Applicazioni cliniche in Microbiologia - fitelab.it · Microbiology Laboratory Results of analyses...
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Applicazioni cliniche in Applicazioni cliniche in
MicrobiologiaMicrobiologia
Diamante Paola Microbiologia e Virologia - Pordenone
SFIDASFIDA
Ridurre il tempo analiticoRidurre il tempo analiticorispetto alle procedure standard,rispetto alle procedure standard,
in modo da ottenerein modo da otteneresostanziali beneficisostanziali benefici
per la gestione delle malattie infettive.per la gestione delle malattie infettive.
Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.
Camporese A. Inf Med 2004;12:118-125
In questo modo i risultati di In questo modo i risultati di
microbiologia diventano microbiologia diventano
sempre sempre pipiùù utili in termini utili in termini
clinici.clinici.
Raggiungere lRaggiungere l’’obbiettivo obbiettivo èè possibile,possibile,
mediante nuove tecnologie, automazionemediante nuove tecnologie, automazione
e test rapidi in grado di migliorare il flusso e test rapidi in grado di migliorare il flusso
di lavoro provvedendo nello stesso tempodi lavoro provvedendo nello stesso tempo
a mantenere a mantenere ll’’alta qualitalta qualitàà dei risultati. dei risultati.
Camporese A. Inf Med 2004;12:118-125
La rapiditLa rapiditàà delle delle tecniche Molecolari tecniche Molecolari
combinate con lcombinate con l’’automazione e con un piautomazione e con un piùù
facile utilizzo dei software, ha permesso facile utilizzo dei software, ha permesso
anche nella pratica microbiologica,una anche nella pratica microbiologica,una
significativa diffusione di strumentazione significativa diffusione di strumentazione
ad esse dedicate.ad esse dedicate.
Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology. Tang, Yi-Wei; Stratton, Charles W. (Eds), 2006.
PhysiciansPhysicians embracedembraced anan empiricalempirical approachapproach
to the management of to the management of manymany infectiousinfectious
diseasesdiseases, , favouringfavouring overuseoveruse of of antibioticsantibiotics..
Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.
InfectiousInfectious diseasesdiseases diagnosisdiagnosis and and
empiricalempirical approachapproach
Ancor oggiAncor oggi i tempi necessari per giungere alla i tempi necessari per giungere alla
identificazione del patogeno e al rilevamento identificazione del patogeno e al rilevamento
delle relative resistenze, delle relative resistenze, implicano una implicano una
terapia antibiotica empirica ad ampio spettroterapia antibiotica empirica ad ampio spettro
basata sullbasata sull’’epidemiologia del reparto e sui epidemiologia del reparto e sui
fattori di rischio del paziente.fattori di rischio del paziente.
Questo comporta un Questo comporta un aumentato rischioaumentato rischio di di
effetti collaterali avversieffetti collaterali avversi, favorisce , favorisce ll’’insorgenza insorgenza
di resistenzadi resistenza ai farmaci antibatterici,ai farmaci antibatterici,
induce un generale induce un generale incremento della mortalitincremento della mortalitàà
ed ed aumenta i costiaumenta i costi di gestione dei pazienti.di gestione dei pazienti.
•• Evitare un trattamento antibiotico empirico.Evitare un trattamento antibiotico empirico.
•• Permettere un utilizzo piPermettere un utilizzo piùù ristrettoristretto dello dello spettro di spettro di antibiotici disponibili o un uso piantibiotici disponibili o un uso piùù
appropriato appropriato di di farmaci antivirali.farmaci antivirali.
•• Provvedere ad una piProvvedere ad una piùù accurata accurata informazione informazione epidemiologicaepidemiologica per provvedere a formulare per provvedere a formulare raccomandazioni e terapie appropriate.raccomandazioni e terapie appropriate.
•• Diminuire i tempiDiminuire i tempi di ospedalizzazione e di ospedalizzazione e ridurre i costiridurre i costi di gestione.di gestione.
Obbiettivi di una diagnosi eziologicaObbiettivi di una diagnosi eziologica
Ieven, M. J Clin Virol. 2007
LL’’approccio diagnostico basato sui test approccio diagnostico basato sui test
MolecolariMolecolari costituisce il costituisce il principale strumentoprincipale strumento
che può alleviare dal bisogno di colture eche può alleviare dal bisogno di colture e
consentire consentire ll’’dentificazionedentificazione di uno o pidi uno o piùù
patogeni da uno spettro di patogeni da uno spettro di microorganismimicroorganismi
associati ad una sindrome infettiva.associati ad una sindrome infettiva.
Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.
Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.
In casi di sindromi cliniche particolari come In casi di sindromi cliniche particolari come
la la sepsisepsi, possono aiutare a individuare , possono aiutare a individuare
velocemente una situazione in cui la terapia velocemente una situazione in cui la terapia
antibatterica antibatterica èè rilevante.rilevante.
Nelle Nelle infezioni virali deinfezioni virali dellelle basse vie basse vie
respiratorie,respiratorie, può limitare la prescrizionepuò limitare la prescrizione
di terapie antibatteriche e la necessitdi terapie antibatteriche e la necessitàà di di
test addizionali.test addizionali.
Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.
EntranceEntrance intointo the diagnostic the diagnostic cyclecycle ((00––6 6 hourshours): ):
patient patient arrivalarrival, , triagetriage, , primaryprimary evaluationevaluation, , questionnairequestionnaire and and physicalphysical examinationexamination byby physicianphysician, ,
presumptivepresumptive diagnosisdiagnosis, , physicianphysician laboratorylaboratory analysisanalysis requestrequest(s), clinical (s), clinical samplingsampling, transfer to , transfer to laboratorieslaboratories, etc., etc.
ConventionalConventional diagnosticsdiagnosticsMolecularMolecular diagnosticsdiagnostics
in in MicrobiologyMicrobiology and and VirologyVirology
MicrobiologyMicrobiology
LaboratoryLaboratory
Results of Results of analysesanalyses and and healthcarehealthcare decisiondecision processprocess (hours to days):transmissiontransmission of results, of results, interpretationinterpretation, patient management, , patient management, therapeutictherapeutic
interventionintervention, , confirmatoryconfirmatory testingtesting, treatment , treatment adjustmentadjustment, etc., etc.
Positive Positive
culture resultsculture results
IdentificationIdentification
and and drugdrug
susceptibilitysusceptibility
MicrobiologyMicrobiology
LaboratoryLaboratory
ImmediateImmediate healthcarehealthcare decisiondecision
BissonnetteBissonnette L and L and BergeronBergeron MG. CMI 2010. MG. CMI 2010. ModifiedModified..
RapidRapid, ,
multiparametricmultiparametric
teststests
12
h o
r mo
re12
h o
r mo
reA
pp
roxim
ate
lyA
pp
roxim
ate
ly1 h
1 h
24
h o
r mo
re24
h o
r mo
re
Ap
pro
xim
ate
lyA
pp
roxim
ate
ly1 h
1 h
AntigenAntigen teststests and/or and/or
screening screening methodsmethods
12
h o
r mo
re12
h o
r mo
re
SerologicalSerological confirmationconfirmation
ConventionalConventional
MolecularMolecular test test
hours to days
Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate alTecniche di Biologia Molecolare utilizzate al
““S.MariaS.Maria degli Angelidegli Angeli”” di Pordenonedi Pordenone
Laboratorio di Laboratorio di MicrobiologiaMicrobiologia--VirologiaVirologia
•• SEPSISEPSI•• LeptospiraLeptospira
• AntraceAntrace
MMRSARSA
VIRUS VIRUS
H1H1--N1N1
BK MDRBK MDR
Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate alTecniche di Biologia Molecolare utilizzate al
““S.MariaS.Maria degli Angelidegli Angeli”” di Pordenonedi Pordenone
Laboratorio di MicrobiologiaLaboratorio di Microbiologia--VirologiaVirologia
Sepsi: una complessa cascata di eventi
MEDIATORI ANTIINFIAMMATORI
AUMENTO PAI-1
ATTIVAZIONE TAFI
SOPPRESSIONE FIBRINOLISI
INFEZIONE
MEDIATORI PROINFIAMMATORI
INFIAMMAZIONE
DANNO ENDOTELIALE
ESPRESSIONE FATTORE TISSUTALE
ATTIVAZIONE DELLA COAGULAZIONE
GENERAZIONE DI TROMBINA
CONSUMO DI PROTEINA C
CARENZA DI PROTEINA C
COAGULOPATIA
OCCLUSIONE MICROVASCOLARE
IPOPERFUSIONE/ISCHEMIA
DISFUNZIONE D’ORGANO/SHOCK
MORTE
L’invasione microbica
del circolo ematico non è
indispensabile dal momento
che la diffusione sistemica
dei prodotti microbici è
sufficiente a innescare tale
reazione (LPS, peptidoglicano,
esotossine)
Scatenata dalla presenza di un
processo infettivo grave e
consistente es. polmone,
addome, vie urinarie dovuta
all’interazione tra l’agente
infettivo e l’ospite, che porta
ad una risposta infiammatoria
sistemica e abnorme, con
alterazioni emodinamiche,
respiratorie, metaboliche e
immunologiche.
• E’ una sindrome complessa che è difficile definire, diagnosticare e trattare. Alcuni dei sintomi della sepsi come la febbre o la tachicardia o la dispnea sono generici e si possono riscontrare in una serie di altre situazioni.
• Ciò crea un ritardo nella formulazione della diagnosi o addirittura la formulazione di una diagnosi errata.
L’efficacia complessiva delle emocolture èbassa ed il risultato può essere falsato da molteplici fattori:
� quantità di sangue prelevata
� Momento e frequenza di campionamento.
� Modalità e sede di prelievo dei campioni.
� Presenza di antibiotici nel flacone per terapia antibiotica
in atto
� Germi difficili o germi con esigenze colturali diverse.
� Fenomeni di autolisi (es pneumococco).
� Sviluppo e crescita estremamente lenti.
� Localizzazione endocellulare non si può mettere in
evidenza con i normali sistemi
Paolucci M, Landini MP, Sambri V. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010
EmocoltureEmocolture
Una grande limitazione delle emocolture Una grande limitazione delle emocolture èè
di avere i risultati disponibili non prima di di avere i risultati disponibili non prima di
2 giorni2 giorni..
Questo comporta lQuesto comporta l’’utilizzo di una terapia utilizzo di una terapia
antibiotica empirica.antibiotica empirica.
Turnaround timeTurnaround time mediomedio
emocolture 2010:emocolture 2010:
>90% entro 72 ore>90% entro 72 oreMedia italiana:
80% entro 96 oreGoglio A, Nicoletti P. Microbiol Med 2004; 19: 1-13
•• Nella diagnostica della sepsi laNella diagnostica della sepsi la““variabile tempovariabile tempo”” èè un un
valore di assoluta rilevanza in termini di outcome clinicovalore di assoluta rilevanza in termini di outcome clinico
•• In caso di sepsi grave la probabilitIn caso di sepsi grave la probabilitàà di sopravvivenza e di sopravvivenza e
ll’’outcome clinico si esprimono in termini di oreoutcome clinico si esprimono in termini di ore
•• Ogni giorno perso per la diagnosi aumenta di una Ogni giorno perso per la diagnosi aumenta di una –– due due
volte la probabilitvolte la probabilitàà di decesso del pazientedi decesso del paziente
•Bouza E. e altri Clin Infect Dis 2004
SepsiSepsi
<Medical Information of Eulji General Hospital Pharmacy Department July, 2008>
High-speed testing is essential for the rapid treatment
Increase of
mortality rate8%
Administration
of antibiotics
1 hr delay
Quanto piQuanto piùù ll’’accertamento eziologico in corso accertamento eziologico in corso
di sepsi avviene rapidamentedi sepsi avviene rapidamente
SepsiSepsi
tanto pitanto piùù èè possibile intervenire prontamente possibile intervenire prontamente
con una terapia corretta ed appropriatacon una terapia corretta ed appropriata
arrivare ad una concreta riduzione arrivare ad una concreta riduzione
della mortalitdella mortalitàà
PCR in batteriologiaPCR in batteriologia
�� LL’’usouso della PCR in batteriologia richiede undella PCR in batteriologia richiede un’’attenzione attenzione
differentedifferente rispetto alla PCR in virologia. rispetto alla PCR in virologia.
�� DiversiDiversi microrganismimicrorganismi sonosono presentipresenti sullasulla pellepelle oo
sullesulle superficisuperfici didi lavorolavoro
Attrezzatura di laboratorioAttrezzatura di laboratorio
• Indossare un camice monouso
• Evitare di toccare il palmo e le dita dei guanti indossandoli.
• Evitare l’esposizione della pelle. Indossare i guanti sopra le maniche del camice da laboratorio.
• In caso di contaminazione, sostituire immediatamente i guanti o trattarli con un reagente di decontaminazione del DNA
No
Yes
•• A partire da 3 ml di sangue intero in provetteA partire da 3 ml di sangue intero in provette
contenenti EDTA permette la diagnosi eziologica di contenenti EDTA permette la diagnosi eziologica di sepsi in circa sepsi in circa 55 oreore
•• Il sistema Il sistema èè una PCR una PCR realreal--timetime di tipo multiplex indi tipo multiplex in
grado di rilevare ed identificare a livello di specie ungrado di rilevare ed identificare a livello di specie un
pannello di 25 patogeni batterici e fungini,pannello di 25 patogeni batterici e fungini,
complessivamente responsabili di picomplessivamente responsabili di piùù del 90% del 90%
dei casi di sepsi dei casi di sepsi microbiologicamentemicrobiologicamente confermaticonfermati
Diagnosi molecolare di sepsi con Diagnosi molecolare di sepsi con SeptiFast SeptiFast ®® Roche DiagnosticsRoche Diagnostics
EE’’utilizzato come supportoutilizzato come supporto nella gestione di pazienti con nella gestione di pazienti con
sospetta sepsi ed altre infezioni di natura batterica o sospetta sepsi ed altre infezioni di natura batterica o micoticamicotica
del torrente circolatoriodel torrente circolatorio
in combinazionein combinazione con le evidenze cliniche e con i risultati delle con le evidenze cliniche e con i risultati delle
emocoltureemocolture ((metodo gold standardmetodo gold standard))
�� pipiùù veloceveloce : possibilit: possibilitàà di intervento terapeutico di intervento terapeutico tempestivotempestivo
�� individuaindividua patogeni vivi/morti e acido nucleicopatogeni vivi/morti e acido nucleico liberolibero
�� elevataelevata sensibilitsensibilitàà di di rilevazione dei funghirilevazione dei funghi
�� capacitcapacitàà di rilevare di rilevare infezioni multipleinfezioni multiple
VantaggiVantaggi del test vs emocoltura del test vs emocoltura
E’in grado di rilevare/identificare contemporaneamente
25 diversi patogeni (batteri e funghi) direttamente da un
singolo campione di sangue intero, senza necessità di
coltura preliminare
E’impiegato per l’identificazione di quei batteri che,
essendo già trattati con antibiotici, non potrebbero
essere rilevati con i tradizionali metodi di coltura.
Fornisce i risultati in meno di 5 ore
(contro i 2-5 giorni richiesti dalle tradizionali metodologie).
Gram (-) Gram (+) Funghi
MRSA (mecA)
Sangue intero3 mL
~ 90% ~ 90% deidei microrganismimicrorganismi isolatiisolati
PCR real-time
Purificazione del DNA
Staphylococcus epidermidis1Staphylococcus haemolyticus1Streptococcus agalactiae2Streptococcus pyogenes2Streptococcus mitis2
LightCycler LightCycler ®® SeptiSeptiFastFast
•• PresentePresente in copie multiple > in copie multiple > sensibilitsensibilitàà analiticaanalitica
•• Ben conosciuta Ben conosciuta
•• AdattaAdatta per identificazione di specie per identificazione di specie
LightCyclerLightCycler SeptiSeptiFastFast TestTestRegione target Regione target –– Internal Transcribed SpacerInternal Transcribed Spacer
si trova tra i geni per rRNA 16S e 23S dei batteri o 18S e 28S dei funghi.
primerprimer
primerprimer
Spacer Region (ITS) (Internal Transcribed Spacer)
Interpretazione automatica dei risultatiIdentificazione di specie
SepstiFast Identification Software (SIS)
LightCycler SeptiFast Test
Flusso di lavoro
Mag
NA
Lys
er
Lig
htC
ycle
r 2.0
Estrazione del campione (3 mL sangue-EDTA)
lisi meccanicapurificazione , preparazione MM e dispensazione
PCR Real-time – Analisi di melting
11
22
33
Th
e L
igh
tCycle
r
Instr
um
en
t
SampleNegative Control
Purified NA
Lysis Extraction
Gram (-) Gram (+) Fungi
Reagent Control
G+/G-/Fungi
The LightCycler
SeptiFast Kit
11
11
Caroselli percapillari da 100µl e 20µlCapillari
100µl and 20µlAccessoriAccessori
DispensazioneMM
Neg.Control (NC)
Amplificazione PCR in tempo reale del DNA bersaglio in 3 reazioni parallele batteri Gram positivi, batteri Gram negativi, Funghi e rivelazione con sonde di ibridazione rivelazione con sonde di ibridazione
specifiche fluorescentispecifiche fluorescenti
22
LightCycler2.0
LightCycler 2.0 IVDLightCycler 2.0 IVD
CaratteristicheCaratteristiche
Rapida identificazione del prodotto con l’analisi della Melting-Curve
Monitoraggio della fluorescenza in tempo reale
Eliminazione dei rischi di contaminazione
Termociclazione ad alta velocità
Analisi muliplex/
multicolor detection
Software versatile
SeptiFast Identification Software SeptiFast Identification Software
InterpretazioneInterpretazione automaticaautomatica deidei datidati
Turnaround timeTurnaround time (TAT) medio (TAT) medio
a confronto in rapporto agli isolati a confronto in rapporto agli isolati
rilevato a Pordenonerilevato a Pordenone
8484±±121236 36 ±±121214 ( 5/29 )14 ( 5/29 )COCCHI GRAM +COCCHI GRAM +
8484±±121236 36 ±±121214 ( 5/29 )14 ( 5/29 )BACILLI GRAM BACILLI GRAM --
96 96 ±±12 12 36 36 ±±121214 ( 5/29 )14 ( 5/29 )FUNGHIFUNGHI
Identificazione Identificazione
biochimicabiochimicaColorazione di Colorazione di
GRAMGRAMSeptiFast SeptiFast
(range)(range)MicrorganismoMicrorganismo
Diamante et al Diamante et al RIMeLRIMeL / IJLaM 2010/ IJLaM 2010
Test molecolare diretto:Test molecolare diretto:
Il tempo necessario per Il tempo necessario per refertarerefertare un un
risultato negativo con lrisultato negativo con l’’emocoltura emocoltura èè
stabilito dagli standard CLSI stabilito dagli standard CLSI (Clinical and (Clinical and
Laboratori Standard Laboratori Standard InstituteInstitute, 2007), 2007) in 7 giorni. in 7 giorni.
risposta negativa in 5 hrisposta negativa in 5 h
�� Il Il valore predittivo negativovalore predittivo negativo èè elevato. E gielevato. E giàà questo questo
giustifica ampiamente lgiustifica ampiamente l’’utilizzo del test.utilizzo del test.
�� Nel caso di SeptiFast, la sensibilitNel caso di SeptiFast, la sensibilitàà appare comunque appare comunque
nettamente superiorenettamente superiore a quella espressa dallaa quella espressa dalla
emocolturaemocoltura. .
�� Non influenzata dalla terapia antibiotica e/o Non influenzata dalla terapia antibiotica e/o antimicoticaantimicotica
�� Non consente Non consente (perch(perchéé non sono disponibili i rispettivi non sono disponibili i rispettivi
target) di identificare alcuni microrganismi. target) di identificare alcuni microrganismi.
�� Consente di ottenere Consente di ottenere solo unsolo un’’identificazione diidentificazione di specie specie
e e non un test di sensibilitnon un test di sensibilitàà..
PCR vs EMOCOLTURA: pro e controPCR vs EMOCOLTURA: pro e contro
Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011
SepsiSIRSInfezione/Trauma
Sepsi
Grave
Shock
Settico
SIRS = Systemic Inflammatory Response Syndromenon necessariamente a eziologia infettiva
Temperatura > 38°C o < 36°C Battito > 90 battiti / minRespirazione > 20 / min o PaCO2 <32 mm HgLeucociti > 12.000/mm3 o < 4.000/mm3 or >10 % immature
SEPSI=risposta infiammatoria sistemica ad una infezione accertataSIRS più infezione e sito di infezione documentato
SEPSI GRAVE= Sepsi associate a disfunzione d’organo e ipoperfusione o ipotensione
MODS
Indicazioni per l'utilizzo delIndicazioni per l'utilizzo del SeptiSeptiFastFast
*Casalta*Casalta et alet al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009
** Varani et al** Varani et al. Journal of Infection 2009
sepsi/sepsi grave/shock setticosepsi/sepsi grave/shock settico
criteri SIRS criteri SIRS ++ diagnosi accertata o sospetta di infezione diagnosi accertata o sospetta di infezione
±± disfunzionedisfunzione dd’’organoorgano
��Sospetta endocardite* e/o Sospetta endocardite* e/o infezioni da protesi endovascolariinfezioni da protesi endovascolari
��Pazienti con quadro clinico di polmonitePazienti con quadro clinico di polmonite
��Infezioni di cute e tessuti molliInfezioni di cute e tessuti molli
��Pazienti settici immunodepressi**Pazienti settici immunodepressi**
��Sospetta infezione fungina invasiva Sospetta infezione fungina invasiva
��Pazienti Pazienti non non responderresponder alla terapia (anzichalla terapia (anzichéé colturale dopo colturale dopo
washwash--outout) )
DallDall’’esperienza clinica sperimentale esperienza clinica sperimentale
alla condivisione di un percorso diagnosticoalla condivisione di un percorso diagnostico
nei pazienti candidati ad impianto nei pazienti candidati ad impianto
di di endoprotesiendoprotesi aortica.aortica.
Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011
MMultidrugultidrug Resistant Resistant S.aureusS.aureus ((MRSA) MRSA)
MRSAMRSA èè attualmente il patogeno attualmente il patogeno
antibioticoantibiotico--resistente piresistente piùù comune comune
identificato negli ospedali in molte identificato negli ospedali in molte
parti del mondo.parti del mondo.
Gordon RJ and Lowry FD. CID, 2008
�� ApproximatelyApproximately 20% of 20% of individualsindividuals are are
persistentlypersistently nasallynasally colonizedcolonized withwith S.aureusS.aureus
and 30% are and 30% are intermittentlyintermittently colonizedcolonized..
�� ColonizationColonization clearlyclearly increasesincreases the the riskrisk forfor
subsequentsubsequent infectioninfection..
Gordon RJ and Lowy FD. CID, 2008Werthein HF et al. Lancet Infect Dis, 2005
MRSA MRSA epidemiologyepidemiology and and
backgroundbackground
Lo studio ISABEL (Italian Staphylococcus Aureus Benchmarketed Epidemiology),
che tra settembre 2004 e maggio 2005 ha arruolato 3648 pazienti in 27 ICU(Unità di Terapia Intensiva),
italiane ha dimostrato nei pazienti positiviallo screening al momento del ricovero una% di malattia da MRSA pari al doppiorispetto ai pazienti negativi ed una % quasi 10 volte superiore durante la degenza.
PROTOCOLLO PER LA SORVEGLIANZA DI MRSA IN AOSMA.Comitato infeioni settembre 2008
SOLUZIONESOLUZIONE
RidurreRidurre le le infezioniinfezioni associate associate allall’’RMSARMSA
mediantemediante unauna rapidarapida eded attivaattiva sorveglianzasorveglianza..
� Scrupolosa igiene delle mani
� Adeguati programmi di controllo dell’uso degli antibiotici (antibiotic stewardship)
� Sorveglianza attiva per l’identificazione di pazienti con infezione e/o colonizzazione
� Eventuale decolonizzazione e isolamento del paziente colonizzato.
Procedure adottate per il contenimento Procedure adottate per il contenimento
della diffusione di MRSA della diffusione di MRSA
nelle strutture sanitarie. nelle strutture sanitarie.
Precauzioni da contatto e sorveglianzaPrecauzioni da contatto e sorveglianza
attiva attiva ottenuta con lo screening ottenuta con lo screening hanno la hanno la
capacitcapacitàà di ridurre morbilitdi ridurre morbilitàà e mortalite mortalitàà
nei pazienti risultati colonizzati.nei pazienti risultati colonizzati.
Questi pazienti, infatti, se Questi pazienti, infatti, se non individuati non individuati tempestivamentetempestivamente, possono essere esposti , possono essere esposti a un maggiore rischio di sviluppare a un maggiore rischio di sviluppare unun’’infezione MRSA correlata durante la infezione MRSA correlata durante la degenza, soprattutto in contesti ad elevata degenza, soprattutto in contesti ad elevata criticitcriticitàà, quali ad esempio le Unit, quali ad esempio le Unitàà di di Terapia Intensiva (ICU).Terapia Intensiva (ICU).
Inoltre, Inoltre, èè dimostrato che i pazienti dimostrato che i pazienti
asintomaticiasintomatici colonizzaticolonizzati rappresentano rappresentano
la pila piùù efficace fonteefficace fonte di trasmissione di di trasmissione di
MRSA nelle strutture sanitarie. MRSA nelle strutture sanitarie.
GeneXpertGeneXpert
GeneXpertGeneXpert automatizza le fasi di automatizza le fasi di
preparazione del campione eseguendo preparazione del campione eseguendo
tutti gli step necessari alltutti gli step necessari all’’estrazione ed alla estrazione ed alla
realreal time PCR, mediante un sistema time PCR, mediante un sistema
avanzato di cartuccia microfluidica.avanzato di cartuccia microfluidica.
La base di questa tecnologia sono le La base di questa tecnologia sono le cartucciecartuccie
brevettatebrevettate monouso che nelle differenti camere monouso che nelle differenti camere
contengono tutti i reagenti in forma liofilizzata contengono tutti i reagenti in forma liofilizzata
necessari allnecessari all’’estrazioneestrazione e alle all’’amplificazione in amplificazione in
realreal time PCR del target. time PCR del target.
La cartuccia deve essere ricostituita allLa cartuccia deve essere ricostituita all’’inzioinzio
delldell’’esperimento aggiungendo nelle diverse esperimento aggiungendo nelle diverse
camere le camere le soluzioni fornite con la cartuccia soluzioni fornite con la cartuccia
stessa (stessa (unico step manuale della metodicaunico step manuale della metodica). ).
�� GeneXpertGeneXpert èè un sistema che un sistema che automatizza i automatizza i
tre processi necessari per eseguire una tre processi necessari per eseguire una
realreal time PCRtime PCR: preparazione del campione, : preparazione del campione,
amplificazione e rilevamento.amplificazione e rilevamento.
�� EE’’un sistema modulare che consente di un sistema modulare che consente di
eseguire da eseguire da 1 a 4 analisi1 a 4 analisi
contemporaneamente anche per differenti contemporaneamente anche per differenti
analitianaliti. .
Il software del Il software del GeneXpertGeneXpert èè
completamente automatico ed elimina le completamente automatico ed elimina le
problematiche relative alla soggettiva problematiche relative alla soggettiva
interpretazione dei risultati.interpretazione dei risultati.
I risultati qualitativi sono visualizzabili I risultati qualitativi sono visualizzabili
mediante le curve di mediante le curve di RealReal Time PCR che Time PCR che
appaiono a monitor per ogni modulo dello appaiono a monitor per ogni modulo dello
strumento.strumento.
XpertXpert®® MRSAMRSA provvedeprovvede a dare a dare unauna
rispostarisposta in in 66 66 minutiminuti circacirca controcontro ii
due/tre giornidue/tre giorni deidei metodi colturali.metodi colturali.
�� Analisi eseguita con metodo molecolare rapido Analisi eseguita con metodo molecolare rapido
((GeneXpertGeneXpert--CepheidCepheid) e ) e refertatarefertata in giornatain giornata..
�� Identificazione tempestiva di eventuale Identificazione tempestiva di eventuale
colonizzazione nasale da MRSA in tutti i pazienti colonizzazione nasale da MRSA in tutti i pazienti
che che afferisconoafferiscono in ICU.in ICU.
PROTOCOLLO DI SORVEGLIANZA PROTOCOLLO DI SORVEGLIANZA
PER MRSA IN ICUPER MRSA IN ICU
Il Il monitoraggio individua tempestivamentemonitoraggio individua tempestivamente
eventuali portatori di MRSA, mettendo in eventuali portatori di MRSA, mettendo in
atto atto immediatamente tutte le procedureimmediatamente tutte le procedure
previste per la decolonizzazione e previste per la decolonizzazione e
ll’’isolamento del paziente e per indirizzare isolamento del paziente e per indirizzare
in modo tempestivo e mirato la terapia in in modo tempestivo e mirato la terapia in
caso di sviluppo di malattia infettiva caso di sviluppo di malattia infettiva
correlabile a MRSA.correlabile a MRSA.
In caso di positivitIn caso di positivitààper MRSAper MRSA
• Decolonizzazione nasale con mupirocina (Bactrobanpomata) endonasale (3 applicazioni/die per 5 gg).
• Decolonizzazione generale con clorexidina gluconato al 5% (Neoxene Soluz 5%), una volta al giorno per 5 gg.
• Isolamento del paziente in stanza singola o per coorte e applicazione delle precauzioni da contatto.
In caso di insorgenza di In caso di insorgenza di
malattia da infezionemalattia da infezione
• Campionamento microbiologico rapportato alla sede di infezione
• Inizio trattamento con vancomicina o altro farmaco anti-MRSA, da scegliersi in base alla farmacocineticarapportata al sito di infezione e alla MIC rilevata, se disponibile.
Num
ber
of patie
nts
Num
ber
of patie
nts
MRSA NASAL CARRIERS MRSA NASAL CARRIERS
(ICU, Mar 09(ICU, Mar 09-- SeptSept 10)10)
26 (7%)
350376
0
50
100
150
200
250
300
350
400
1
MRSAP
MRSAN
TOT ADMISSIONS
RESPIRATORIRESPIRATORI
Virus Virus
H1H1--N1N1
Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate alTecniche di Biologia Molecolare utilizzate al
““S.MariaS.Maria degli Angelidegli Angeli”” di Pordenonedi Pordenone
Laboratorio di MicrobiologiaLaboratorio di Microbiologia--VirologiaVirologia
VIROLOGIA VIROLOGIA
RespiratoriRespiratori
Infezioni respiratorie acuteInfezioni respiratorie acute sono sono
la principale causa di malattia nel la principale causa di malattia nel
mondomondoHerman Goossens BMJ 2006
Le infezioni delle basse vie respiratorie LRTILe infezioni delle basse vie respiratorie LRTI
((lowerlower respiratoryrespiratory tracttract infectionsinfections)) sono le pisono le piùù comuni infezioni di comuni infezioni di
adulti e bambini.adulti e bambini.
Murdoch DR. APMIS 112: 713–27, 2004
La La popolazione pipopolazione piùù a rischioa rischio per lo sviluppo per lo sviluppo
di una malattia respiratoria fatale sono di una malattia respiratoria fatale sono bambini, bambini,
anzianianziani ed ed immunocompromessi.immunocompromessi.
Herman Goossens BMJ 2006
Se Se la diagnosi clinicala diagnosi clinica di LRTI di LRTI èè relativamente facile relativamente facile
da fare, da fare, determinare ldeterminare l’’agente eziologico responsabile agente eziologico responsabile
può essere pipuò essere piùù difficiledifficile a causa dei test diagnostici a causa dei test diagnostici
convenzionali limitaticonvenzionali limitatiMurdoch DR. APMIS 112: 713–27, 2004
Durante gli anni recenti un notevole numero Durante gli anni recenti un notevole numero di di
agenti respiratori sconosciutiagenti respiratori sconosciuti sono stati scoperti e di sono stati scoperti e di
questi, questi, le culture in vitro sono o molto lunghe o le culture in vitro sono o molto lunghe o
irrealizzabili.irrealizzabili.Ieven, M. J Clin Virol. 2007
In generale solo nel In generale solo nel 50%50% dei casi ldei casi l’’agente eziologico agente eziologico
viene identificatoviene identificatoLoens K et al. J Clin Microbiol 2009
I test I test tradizionali virologici e tradizionali virologici e sierologicisierologici per la per la
determinazione di determinazione di microorganismimicroorganismi responsabili di responsabili di
polmoniti hanno una polmoniti hanno una bassa sensibilitbassa sensibilitàà, necessitano , necessitano
didi molto tempomolto tempo per la loro identificazione edper la loro identificazione ed
individuano solo uno o alcuniindividuano solo uno o alcuni dei numerosi dei numerosi
agenti eziologiciagenti eziologici
Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008
Nuova filosofia e organizzazione Nuova filosofia e organizzazione
in Virologiain Virologia
�� Passaggio da una Passaggio da una ““filosofia colturalefilosofia colturale”” a una a una
““filosofia molecolarefilosofia molecolare””..
�� Acquisizione di nuove Acquisizione di nuove tecnologietecnologie. .
Nel solo 2008Nel solo 2008 sono state introdotte sono state introdotte 25 nuove 25 nuove
diagnostiche molecolaridiagnostiche molecolari, che garantiscono oggi , che garantiscono oggi il piil piùù
esteso esteso panelpanel di diagnostiche molecolari del di diagnostiche molecolari del
Dipartimento Dipartimento e la massima efficienza ed efficacia la massima efficienza ed efficacia
diagnostica in numerosi contesti clinici. diagnostica in numerosi contesti clinici.
Con le colture cellulari il TAT Con le colture cellulari il TAT
di una risposta negativa di una risposta negativa èè
tra i 10/15 giornitra i 10/15 giorni
In Europa il In Europa il 90/95%90/95% degli antibiotici viene usato degli antibiotici viene usato al di al di
fuorifuori delle strutture ospedaliere e delle strutture ospedaliere e la gran partela gran parte viene viene
prescritta per le infezioni delle basse vie respiratorie prescritta per le infezioni delle basse vie respiratorie
acquisite in comunitacquisite in comunitàà..Herman Goossens BMJ 2006
Pneumonia in Pneumonia in immunoimmuno--competentcompetent adultsadultsNational Standard National Standard MethodMethod
Multiplex Multiplex
RealReal Time PCRTime PCR
Multiplex Multiplex
RealReal Time PCRTime PCR
•• Parainfluenza virus 1Parainfluenza virus 1Parainfluenza virus 2Parainfluenza virus 2Parainfluenza virus 3Parainfluenza virus 3AdenovirusAdenovirus A/B/C/D/EA/B/C/D/ECoronavirus 229E/NL63Coronavirus 229E/NL63
•• CoronavirusCoronavirus OC43OC43RhinovirusRhinovirus A/B/C A/B/C Influenza A virusInfluenza A virusRSV ARSV ARSV BRSV B
•• BocavirusBocavirus 1/2/3/41/2/3/4Influenza B virusInfluenza B virusParainfluenza virus 4Parainfluenza virus 4EnterovirusEnterovirus
4 ore e 154 ore e 15
SeeplexSeeplex®®
RV 15 ONE STEPRV 15 ONE STEP
Parainfluenza virus 1Parainfluenza virus 1
Parainfluenza virus 2Parainfluenza virus 2
Parainfluenza virus 3Parainfluenza virus 3
AdenovirusAdenovirus A/B/C/D/EA/B/C/D/E
Coronavirus 229E/NL63Coronavirus 229E/NL63
CoronavirusCoronavirus OC43OC43
RhinovirusRhinovirus A/B/C A/B/C
Influenza A virusInfluenza A virus
RSV ARSV A
RSV BRSV B
BocavirusBocavirus 1/2/3/41/2/3/4
Influenza B virusInfluenza B virus
Parainfluenza virus 4Parainfluenza virus 4
EnterovirusEnterovirus
M.pneumoniaeM.pneumoniae
C.pneumoniaeC.pneumoniae
L.pneumophilaL.pneumophila
S.pneumoniaeS.pneumoniae
H.influenzaeH.influenzae
B.pertussisB.pertussis
DualDual PrimingPriming
OligonucleotideOligonucleotide
technologytechnology((SeegeneSeegene))
Infezioni respiratorie ad eziologia virale a Infezioni respiratorie ad eziologia virale a
Pordenone: Pordenone:
gennaio 2010gennaio 2010-- ottobre 2011ottobre 2011
2010 test eseguiti con RV12 SEEGENE
0
20
40
60
80
100
120
gennaio aprile luglio ottobre
CORON
ADE
RHINO
MPV
PIV
INFLB
INFLA
RSV
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
gennaio marzo maggio luglio settembre
ENTERO
BOCA
CORON
ADE
RHINO
MPV
PIV
INFLB
INFLA
RSV
2011 test eseguiti con RV15 SEEGENE
InfluenzaInfluenza virus virus typetype A and B, A and B, parainfluenzaparainfluenza
virus virus typetype 1, 2, 3, 1, 2, 3, respiratoryrespiratory syncytialsyncytial virusvirus
(RSV) (RSV) typetype A and B, and A and B, and adenovirusadenovirus are major are major
causescauses of of lowerlower respiratoryrespiratory tracttract infectionsinfections in in
infantsinfants and and youngyoung childrenchildren under 5 under 5 yryr old. old.
HumanHuman metapneumovirusmetapneumovirus, , alsoalso identifiedidentified in in
childrenchildren withwith respiratoryrespiratory infectioninfection, , rhinovirusrhinovirus, ,
and and coronaviruscoronavirus are are knownknown asas causative causative
agentsagents of the common of the common coldcold..
Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008
La disponibilitLa disponibilitàà di di metodi rapidi per la metodi rapidi per la
diagnosi virale diagnosi virale permetterpermetteràà dd’’ora in poi ora in poi
di decidere in modo di decidere in modo pipiùù accurato il accurato il
trattamento, riducendo costrattamento, riducendo cosìì ll’’uso di uso di inutiliinutili
agenti antimicrobici ed abbreviando i agenti antimicrobici ed abbreviando i
tempi di ospedalizzazione tempi di ospedalizzazione per i pazienti.per i pazienti.
Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008