico

criteri SIRS criteri SIRS ++ diagnosi accertata o sospetta di infezione diagnosi accertata o sospetta di infezione

±± disfunzionedisfunzione dd’’organoorgano

��Sospetta endocardite* e/o Sospetta endocardite* e/o infezioni da protesi endovascolariinfezioni da protesi endovascolari

��Pazienti con quadro clinico di polmonitePazienti con quadro clinico di polmonite

��Infezioni di cute e tessuti molliInfezioni di cute e tessuti molli

��Pazienti settici immunodepressi**Pazienti settici immunodepressi**

��Sospetta infezione fungina invasiva Sospetta infezione fungina invasiva

��Pazienti Pazienti non non responderresponder alla terapia (anzichalla terapia (anzichéé colturale dopo colturale dopo

washwash--outout) )

DallDall’’esperienza clinica sperimentale esperienza clinica sperimentale

alla condivisione di un percorso diagnosticoalla condivisione di un percorso diagnostico

nei pazienti candidati ad impianto nei pazienti candidati ad impianto

di di endoprotesiendoprotesi aortica.aortica.

Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011

MRSA

MMultidrugultidrug Resistant Resistant S.aureusS.aureus ((MRSA) MRSA)

MRSAMRSA èè attualmente il patogeno attualmente il patogeno

antibioticoantibiotico--resistente piresistente piùù comune comune

identificato negli ospedali in molte identificato negli ospedali in molte

parti del mondo.parti del mondo.

Gordon RJ and Lowry FD. CID, 2008

�� ApproximatelyApproximately 20% of 20% of individualsindividuals are are

persistentlypersistently nasallynasally colonizedcolonized withwith S.aureusS.aureus

and 30% are and 30% are intermittentlyintermittently colonizedcolonized..

�� ColonizationColonization clearlyclearly increasesincreases the the riskrisk forfor

subsequentsubsequent infectioninfection..

Gordon RJ and Lowy FD. CID, 2008Werthein HF et al. Lancet Infect Dis, 2005

MRSA MRSA epidemiologyepidemiology and and

backgroundbackground

Lo studio ISABEL (Italian Staphylococcus Aureus Benchmarketed Epidemiology),

che tra settembre 2004 e maggio 2005 ha arruolato 3648 pazienti in 27 ICU(Unità di Terapia Intensiva),

italiane ha dimostrato nei pazienti positiviallo screening al momento del ricovero una% di malattia da MRSA pari al doppiorispetto ai pazienti negativi ed una % quasi 10 volte superiore durante la degenza.

PROTOCOLLO PER LA SORVEGLIANZA DI MRSA IN AOSMA.Comitato infeioni settembre 2008

SOLUZIONESOLUZIONE

RidurreRidurre le le infezioniinfezioni associate associate allall’’RMSARMSA

mediantemediante unauna rapidarapida eded attivaattiva sorveglianzasorveglianza..

� Scrupolosa igiene delle mani

� Adeguati programmi di controllo dell’uso degli antibiotici (antibiotic stewardship)

� Sorveglianza attiva per l’identificazione di pazienti con infezione e/o colonizzazione

� Eventuale decolonizzazione e isolamento del paziente colonizzato.

Procedure adottate per il contenimento Procedure adottate per il contenimento

della diffusione di MRSA della diffusione di MRSA

nelle strutture sanitarie. nelle strutture sanitarie.

Precauzioni da contatto e sorveglianzaPrecauzioni da contatto e sorveglianza

attiva attiva ottenuta con lo screening ottenuta con lo screening hanno la hanno la

capacitcapacitàà di ridurre morbilitdi ridurre morbilitàà e mortalite mortalitàà

nei pazienti risultati colonizzati.nei pazienti risultati colonizzati.

Questi pazienti, infatti, se Questi pazienti, infatti, se non individuati non individuati tempestivamentetempestivamente, possono essere esposti , possono essere esposti a un maggiore rischio di sviluppare a un maggiore rischio di sviluppare unun’’infezione MRSA correlata durante la infezione MRSA correlata durante la degenza, soprattutto in contesti ad elevata degenza, soprattutto in contesti ad elevata criticitcriticitàà, quali ad esempio le Unit, quali ad esempio le Unitàà di di Terapia Intensiva (ICU).Terapia Intensiva (ICU).

Inoltre, Inoltre, èè dimostrato che i pazienti dimostrato che i pazienti

asintomaticiasintomatici colonizzaticolonizzati rappresentano rappresentano

la pila piùù efficace fonteefficace fonte di trasmissione di di trasmissione di

MRSA nelle strutture sanitarie. MRSA nelle strutture sanitarie.

GeneXpertGeneXpert

GeneXpertGeneXpert automatizza le fasi di automatizza le fasi di

preparazione del campione eseguendo preparazione del campione eseguendo

tutti gli step necessari alltutti gli step necessari all’’estrazione ed alla estrazione ed alla

realreal time PCR, mediante un sistema time PCR, mediante un sistema

avanzato di cartuccia microfluidica.avanzato di cartuccia microfluidica.

La base di questa tecnologia sono le La base di questa tecnologia sono le cartucciecartuccie

brevettatebrevettate monouso che nelle differenti camere monouso che nelle differenti camere

contengono tutti i reagenti in forma liofilizzata contengono tutti i reagenti in forma liofilizzata

necessari allnecessari all’’estrazioneestrazione e alle all’’amplificazione in amplificazione in

realreal time PCR del target. time PCR del target.

La cartuccia deve essere ricostituita allLa cartuccia deve essere ricostituita all’’inzioinzio

delldell’’esperimento aggiungendo nelle diverse esperimento aggiungendo nelle diverse

camere le camere le soluzioni fornite con la cartuccia soluzioni fornite con la cartuccia

stessa (stessa (unico step manuale della metodicaunico step manuale della metodica). ).

�� GeneXpertGeneXpert èè un sistema che un sistema che automatizza i automatizza i

tre processi necessari per eseguire una tre processi necessari per eseguire una

realreal time PCRtime PCR: preparazione del campione, : preparazione del campione,

amplificazione e rilevamento.amplificazione e rilevamento.

�� EE’’un sistema modulare che consente di un sistema modulare che consente di

eseguire da eseguire da 1 a 4 analisi1 a 4 analisi

contemporaneamente anche per differenti contemporaneamente anche per differenti

analitianaliti. .

Il software del Il software del GeneXpertGeneXpert èè

completamente automatico ed elimina le completamente automatico ed elimina le

problematiche relative alla soggettiva problematiche relative alla soggettiva

interpretazione dei risultati.interpretazione dei risultati.

I risultati qualitativi sono visualizzabili I risultati qualitativi sono visualizzabili

mediante le curve di mediante le curve di RealReal Time PCR che Time PCR che

appaiono a monitor per ogni modulo dello appaiono a monitor per ogni modulo dello

strumento.strumento.

XpertXpert®® MRSAMRSA provvedeprovvede a dare a dare unauna

rispostarisposta in in 66 66 minutiminuti circacirca controcontro ii

due/tre giornidue/tre giorni deidei metodi colturali.metodi colturali.

�� Analisi eseguita con metodo molecolare rapido Analisi eseguita con metodo molecolare rapido

((GeneXpertGeneXpert--CepheidCepheid) e ) e refertatarefertata in giornatain giornata..

�� Identificazione tempestiva di eventuale Identificazione tempestiva di eventuale

colonizzazione nasale da MRSA in tutti i pazienti colonizzazione nasale da MRSA in tutti i pazienti

che che afferisconoafferiscono in ICU.in ICU.

PROTOCOLLO DI SORVEGLIANZA PROTOCOLLO DI SORVEGLIANZA

PER MRSA IN ICUPER MRSA IN ICU

Il Il monitoraggio individua tempestivamentemonitoraggio individua tempestivamente

eventuali portatori di MRSA, mettendo in eventuali portatori di MRSA, mettendo in

atto atto immediatamente tutte le procedureimmediatamente tutte le procedure

previste per la decolonizzazione e previste per la decolonizzazione e

ll’’isolamento del paziente e per indirizzare isolamento del paziente e per indirizzare

in modo tempestivo e mirato la terapia in in modo tempestivo e mirato la terapia in

caso di sviluppo di malattia infettiva caso di sviluppo di malattia infettiva

correlabile a MRSA.correlabile a MRSA.

In caso di positivitIn caso di positivitààper MRSAper MRSA

• Decolonizzazione nasale con mupirocina (Bactrobanpomata) endonasale (3 applicazioni/die per 5 gg).

• Decolonizzazione generale con clorexidina gluconato al 5% (Neoxene Soluz 5%), una volta al giorno per 5 gg.

• Isolamento del paziente in stanza singola o per coorte e applicazione delle precauzioni da contatto.

In caso di insorgenza di In caso di insorgenza di

malattia da infezionemalattia da infezione

• Campionamento microbiologico rapportato alla sede di infezione

• Inizio trattamento con vancomicina o altro farmaco anti-MRSA, da scegliersi in base alla farmacocineticarapportata al sito di infezione e alla MIC rilevata, se disponibile.

Num

ber

of patie

nts

Num

ber

of patie

nts

MRSA NASAL CARRIERS MRSA NASAL CARRIERS

(ICU, Mar 09(ICU, Mar 09-- SeptSept 10)10)

26 (7%)

350376

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1

MRSAP

MRSAN

TOT ADMISSIONS

RESPIRATORIRESPIRATORI

Virus Virus

H1H1--N1N1

Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate alTecniche di Biologia Molecolare utilizzate al

““S.MariaS.Maria degli Angelidegli Angeli”” di Pordenonedi Pordenone

Laboratorio di MicrobiologiaLaboratorio di Microbiologia--VirologiaVirologia

VIROLOGIA VIROLOGIA

RespiratoriRespiratori

Infezioni respiratorie acuteInfezioni respiratorie acute sono sono

la principale causa di malattia nel la principale causa di malattia nel

mondomondoHerman Goossens BMJ 2006

Le infezioni delle basse vie respiratorie LRTILe infezioni delle basse vie respiratorie LRTI

((lowerlower respiratoryrespiratory tracttract infectionsinfections)) sono le pisono le piùù comuni infezioni di comuni infezioni di

adulti e bambini.adulti e bambini.

Murdoch DR. APMIS 112: 713–27, 2004

La La popolazione pipopolazione piùù a rischioa rischio per lo sviluppo per lo sviluppo

di una malattia respiratoria fatale sono di una malattia respiratoria fatale sono bambini, bambini,

anzianianziani ed ed immunocompromessi.immunocompromessi.

Herman Goossens BMJ 2006

Se Se la diagnosi clinicala diagnosi clinica di LRTI di LRTI èè relativamente facile relativamente facile

da fare, da fare, determinare ldeterminare l’’agente eziologico responsabile agente eziologico responsabile

può essere pipuò essere piùù difficiledifficile a causa dei test diagnostici a causa dei test diagnostici

convenzionali limitaticonvenzionali limitatiMurdoch DR. APMIS 112: 713–27, 2004

Durante gli anni recenti un notevole numero Durante gli anni recenti un notevole numero di di

agenti respiratori sconosciutiagenti respiratori sconosciuti sono stati scoperti e di sono stati scoperti e di

questi, questi, le culture in vitro sono o molto lunghe o le culture in vitro sono o molto lunghe o

irrealizzabili.irrealizzabili.Ieven, M. J Clin Virol. 2007

In generale solo nel In generale solo nel 50%50% dei casi ldei casi l’’agente eziologico agente eziologico

viene identificatoviene identificatoLoens K et al. J Clin Microbiol 2009

I test I test tradizionali virologici e tradizionali virologici e sierologicisierologici per la per la

determinazione di determinazione di microorganismimicroorganismi responsabili di responsabili di

polmoniti hanno una polmoniti hanno una bassa sensibilitbassa sensibilitàà, necessitano , necessitano

didi molto tempomolto tempo per la loro identificazione edper la loro identificazione ed

individuano solo uno o alcuniindividuano solo uno o alcuni dei numerosi dei numerosi

agenti eziologiciagenti eziologici

Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008

Nuova filosofia e organizzazione Nuova filosofia e organizzazione

in Virologiain Virologia

�� Passaggio da una Passaggio da una ““filosofia colturalefilosofia colturale”” a una a una

““filosofia molecolarefilosofia molecolare””..

�� Acquisizione di nuove Acquisizione di nuove tecnologietecnologie. .

Nel solo 2008Nel solo 2008 sono state introdotte sono state introdotte 25 nuove 25 nuove

diagnostiche molecolaridiagnostiche molecolari, che garantiscono oggi , che garantiscono oggi il piil piùù

esteso esteso panelpanel di diagnostiche molecolari del di diagnostiche molecolari del

Dipartimento Dipartimento e la massima efficienza ed efficacia la massima efficienza ed efficacia

diagnostica in numerosi contesti clinici. diagnostica in numerosi contesti clinici.

Con le colture cellulari il TAT Con le colture cellulari il TAT

di una risposta negativa di una risposta negativa èè

tra i 10/15 giornitra i 10/15 giorni

In Europa il In Europa il 90/95%90/95% degli antibiotici viene usato degli antibiotici viene usato al di al di

fuorifuori delle strutture ospedaliere e delle strutture ospedaliere e la gran partela gran parte viene viene

prescritta per le infezioni delle basse vie respiratorie prescritta per le infezioni delle basse vie respiratorie

acquisite in comunitacquisite in comunitàà..Herman Goossens BMJ 2006

Pneumonia in Pneumonia in immunoimmuno--competentcompetent adultsadultsNational Standard National Standard MethodMethod

Multiplex Multiplex

RealReal Time PCRTime PCR

Multiplex Multiplex

RealReal Time PCRTime PCR

•• Parainfluenza virus 1Parainfluenza virus 1Parainfluenza virus 2Parainfluenza virus 2Parainfluenza virus 3Parainfluenza virus 3AdenovirusAdenovirus A/B/C/D/EA/B/C/D/ECoronavirus 229E/NL63Coronavirus 229E/NL63

•• CoronavirusCoronavirus OC43OC43RhinovirusRhinovirus A/B/C A/B/C Influenza A virusInfluenza A virusRSV ARSV ARSV BRSV B

•• BocavirusBocavirus 1/2/3/41/2/3/4Influenza B virusInfluenza B virusParainfluenza virus 4Parainfluenza virus 4EnterovirusEnterovirus

4 ore e 154 ore e 15

elettrodielettrodi

gelgel

SeeplexSeeplex®®

RV 15 ONE STEPRV 15 ONE STEP

Parainfluenza virus 1Parainfluenza virus 1

Parainfluenza virus 2Parainfluenza virus 2

Parainfluenza virus 3Parainfluenza virus 3

AdenovirusAdenovirus A/B/C/D/EA/B/C/D/E

Coronavirus 229E/NL63Coronavirus 229E/NL63

CoronavirusCoronavirus OC43OC43

RhinovirusRhinovirus A/B/C A/B/C

Influenza A virusInfluenza A virus

RSV ARSV A

RSV BRSV B

BocavirusBocavirus 1/2/3/41/2/3/4

Influenza B virusInfluenza B virus

Parainfluenza virus 4Parainfluenza virus 4

EnterovirusEnterovirus

M.pneumoniaeM.pneumoniae

C.pneumoniaeC.pneumoniae

L.pneumophilaL.pneumophila

S.pneumoniaeS.pneumoniae

H.influenzaeH.influenzae

B.pertussisB.pertussis

DualDual PrimingPriming

OligonucleotideOligonucleotide

technologytechnology((SeegeneSeegene))

Infezioni respiratorie ad eziologia virale a Infezioni respiratorie ad eziologia virale a

Pordenone: Pordenone:

gennaio 2010gennaio 2010-- ottobre 2011ottobre 2011

2010 test eseguiti con RV12 SEEGENE

0

20

40

60

80

100

120

gennaio aprile luglio ottobre

CORON

ADE

RHINO

MPV

PIV

INFLB

INFLA

RSV

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

gennaio marzo maggio luglio settembre

ENTERO

BOCA

CORON

ADE

RHINO

MPV

PIV

INFLB

INFLA

RSV

2011 test eseguiti con RV15 SEEGENE

InfluenzaInfluenza virus virus typetype A and B, A and B, parainfluenzaparainfluenza

virus virus typetype 1, 2, 3, 1, 2, 3, respiratoryrespiratory syncytialsyncytial virusvirus

(RSV) (RSV) typetype A and B, and A and B, and adenovirusadenovirus are major are major

causescauses of of lowerlower respiratoryrespiratory tracttract infectionsinfections in in

infantsinfants and and youngyoung childrenchildren under 5 under 5 yryr old. old.

HumanHuman metapneumovirusmetapneumovirus, , alsoalso identifiedidentified in in

childrenchildren withwith respiratoryrespiratory infectioninfection, , rhinovirusrhinovirus, ,

and and coronaviruscoronavirus are are knownknown asas causative causative

agentsagents of the common of the common coldcold..

Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008

La disponibilitLa disponibilitàà di di metodi rapidi per la metodi rapidi per la

diagnosi virale diagnosi virale permetterpermetteràà dd’’ora in poi ora in poi

di decidere in modo di decidere in modo pipiùù accurato il accurato il

trattamento, riducendo costrattamento, riducendo cosìì ll’’uso di uso di inutiliinutili

agenti antimicrobici ed abbreviando i agenti antimicrobici ed abbreviando i

tempi di ospedalizzazione tempi di ospedalizzazione per i pazienti.per i pazienti.

Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

Tecniche Tecniche

convenzionaliconvenzionali

TecnicheTecniche

molecolarimolecolari