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Analisi quantitativa delle immagini per applicazioni in Life Science Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva 4 20010 Bareggio (Mi) 15 Aprile 2011

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Analisi quantitativa delle immagini

per applicazioni in Life Science

Immagini & Computer S.n.c.Via Don Carlo Riva 420010 Bareggio (Mi)

15 Aprile 2011

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“L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare una sensazione visiva nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.”

Analisi quantitativa delle immagini

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Premesse

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Analisi quantitativa delle immagini

L‟analisi delle immagini è una disciplina il cui scopo principale è estrarre informazioni quantitative a partire dalla rappresentazione digitale del nostro evento biologico

Tali informazioni devono essere presenti in quantità e qualità sufficienti alla loro valutazione all‟interno della nostra immagine digitale.

Abbiamo quindi bisogno di una rappresentazione digitale quanto più fedele possibile all‟originale da cui è stata generata.

La fedeltà e la presenza delle informazioni è funzione diretta dei limiti di risoluzione e contrasto imposti dal sistema.

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I limiti di risoluzione e contrato

Limiti fisici derivanti dalla costruzione dell’immagine ottica

Limiti derivanti dalla trasformazione dell’immagine ottica in digitale

Limiti derivanti dalla errata manipolazione dell’immagine digitale

Risultato

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Risoluzione & Contrasto

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Piano di fuoco del campione

Lunghezza di camera 18 - 25 cm

Il piano di fuoco selezionato viene, attraverso il sistema ottico (obiettivo), proiettato su un piano focale secondario (posteriore). Quello che noi osserviamo attraverso gli oculari non è il campione originale ma la sua trasposizione ottica generata attraverso il processo di convoluzione.

Obiettivo Oculare

Piano di Fuoco posteriore

Piano di Fuoco Oculare

Piano di Fuoco osservato

Come si forma una immagine ottica

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Considerate il campione come un insieme di infiniti punti di emissione luminosa con dimensioni inferiori al limite di risoluzione ottica

Come si forma una immagine ottica

Quando la luce che arriva dai vari punti che compongono il campione attraversa il sistemaottico essi appaiono come piccole strutture (Airy pattern) e non come punti nell‟immaginericostruita .

La parte centrale del pattern è conosciuta come Airy Disk e contiene + dell‟80% della intensitàtotale del punto.

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Definizione di risoluzione ottica

La risoluzione ottica è definita come la distanza minima che separa 2 oggetti puntiformi presenti sul piano focale affinché essi possano essere visualizzati come entità separate.

Il limite di risoluzione si raggiunge quando il primo anello periferico del pattern di Airydi un punto si sovrappone al punto di massima del disco principale del punto contiguo.

Si consideri che:Più il picco centrale del pattern di Airy è sottile più è elevato il potere risolutivo del sistema ottico. L’ampiezze del picco è determinata sia dall’angolo solido con il quale l’ottica è in grado di raccogliere la luce (Apertura Numerica), sia dalla lunghezza d’onda della luce raccolta.

La risoluzione laterale ed assiale di un sistema ottico si calcola utilizzando la formula di Abbe (dove N.A.= n sen a )

R laterale WF = 0,61 λem/ N.A.R assiale WF= 2 λem * n / N.A

Il criterio di Rayleigh propone come limite di risoluzione la distanza minima tra 2 punti tale che il contrasto ottenuto rappresenti il 26.5% del totale.

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Definizione di risoluzione ottica

Il concetto di risoluzione ottica è indissolubilmente associato al concetto di contrasto

Il contrasto è espresso come la differenza tra il valore massimo e minimo di intensità presente nell‟immagine.

C = (Max – Min) / Med

Con riferimento ai pattern di Airy il contrasto è dato dalla differenza tra il picco di massima (disco centrale) ed il valore di intensità più prossimo.

Minore la distanza tra gli oggetti minore il contrasto esistente tra i due.

Il criterio di Sparrow definisce la risoluzione di un sistema come la distanza di Cut-Off calcolata.

La Cut-Off distance determina le distanza esistente tra due punti (massimo dei picchi di Airy) a partire dalla quale il valore di contrasto viene azzerato.

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Principali sorgenti di degrado della risoluzione (contrasto)

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Principali sorgenti di degrado della risoluzione (contrasto)

Rumore

Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale.Il segnale deve risultare significativamente più elevato del rumore.

•Rumore Poisson (campione)•Rumore ottico

Sistema Ottico

Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale.Introduzione di aberrazioni ottiche e di fenomeni di diffrazione.

•Diffrazione Luce•Aberrazioni sferiche e cromatiche•Fuori fuoco.•Artefatti

Preparazione del campioneMarcatura adeguata delle strutture

Background

Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Deve essere sottratto al valore del segnale.

•Autofluorescenza.•Disomogeneità luce•Luce estranea

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Disallineamento cromatico

Errore sistematico caratteristico dei sistemi ottici (obiettivi).

La luce monocromatica viene focalizzata su piani diversi in funzione della sua lunghezza d’onda.Errore più consistente lungo asse Z.Risente delle condizioni meccaniche ed ambientali (temperatura)

Utilizzo di obiettivi corretti cromaticamente.

Misura sperimentale del disallineamento attraverso sfere fluorescenti.

Correzione con ricalcolo dello stack

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Errata localizzazione della luce

A causa della profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell‟immagine.

La profondità di campo identifica la porzione (o spessore) del campione i cui estremi rimangono simultaneamente a fuoco all‟interno della stessa immagine.

La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d‟onda di emissione della luce utilizzata.

Profondità di campo = R assiale/2

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Il processo fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che prende il nome di PSF (Point Spread Function)

Errata localizzazione della luce

Campione PSF Proiezione ottica

La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l‟immagine viene costruita.

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L’aberrazione sferica rappresenta una distorsione ottica generata dalladifferente posizione di focalizzazione dei raggi oblicui (periferici) rispettoai raggi centrali che attraversano la lente. L’aberrazione sferica introduce asimmetria nella distribuzione della luce, aggiunge componenti fuori fuoco e riduce il livello del segnale.

L’aberrazione sferica è generata da una imperfezione del percorso ottico. La causa può essere identificata sia nella qualità costruttiva dell’obiettivo, sia nelle differenzeesistenti tra gli indici di riflessione dei media utilizzati per interfacciare gli obiettivi (aria, olio, acqua, ect) e quelli dei media utilizzati per fissare il campione. Lo spessore del campione stesso può contribuire alla sua generazione.

Aberrazione Sferica

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Background

Si aggiunge come costante al segnale Disomogeneità di illuminazione

Tipica dei sistemi WidefieldSi risolve calibrando il sistema di illuminazione (centratura lampada e regolazione del Koeler).Correggendo attraverso immagine del background.

Regolando l’offset del sistema si acquisizioneValutando il valore del background con immagini di riferimento

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La trasformazione digitale dell’immagine

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Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell‟evento) Ottimizzazione del rapporto Segnale/Rumore (SNR) Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della

telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione) Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini

Trasformazione dell’immagine ottica in digitale

Limiti di risoluzione e contrasto derivanti dalla trasformazione dell’immagine ottica in digitale

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La densità di campionamento stabilisce il numero di unità digitali di base (pixel o voxel) chedevonoessere acquisite per unità di superfice / volume.

In pratica definisce le dimensioni ideali del pixel / voxel nelle specifiche condizioni operative allo scopodi salvaguardare il contenuto informativo del campione.

Z

X

Y

Il campionamento

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La dimensione ideale del pixel / voxel, al di fuori del quale il processo di acquisizione può produrreartefatti, viene calcolata secondo il teorema di Nyquist-Shannon.

“La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più grande del doppio della bandapassante del segnale originale in modo da garantirne la perfetta ricostruzionedigitale.”

La massima dimensione del pixel / voxel deve risultare inferiore alla metà del più piccolo oggetto o struttura presente nell‟immagine.

Voxel Struttura

Il campionamento

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Calcolo Z secondo Nyquist

Δz = λem / (2 N (1- cos α))

Λem = emission wavelenghtN = medium indexα = ½ angolo apertura obiettivo

In praticaΛem = 520nmN = 1.515NA = 1.3-> α = αrcsen(NA/N)

Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α))Δz = 353 nm

Calcolo XY secondo Nyquist

Δxy = λem / (4 N sen α)

La dimensione del più piccolo oggetto o struttura presente nell‟immagine è equivalente al limiterisolutivo del sistema ottico (e digitale) in uso.

Calcolatore Nyquist

Un densità di campionamento inferiore al valore calcolato non è accettabile in quanto riduce il contrasto.Un minimo sovracampionamento non influisce sulla qualità delle informazioni.Un eccessivo sovracampionamento è inutile e spesso deleterio.

Il campionamento

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Analisi quantitativa delle immagini

Il campionamento

Il valore di intensità contenuto nei singoli pixel / voxel sintetizza il reale contenuto dell‟area / volume descrittadall‟elemento digitale.In questo modo i valori minimi aumentano ed i valori massimi si riducono comprimendo il contrasto dell‟immagine.

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La gamma dinamica del segnale

La gamma dinamica dell’immagine rappresenta il numero di valori discreti che compongono la scala numerica utilizzata per descrivere il segnale analogico nella sua forma digitale (Livelli di Grigio).

La scala numerica (scala dei grigi) ha dimensioni standardizzate (8bit-256 GL, 12bit-4096 GL, 16bit-65356 GL)

La gamma dinamica dell’immagine è determinata dalle caratteristiche fisiche del dispositivo di acquisizione utilizzato. (PMT o CCD).

Discreto

ContinuoPer i sensori CCD la gamma dinamica reale è determinata dal rapporto tra la capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria delle singole celle ed il contributo dei rumori intrinseci da esso generati. (Read Noise, Termal noise, ect)

FWC inversamente proporzionale alle dimensioni della singola cella CCD.

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La gamma dinamica del segnale

Ogni valore numerico presente nella scala dei grigi rappresenta un intervallo di intensità. Tanto più ampia è la scala numerica tanto più piccoli sono gli intervalli descritti.

Considerando che il numero di valori su cui è suddivisa la scala di grigi e la sua estensione sono determinati dalle caratteristiche costruttive del dispositivo di lettura dei fotoni possiamo solo agire sul segnale, o sui parametri utilizzati per rilevarlo, per aumentare il numero di fotoni rilevato e di conseguenza migliorare il contrasto

80 %o

20 %o

Segnale sovraesposto

Segnale sottoesposto

Ottimizziamo la dinamica digitale dell‟immagine durante l’acquisizione

Aumentando l’intensità di illuminazione del campione

Bilanciando adeguatamente guadagno PMT e potenza del

laser

Utilizzando tempi di esposizione adeguati (CCD)

Utilizzando le funzioni di binning (CCD)

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Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR)

Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell‟immagine e l‟effettivo segnale.

Tecniche di riduzione del rumore

Adeguata gestione del rangedinamico

Tecniche di ImageRestoration

Il valore SNR può essere migliorato agendo su :

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I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di “pixellatura” artificiale dell’immagine.

Archiviazione delle immagini

Necessità di preservare le informazioni originali contenute nell’immagine.In questo caso sono da preferire i formati lineari non compressi o con compressioni di tipo “lostless” (Tiff, Bmp, ect)oppure i formati proprietari degli strumenti. No a formati “ibridi” (quali il Tiff - Palette)

I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante (5% - 20%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato.

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Risoluzione digitale

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Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante

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La risoluzione discriminante rappresenta la distanza minima, espressa in unità metriche, che deve intercorrere tra due oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben contrastati tra loro, per poter essere identificati come tali dal sistema di acquisizione.

La risoluzione spaziale rappresenta la dimensione, espressa in unità metriche, del più piccolo oggetto, proiettato sul piano di fuoco, identificabile come tale dal sistema di acquisizione.

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In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel size) e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato secondo la formula:Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo)

4.6 um

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Risoluzione spaziale

In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Holeutilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e dal numero di pixels utilizzati per la matrice di acquisizione.

L‟impostazione di questi parametri è strettamente dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolatiutilizzando la formula di Nyquist.

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A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra loro per poter essere discriminati come tali.

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Risoluzione discriminante

Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3)

Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = 0.064 um ->(Pixel size / Ingrandimento)

Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = 0.147 um ->(Pixel size / Ingrandimento) * 2.3

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Caratteristica fisica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine (Da non confondere con i DPI.) .La risoluzione dell’immagine non è direttamente connessa alla capacità risolutiva del dispositivo che l’ha generata.

1024 x 768 pixel

2048 x 1536 pixel

Risoluzione dell’immagine

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Correzione artefatti e ripristino della risoluzione

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Data MiningSimulazione eventoCreazione modelloAnalisi dei dati

Raccolta delle immagini

Identificazione delle struttureSegmentazioneDistinzione da altre struttureCodifica dei confini e misuraClassificazione

RegistrazioneMosaicatura

Pubblicazione

Evoluzione e comportamento delle struttureTrackingCineticaRatio Imaging

Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini.Rimozione del rumoreRilocazione della luce fuori

fuoco

Correzione degli artefattiDecadimento (Photobleaching,ect)Correzione disomogeneità fondoInstabilità di illuminazione

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Correzione artefatti e ripristino della risoluzione

Deconvoluzione 3D operazione matematica utilizzata per recuperare un segnale degradato da un processo fisico.

Filtri spaziali lineari e non Filtri in domini di frequenza (FFT)

Nessuna alterazione dell‟immagine(analisi quantitativa)

Image Restorationinsieme di procedure e funzioni atte al recupero di un segnale (immagine) nella sua forma originale.

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Il modello fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che prende il nome di PSF (Point Spread Function)

Image Restoration

Campione teoricoDeconvoluzione 3DProiezione ottica

Correzione artefatti e ripristino della risoluzione

Per ridistribuire correttamente la luce attraverso la deconvoluzione è necessario conoscere a priori il modello fisico che regola la diffusione della stessa nel sistema ottico in uso (descrittore della funzione di convoluzione).

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Visualizzare le informazioni

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Visualizzare le informazioni

R

V

B

Ridistribuzione dei livelli di grigio(Stretch, Log e Exp)

BCG

Memoria VideoTabelle colore

Display range

Memoria

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Semplificare le informazioni

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Comprensione della scena

Visione Conoscenza

Valutazione Informazioni

Le principali prerogative del sistema visivo umano sono la rapidità di interpretazione, la capacità di adattamento alle variazioni presenti nella scena rispetto al modello noto e la possibilità di incrementare la conoscenza.

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Quale è la nostra base di partenza?

• Circa 1/3 del cervello umano elabora informazioni visive• Percezione visiva dipende dal modo in cui vengono elaborate le informazioni luminose prodotte da fotoni che

colpiscono la retina• Elaborazioni diverse permettono di percepire aspetti diversi della visione: forme, colore, movimento, profondità.• Elaborazione molto veloce e complessa : percezione simultanea di dettagli e di aspetti globali dell‟immagine.

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Analisi quantitativa delle immagini

Quale è la nostra base di partenza?

Immagine Ottica campione

Sensore (CCD, PMT)

Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati.

I livelli di grigio espressi dai singoli pixel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente area / volume del campione

Matrice bidimensionale di pixel ognuno dei quali rappresenta una specifica area del campione

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Semplificare per identificare

Proprietà dei pixel :• Intensità (luminosità)• Coordinate spaziali X,Y • Identità ed iterazione con pixel adiacenti

E‟ evidente la difficoltà nell‟assegnare, sulla sola base delle proprietà sopra indicate, i singoli pixel ad una specifica classe di appartenenza (filamento, nucleo, membrana, fondo ect)

?

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Analisi quantitativa delle immagini

Identificazione delle strutture

Manipolazione dell’immagine

Preservare il contenuto informativo

Semplificazione delle strutture

Binarizzazione

Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare

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Manipolazione delle immagini

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Manipolazione dell’immagine

GaussVarianza

Gauss LF NegativeEdge

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Manipolazione dell’immagine

Gauss LF Positive EdgeSogliatura

Gauss LF Low PassSogliatura

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Filtri spaziali lineari e non Filtri in dominio di frequenza (FFT)

I filtri operano trasformazioni (semplici o complesse) che modificano il contenuto informativo dei singoli pixel.

I filtri lineari rimpiazzano il valore di ogni pixel con un valore ottenuto dalla valutazione dei pixel adiacenti (es. valore medio).

Il filtro Gaussiano rappresenta il filtro lineare più utilizzato.Esso migliora l‟immagine riducendo il rumore casuale senza modificare il contenuto informativo.

I parametri operativi dei filtri sono spesso richiesti in unità reali (micrometri) -> PSF

Manipolazione dell’immagine

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Metodi di binarizzazione

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Analisi quantitativa delle immagini

Riconoscimento dei contorni

Si definisce bordo (edge) una forte variazione locale dei livelli di grigio tipicamente associata al contorno di una regione od al confine di separazione tra due regioni adiacenti. Per rilevare i bordi si ricorre al calcolo del gradiente di intensità, ovvero alla valutazione delle variazione dei livelli di grigio, ed al suo orientamento nell‟intorno del bordo da definire. Uno degli algoritmi più conosciuti è il LoG (Laplace ofGaussian) che determina il gradiente attraverso il calcolo della derivata seconda dei livelli di grigio.

Filtro di Gauss + Laplace

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Riconoscimento dei contorni

Edge detection & linkingcon operatore morfologico

Immagine

Il contorno può risultare chiuso ed identificare una specifica regione dell‟immagine (oggetto) oppure aperto e definirne solo una parte del confine. Uno dei principali motivi della mancata chiusura dei bordi è da ricondurre al basso contrasto esistente tra regioni dell‟immagine (es. fondo ed oggetto).Anche la presenza di rumore sull'immagine (basso SNR) è causa di difficoltà nella rilevazione dei contorni (generazione di falsi bordi).

Binarizzazione

Ogni area racchiusa dal un contorno è riempita con un solo valore di grigio e considerata struttura (oggetto).

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Le tecniche di segmentazione sono sensibili ai vari artefatti presenti nell‟immagine (rumore, disomogeneità, ect). In presenza di strutture caratterizzate da intensità di fluorescenza differenti un unico intervallo di grigi non consenteuna perfetta identificazione delle stesse.

Tipicamente si tende a distinguere il fondo(background) dalle strutture di interesse.All„interno dell„intervallo di grigi si troval„oggetto, all„esterno il fondo.

Segmentazione

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Analisi quantitativa delle immagini

Le tecniche di segmentazione adattiva permettono di calcolare l„intervallo di grigio adeguato ad unazona specifica dell„immagine in funzione delle caratteristiche locali (valutazione statistica).

Segmentazione Adattiva

Divisione in sotto aree di dimensione adeguata alle

strutture presenti

Calcolo della soglia locale Binarizzazione

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Analisi quantitativa delle immagini

E‟ possibile dividere l‟immagine in aree regolari di dimensioni differenti od in aree irregolari in base ad alcune caratteristiche di distribuzione del segnale preventivamente definite.

Segmentazione Adattiva

Grandi aree con distribuzione omogenea (background) Grandi aree con distribuzione omogenea (background)

Aree con ampie variazioni in piccoli spazi Aree caratteristiche omogeneein termini statistici e di clusters

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Analisi quantitativa delle immagini

Segmentazione Adattiva

Divisione in aree irregolari Fusione di alcune aree in basea criteri prestabiliti

Identificazione e separazionedelle strutture

Binarizzazione

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Analisi quantitativa delle immagini

Crescita delle regioni (Region Growing)

Originale Massimo locale Crescita delle regioni Definizione strutture

Proposto da Haralick, fa uso di descrittori statistici. Si basa sulla progressiva aggregazione di pixel in regioni connesse. Tale aggregazione avviene sulla base di uno o più criteri di similarità.

Partendo da un punto qualsiasi dell‟immagine (massimo o minimo locale) vengono aggregati tutti i pixel del suo vicinato che soddisfano i parametri statistici assegnati (es. media e varianza).La regione viene considerata completa (e non cresce più) quando tutti i pixel sono stati classificati (come aggiunta si possono valutare alcuni criteri ad essa associati (forma, dimensione, ect) oppure incontra un‟altra regione in crescita. La procedura è ripetuta per ogni punto aggiunto e le statistiche della regione vengono aggiornate ciclicamente.

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http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Auto_Threshold

Analisi quantitativa delle immagini

Segmentazione Automatica

Default

Huang

Intermodes

IsoData

Li

MaxEntropy

Mean

MinError

Minimum

Moments

Otsu

Percentile

RenyiEntropy

Shanbhag

Triangle

Yen

Basata su metodi di valutazione statistica, distributiva (cluster) o geometrica del contenuto informativo

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http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Auto_Threshold

Analisi quantitativa delle immagini

Segmentazione Automatica

Huang

Intermodes

IsoData

Li

MaxEntropy

Mean

MinError

Minimum

Moments

Otsu

Percentile

RenyiEntropy

Shanbhag

Triangle

Yen

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Analisi quantitativa delle immagini

Caso Pratico

Collassamento(Proiezione – EDF)

Valutazione SPOT presenti sulla membrana cellulare

Canali separati

Analisi 3D

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Analisi quantitativa delle immagini

Caso Pratico

Identificazione cellule

Filtro Gauss

Sogliatura automatica

Binarizzazione Erosione Operatore logico

Mascheratura spot su membrana

Conteggio spot

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Analisi quantitativa delle immagini

Estrazione delle informazioni

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Analisi quantitativa delle immagini

Estrazione delle informazioni

Dimensioni

Area Perimetro Diametri

Forma Posizione

RoundnessAspectratio

Centroide XY

Possiamo ottenere qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente :

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Analisi quantitativa delle immagini

Estrazione delle informazioni

Possiamo ottenere grandezze fisiche che descrivono il segnale presente :

Intensità del segnale Variazione di segnale Distribuzione di segnale

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità (campo chiaro)

Differenza nelle condizioni di ripresa.Variazione del livello di intensità di illuminazione del campione

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Analisi quantitativa delle immagini

Calibrazione delle condizioni di ripresa del campione

Le misure di intensità

Variabilità biologica del campione e condizioni di preparazione (spessore, colorazione, ect)

Sorgente luminosa Temperatura colore nel bianco (3200°-5000°)

Lettura di un valore (GL) predeterminato

in area fuori dal campione ma entro

montante

LUCE COLORE

Bilanciamento dei 3 colori primari

UNITA‟ (DO)BACKGROUND

Immagine di riferimento per correzione disomogeneità di

illuminazione

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità (fluorescenza)

Corretto il confronto tra struttureappartenenti allo stesso campo

Problematico il confronto diretto tra strutture appartenentia campi / campioni differenti a causa delle:

•Impostazioni del sistema di acquisizione. (esposizione, eccitazione, ect)•Fenomeni di FADING (Decadimento del segnale)•Variabilità biologica del campione.•Rumore, disomogeneità nella distribuzione del segnale, fuorifuoco, ect

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Analisi quantitativa delle immagini

Quencing : generato da processi che producono il passaggio degli elettroni dallo stato di eccitazione a quello di riposo senza emissione di luce. Il processo di Quencing è reversibile.

Photobleaching : Perdita permanente della capacità di emettere elettroni da parte del fluoroforo a causa di un danno chimico indotto. Una delle cause principali del Photobleaching è l‟interazione del fluoroforo con luce ed ossigeno. Il processo di Photobleaching non è reversibile.

Dye: FITC - Perdita del 50% del segnale in 30sec

Le misure di intensità (fluorescenza)

T = 0 sec T = 15 sec T = 30 sec

Utilizzo di Dyes con coefficiente di estinzione elevatoMisura del decadimento del segnale nel tempo su aree del campione con marcatura aspecifica

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Analisi quantitativa delle immagini

100%Intensità relativa

33%Intensità relativa

10%Intensità relativa

3%Intensità relativa

0.667%Intensità relativa

Le misure di intensità (fluorescenza)

80 %o

20 %o

Segnale sovraesposto

Segnale sottoesposto

RANGE DINAMICO

Valutazione intensità del segnale massimo su piano focale adeguato

Mappa di riferimento per correzione disomogeneità di

illuminazione

BACKGROUND LINEARITA‟

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità

Per interpretazione dei valori e del loro significato biologico è importante verificare se il markerutilizzato è stecchiometrico (diretta proporzionalità tra segnale e valore letto) .

CUT-OFF di Intensità calcolatosperimentalmente su WT o Controlli (aspecifici)

Identifica la superfice coperta dal marker

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità

Quali sono i parametri adatti a quantificare l„intensità del segnale ?

Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 26674 pixelPercentuale di tessuto coperta dal marker : 18.6%Intensità media del segnale : 0.17 ODIntensità integrale del segnale (somma) : 5630.60 OD

Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 50930 pixelPercentuale di tessuto coperta dal marker : 30.76%Intensità media del segnale : 0.229 ODIntensità integrale del segnale (somma) : 15315.20 OD

Media : Valore dell„intensità media espressa dai singoli pixel (OD / GL) entro l„area coperta dal markerModa : Valore di intensità pixel (OD / GL) maggiormente espresso dai pixel presenti nell„area coperta dal markerIntegrale : Valore totale (Somma) dei singoli valori espressi dai singoli pixel presenti nell„area coperta dal markerSuperfice : Estensione dell„area coperta dal marker

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità

CUT-OFF di Intensità calcolatosperimentalmente su WT o Controlli (aspecifici)

Identifica la superfice coperta dal dye

Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 130548 pixelPercentuale di tessuto coperta dal marker : 42.49%Intensità media del segnale : 32.72 GLIntensità integrale del segnale (somma) : 5886375 GL

Superfice coperta dal marker (solo tessuto) : 148416 pixelPercentuale di tessuto coperta dal marker : 48.30%Intensità media del segnale : 41.92 GLIntensità integrale del segnale (somma) : 9238327 GL

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità

Una delle possibili soluzioni consiste nel legare la misura di interesse con un riferimento che possa esprimere le eventuali variazioni dovute alle condizioni esterne al campione.

•Livello del fondo•Auto fluorescenza dei tessuti circostanti•Segnali provenienti da strutture non influenzate dalle condizioni sperimentali (aspecifico)

Linea cellulare nota inserita nel processo di analisi

Misure raziometriche (Ca2+)Cellule non caricate e caricate a saturazione

Caso reale Intensità dei telomeri normalizzata con intensitàcentromero prima del loro confronto. Entrambi marcati utilizzando lo stesso dye.

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Analisi quantitativa delle immagini

3D: il mondo reale

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Analisi quantitativa delle immagini

Quale è la nostra base di partenza?

Immagine Ottica campione

Sensore (CCD, PMT)

Fotoni convertiti in una grandezza fisica proporzionale (ma non uguale) al numero dei fotoni rilevati.

I livelli di grigio espressi dai singoli voxel rappresentano il numero di fotoni presenti nella corrispondente volume del campione .

Matrice tridimensionale di voxel ognuno dei quali rappresenta uno specifico volume del campione .

3 Dimensioni

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Analisi quantitativa delle immagini

Semplificare per identificare

Iso Superficie?

Binarizzazione

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Analisi quantitativa delle immagini

Identificazione delle strutture

Manipolazione dell’immagine

Preservare il contenuto informativo

Semplificazione delle strutture

Iso Superfici

Metodi strettamente dipendenti dalle caratteristiche delle strutture da identificare

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Analisi quantitativa delle immagini

1. Selezione dell‟intervallo di intensità del segnale (livelli di grigio) da descrivere attraverso la Iso Superficie.

2. Creazione matematica di una struttura complessa di forme geometriche (triangoli) che descrivono la superficie esterna del volume.

3. Trasformazione visiva della struttura complessa attraverso il loro riempimento.

Costruzione delle Iso Superfici

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Analisi quantitativa delle immagini

Il livello di precisione nella ricostruzione della superficie è gestito attraverso il grado di interpolazione matematica con la quale vengono create le forme geometriche.Tanto più piccoli sono i triangoli tanto più dettagliata è la superficie.

Di contro un grado di interpolazione troppo elevato tende, in presenza di interconnessione spaziale dei voxels bassa, a frammentare il volume più del necessario.

Costruzione delle Iso Superfici

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Analisi quantitativa delle immagini

Quali informazioni di base possiamo estrarre?

Dimensioni Forma Segnale Posizione

Volume Superficie Sfericità IntensitàDiametri Baricentro X Y Z

Qualsiasi grandezza fisica diretta descrivente :

Spostamento Distanze tra comparti Distanze tra strutture Altro . .

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Analisi quantitativa delle immagini

Le misure di intensità di segnale.

Le iso superfici costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini precisi.

Segnale canale n°1 Segnale canale n°2Struttura su canale n°3

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Analisi quantitativa delle immagini

Misure dimensionali, di forma e di intensità

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Analisi quantitativa delle immagini

Conteggio e misure dimensionali, di forma e di intensità

Definizione delle Iso Superfici Selezione degli oggetti di interesseDivisione degli oggetti

Classificazione delle strutture

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Analisi quantitativa delle immagini

Studio della interazione tra comparti cellulari

Distanza vescicole – Nuclei

Colocalizzazione delle Vescicole(Intensità di un canale all‟interno del volume vescicolare)

Distanza Vescicole–Membrana

Numero di Vescicole per nucleo

Densità delle vescicole per nucleo

Numero di vescicole per cellula

Densità delle vescicole per cellule

Volume delle vescicole per cellula

Nuclei per Cellula

Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma

Distanza media vescicole

Nuclei e vescicole vs Membrana

Intensità delle vescicole per cellula

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Analisi quantitativa delle immagini

Studio Sinapsi posizionate sulla membrana cellulare

Trasformazione delle cellule in Isosurface

Trasformazione delle sinapsi in Isosurface sferiche (Spot)

Selezione delle sinapsi (Spot) in contatto con membrana (Isosurface) .

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di oggetti

Iterazione proteina – proteina.Associazione spaziale di segnali

Oggetti che risultano parzialmente in contatto o totalmente inseriti in altri oggetti.

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Analisi quantitativa delle immagini

Definizione della intensità del segnale utilizzata per costruire le Iso Superfici .

Divisione degli oggetti tramite „region growing“

Iterazione proteina – proteina

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Analisi quantitativa delle immagini

Estrazione dei dati di intensità di fluorescenza della proteina “B” (canale giallo) localizzata dentro i siti relativi alla proteina “A” (canale rosso).Classificazione per livello di intensità espresso.

Iterazione proteina – proteina

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Analisi quantitativa delle immagini

Informazioni in movimento

Valutazione del movimento delle strutture (variazione della posizione) rispetto al tempo ed allo spazio.Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e tipologia del moto di ogni singolo oggetto.

Quantificazione delle modifiche strutturali (Dimensioni) e chimiche (intensità del segnale) in relazione al tempo.

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Analisi quantitativa delle immagini

r

r

r

r‘

ta

tc

tb

Informazioni in movimento

tatb

tctd

tete

Browniano AutoregressivoConnesso

E‟ importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l‟algoritmo adeguato alla loro identificazione .

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Analisi quantitativa delle immagini

Informazioni in movimento

StatisticaSelezione (filtro) Rappresentazione

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Analisi quantitativa delle immagini

Analisi di filamenti

•Misurazione dell‟albero dendritico•Identificazione delle spine e calcolo delle loro caratteristiche strutturali (volume, ect)

•Diametro dei filamenti.

•Statistica distribuzione spine•Orientamento dendriti•Analisi dei livelli dei branches (generazioni)•Classificazione spine

Definizione punto inizio Definizione punti massima intensità locale

Stack 3D

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Analisi quantitativa delle immagini

Analisi di filamenti

Soglia intensità di fluorescenza Calcolo diametro filamenti (proporzionale al segnale)

Identificazione spine

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Analisi quantitativa delle immagini

Analisi di filamenti

Classificazione morfologica spineEstrazione misure

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Analisi quantitativa delle immagini

Analisi di filamenti

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche spettrali (lunghezze d‟onda) di emissione differenti.

Originale Isosurface struttura Mascheratura Colocalizzazione Isosurface

Qualsiasi quantificazione morfometrica, morfologica, di intensità su segnali statici o

dinamici

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Obiettivo Calcolo di coefficienti statistici atti a valutare il grado di sovrapposizione dei segnali

Coefficiente di Pearson - Misura la sovrapposizione tra i pixelCoefficienti di Manders - Misura il contributo di sovrapposizione di un canale rispetto all‟altroCoefficiente di correlazione -Misura il grado di correlazione tra i due canali

si considerano inoltre :Numero di voxel colocalizzati, volume sopra soglia colocalizzato, materiale sopra soglia materializzato..

L’analisi della colocalizzazione richiede:1. Basso livello di rumore2. Segnali non saturati3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through)4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore)5. Registrazione XYZ perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico)6. Rimozione del fuori fuoco

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Punto critico : definizione della soglia di colocalizzazione dei singoli canali

Interpolazionelineare dei valori

Canale A

Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati

CanaleB

• L„algoritmo proposto da Costes e Lockett (NCI/NIH) si basa sulla esclusione delle coppie di intensitàche non mostranocorrelazione (coefficientedi Pearson =< 0).

• Partendo dalla coppia di valori di intensitàpiù alti, l‟algoritmo procede verso il basso della scala di intensità lungo la linea diinterpolazione calcolata. Il coefficiente diPearson viene calcolato per tutti i valori al disotto della soglia corrente . L‟algoritmoprocede fino a quando il coefficiente diPearson raggiunge il valore 0 (o diventanegativo).

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Interpolazionelineare dei valori

Canale A

Coefficiente di Pearson = 0 per valori di soglia inferiori a quelli impostati

CanaleB

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale

17 pixel su 40 presenti sono colocalizzati.

Dato significativo o casuale?

La risposta attraverso il calcolo del coefficiente di probabilità

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Punto critico : valutazione della probabilità di colocalizzazione casuale

• Il coefficiente di correlazione di Pearson viene calcolato su uno dei due canali (PCC 1).

• Il secondo canale viene sottoposto ad un processo di smoothing (PSF size).

• Successivamente i pixel che compongono ilsecondo canale vengono riposizionati nellamatrice in tutte le combinazioni possibili ed irispettivi coefficienti di Pearson calcolati.

• Il coefficiente di Pearson del primo canaleviene confrontato con la distribuzione deicoefficientidi Pearson calcolati sul secondocanale.

• Se il coefficiente di Pearson del primo canalenon è superiore al 95% della distribuzioneottenuta sul secondo canale la probabilitàche la colocalizzazione sia casuale è reale.L‟immagine deve essere scartata.

P = 0.97% P = 0.55%

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Analisi quantitativa delle immagini

Apertura al mondo esterno

Programma IMARIS

Piattaforme di analisi e calcolo

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GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !

Immagini & Computer SncVia Don Carlo Riva 4

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La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS

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Analisi quantitativa delle immagini

Colocalizzazione di segnale

Valutazione del livello di sovrapposizione spaziale di due segnali fluorescenti aventi caratteristiche spettrali (lunghezze d‟onda) di emissione differenti.

L’analisi della colocalizzazione richiede:1. Basso livello di rumore2. Segnali non saturati3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleed through)4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore)5. Registrazione XYZ perfetta tra i due fluorocromi (shifting ottico)6. Rimozione del fuori fuoco