Analisi microbiologica di vini e mosti · di peptidoglicano e la deidratazione provocata...

Esemplare certificato conforme Tbilisi, il 25 giugno 2010

Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale

Federico CASTELLUCCI © OIV 2010

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RISOLUZIONE OIV/ENO 206/2010 ANALISI MICROBIOLOGICA DI VINI E MOSTI – REVISIONE DELLA RISOLUZIONE ENO 8/95 L’ASSEMBLEA GENERALE Visto l’articolo 2, paragrafo 2 IV, dell’accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell’Organizzazione Internazionale della Vite e del Vino, Considerata la risoluzione Oeno 8/1995 adottata nel 1995, riguardante l’Analisi microbiologica di vini e mosti Considerati i lavori del gruppo di esperti “Specifiche dei prodotti enologici” e del gruppo di esperti “Microbiologia” DECIDE di sostituire l’attuale risoluzione con il seguente metodo nella Raccolta dei metodi internazionali di analisi del vino e dei mosti:

Analisi microbiologica di vini e mosti Rilevazione, differenziazione e conteggio dei micro-organismi

Obiettivo: L’analisi microbiologica è volta a seguire la fermentazione alcolica e/o la fermentazione malolattica e a rilevare le infezioni microbiologiche, nonché a permettere la rilevazione di qualsiasi anomalia, non solo nel prodotto finito, ma anche durante le varie fasi della produzione.

Commenti: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti nelle normali condizioni di asetticità microbiologica, utilizzando materiale sterilizzato sulla fiamma di un becco Bunsen o in una camera a flusso laminare ed esponendo alla fiamma le aperture di pipette, provette, beute ecc. Prima di eseguire l’analisi microbiologica occorre assicurarsi che i campioni da analizzare siano prelevati correttamente.

Campo d’applicazione: L’analisi microbiologica può essere applicata a vini, mosti, mistelle e a tutti gli analoghi prodotti, anche quando siano stati mutati dall’attività batterica. Tali metodi sono inoltre adeguati all’analisi delle preparazioni industriali di microrganismi selezionati, lieviti LSA e batteri lattici.

Tecniche di analisi microbiologica: 1. Reagenti e materiali: 2. Impianti e attrezzature 3. Campionatura 4. Test di qualità 4.1. Obiettivo 4.2. Principio




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4.3 Modalità operativa 4.3.1 Test di tenuta all’aria 4.3.2. Test di qualità dell’incubatore

5. Tecniche di microscopia per la rilevazione, differenziazione di micro-organismi e conteggio diretto dei lieviti 5.1. Esame microscopico di liquidi o depositi 5.2. Colorazione di Gram per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo 6) 5.3. Test catalasi per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo 6) 5.4. Conteggio delle cellule di lievito - emocitometria 5.5. Conteggio delle cellule di lievito – colorazione al blu di metilene delle cellule di lievito

6. Conteggio dei micro-organismi per coltura

6.1 Rilevazione, differenziazione e conteggio dei micro-organismi (conta in piastra)

6.2. Coltura in ambiente liquido – “Numero più probabile” (MPN). 1. REAGENTI E MATERIALI Normali attrezzature e dispositivi da laboratorio, come elencato in ISO 7218:2007 – Microbiologia del cibo e dei mangimi per animali – Regole generali degli esami microbiologici. Si raccomandano i seguenti: - Normali materiali e vetreria da laboratorio, sterili (sterilizzati o sterili pronti all’uso). - Provette (16x160 mm o simili) contenenti 9 mL di acqua al peptone sterile (Triptone: 1 g/l) o altri diluenti da usare per le diluizioni in serie dei campioni. - Etanolo per flambare spatole e pinzette. - Soluzione al 3% di perossido di idrogeno. - Micropipette con puntali sterili: da 1 mL e 0,2 mL. - Bacchette di vetro piegate a L o a triangolo (“asta di Digralsky”) o spatole di plastica. - Pinzette d’acciaio inossidabile a bordi piatti. - Membrane sterili di porosità 0,2 e 0,45 µm di estere cellulosico (o equivalente), del diametro di 47 o 50 mm, possibilmente con una griglia stampata sulla superficie e confezionate singolarmente. - Bicchieri sterili. - Pipette sterili da 10 mL. 2. IMPIANTI E ATTREZZATURE Normali attrezzature e dispositivi da laboratorio, come elencato in ISO 7218:2007 – Microbiologia del cibo e dei mangimi per animali – Regole generali degli esami microbiologici. Si raccomandano i seguenti: - Camera sterile o cappa a flusso laminare. In mancanza di un tale dispositivo, lavorare il prossimità (entro i 50 cm) di un Bunsen- - Bilancia analitica con precisione di ± 0,01 g. - Autoclave. - Incubatore, regolabile da 25°C a 37°C. - pH-metro, con precisione di ± 0,1 unità pH e soglia minima di misurazione di ± 0,01 unità pH. - Frigorifero(i) regolato(i) su 5 ± 3°C, e congelatore(i) con temperatura inferiore ai –18°C, preferibilmente pari a – 24 ± 2°C. - Bagno termostaticamente controllato, regolato su 45 ± 1°C - Forno a microonde. - Microscopio ottico.




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- Bruciatore a gas. - Dispositivo di conteggio delle colonie. - Attrezzatura per la coltura in atmosfera modificata (una beuta sigillata entro il quale può avvenire l’anaerobiosi). - Dispositivo di filtrazione con filtri del diametro di 47 o 50 mm. - Agitatore “Vortex” o equivalente. - Incubatore per la sterilizzazione a secco; - Centrifuga; - Pompa da vuoto 3. CAMPIOMENTO Il campione deve riprodurre la microbiologia dell’intera massa di mosto o vino da analizzare. Nei limiti del possibile, la massa deve essere omogeneizzata prima della campionatura, per rimettere in sospensione i micro-organismi che tendono a depositarsi sul fondo del contenitore. Qualora l’omogeneizzazione non sia auspicabile, occorre prelevare i campioni là dove è probabile (o si suppone) che siano presenti i micro-organismi (per esempio quando si cercano i lieviti sul fondo dei serbatoi o delle botti); in questo caso, però, i risultati non sono quantitativi. Prima di prelevare un campione da un rubinetto, occorre esporre quest’ultimo alla fiamma e farvi scorrere 2-3 litri di liquido. Il campione deve essere posto in un contenitore sterile. Il campione deve essere tenuto in luogo fresco e analizzato il più rapidamente possibile. Per l’analisi microbiologica sono richieste le seguenti quantità di campioni: Mosto, o mosto in fermentazione o vino in botte: almeno 250 mL; Vino in bottiglia o in pack: almeno un’unità, indipendentemente dalla capacità;

4. TEST DI QUALITÀ 4.1 Obiettivo Questi test sono volti alla rilevazione anticipata delle infezioni microbiche. 4.2 Principio Questa tecnica si basa sui cambiamenti organolettici e d’aspetto (intorbidamento, pellicole, depositi, colori insoliti) mostrati dal vino sottoposto a determinate condizioni di aerazione e temperatura che possono provocare attività microbiologica. La natura dei cambiamenti deve essere confermata dall’esame microscopico. 4.3 Procedura 4.3.1 Test di qualità dell’aria Un campione di 50 mL di vino, dopo filtrazione su carta filtrante sterile di grana grossa, è posto in una beuta conica sterile tappata con cotone e lasciato a temperatura ambiente per almeno 3 giorni. Durante questo periodo di tempo se ne esamina la trasparenza, il colore e l’eventuale presenza di velature, depositi e pellicole. In caso di velature, depositi, pellicole o cambiamento di colore, si esegue un esame al microscopio. 4.3.2 Test di qualità dell’incubatore Un campione di 100 mL di vino, dopo filtrazione su carta filtrante sterilizzata di grana grossa, è posto in una beuta conica sterile da 300 mL tappata con cotone, inserito in un incubatore a 30°C ed esaminato dopo almeno 72 ore. Gli eventuali cambiamenti organolettici o visivi possono indicare uno sviluppo microbico. In questo caso si deve procedere a un esame al microscopio.




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5. TECNICHE MICROSCOPICHE PER LA RILEVAZIONE, LA DIFFERENZIAZIONE DI MICRO-ORGANISMI E IL CONTEGGIO DIRETTO DEI LIEVITI 5.1 Esame microscopico di liquidi o depositi Obiettivo: L’esame microscopico sul fresco serve a rilevare e differenziare per dimensione e forma i lieviti dai batteri eventualmente presenti. L’osservazione al microscopio non può distinguere tra micro-organismi vitali e non vitali. Nota: Una valutazione dei lieviti vitali può essere realizzata con una colorazione adeguata (vedi oltre) Principio: Questa tecnica si basa sull’ingrandimento ottenuto con un microscopio che permette di osservare i micro-organismi con dimensioni nell’ordine di un micron. Procedura: L’esame microscopico può essere eseguito direttamente sul liquido o sul deposito. L’osservazione diretta del liquido è utile solo in caso di popolazione sufficientemente grande (più di 5 x 105 cellule/mL). Se il vino presenta una popolazione di micro-organismi inferiore, occorre concentrare il campione. A questo scopo si centrifugano 10 mL di vino omogeneizzato a 3000 – 5000 giri/min per 5 – 15 minuti. Dopo la decantazione del surnatante, il deposito deve tornare in sospensione nel liquido rimanente in fondo al tubo da centrifuga. Per eseguire l’osservazione al microscopio, si pone una goccia del campione di liquido o del deposito omogeneizzato su un vetrino pulito con una pipetta Pasteur o con un filo metallico sterilizzato. Si copre con un vetrino di protezione e si pone su una guida del piatto del microscopio. L’osservazione si esegue a campo trasparente o, preferibilmente, a contrasto di fase per ottenere una migliore osservazione dei dettagli. Si utilizza di solito un ingrandimento di 400x – 1000x. 5.2. Colorazione di Gram per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo 6) Obiettivo: La colorazione di Gram è usata per differenziare i batteri lattici (Gram-positivi) dai batteri acetici (Gram-negativi) e anche per osservarne la morfologia. Nota: Occorre ricordare che la colorazione di Gram non è conclusiva, dato che possono essere presenti anche batteri diversi da quelli lattici e acetici. Principio: Questo colore è basato sulla differenza tra i batteri Gram-positivi e Gram-negativi dovuta alle differenze di struttura e di composizione chimica delle loro pareti cellulari. Le pareti cellulari dei batteri Gram-negativi sono ricche di lipidi e molto povere di peptidoglicano che permette la penetrazione di alcool in grado di dissolvere il complesso violetto di metile-iodio formatosi quando si lascia la cellula incolore che è quindi ricolorata in rosso con safranina. Le pareti cellulari dei batteri Gram-positivi, invece, contengono una grande quantità di peptidoglicano e una bassa concentrazione di lipidi. La spessa parete di peptidoglicano e la deidratazione provocata dall’alcool non consentono perciò all’alcool di entrare nella cellula, che conserva la colorazione violetta o blu scuro del complesso violetto di metile-iodio. Esistono numerose modifiche alla tecnica di colorazione di Gram. Essa perde utilità se eseguita su una coltura troppo vecchia. Il batterio deve perciò trovarsi in una fase di crescita esponenziale entro 24 – 48 ore. Si esegue la colorazione di Gram dopo aver isolato le colonie e messo in coltura liquida. Soluzioni: Si deve utilizzare acqua distillata. 1. Soluzione di violetto di metile Preparazione: Pesare 2 g di violetto di metile e metterlo in una beuta da 100 mL, quindi sciogliere in 20 mL di alcool al 95% vol. Sciogliere 0,8 g di ossalato di ammonio in 80 mL d'acqua distillata. Mescolare insieme le due soluzioni e usare solo dopo 24 ore. Filtrare con un filtro di carta al momento dell’uso. Conservare in una beuta scura e al riparo dalla luce.




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2. Liquido di Lugol Preparazione: Sciogliere 2 g di ioduro di potassio in una quantità minima d’acqua (da 4 a 5 mL) e sciogliere 1 g di iodio in questa soluzione satura. Portare al volume di 300 mL con acqua distillata. Conservare in una beuta scura e al riparo dalla luce. 3. Soluzione di safranina: Preparazione: Pesare 0,5 g di safranina in una beuta conica da 100 mL, sciogliere con 10 mL di alcool al 95% vol. e aggiungere 90 mL d’acqua. Agitare. Conservare in una beuta scura e al riparo dalla luce. Procedura: Preparazione dello striscio Realizzare una coltura dei batteri in terreno di coltura liquido o solido. Raccogliere la coltura giovane dei batteri dal deposito (dopo centrifugazione della coltura liquida) o direttamente dal terreno di coltura solido con un’ansao un filo metallico e mescolare in una goccia d’acqua sterilizzata. Fare uno striscio su un vetrino, spalmando una goccia della sospensione microbica. Lasciare asciugare lo striscio, quindi procedere a fissare, passando rapidamente il vetrino per 3 volte attraverso la fiamma di un becco Bunsen o equivalente. Dopo il raffreddamento, eseguire la colorazione. Colorazione Versare qualche goccia di soluzione di violetto di metile sullo striscio fissato. Lasciare reagire per 2 minuti ed eliminare lavando con acqua. Versare 1 o 2 gocce di liquido di Lugol. Lasciare reagire per 30 secondi. Lavare con acqua e asciugare con carta da filtro. Versare alcool al 95% vol. e lasciarlo per 15 secondi. Sciacquare con acqua e asciugare con carta da filtro. Versare alcune gocce di soluzione di safranina, lasciare reagire per 10 secondi. Lavare con acqua e asciugare con carta da filtro. Porre una goccia d’olio da immersione sullo striscio. Osservare al microscopio, con l’obiettivo a immersione, in campo chiaro. Risultati: I batteri lattici restano colorati in violetto o blu scuro (Gram-positivi). I batteri acetici sono colorati in rosso (Gram-negativi). 5.3 Test catalasi per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo 6) Obiettivo: Questo test serve a distinguere i batteri acetici e quelli lattici. I lieviti e i batteri acetici hanno una reazione positiva. I batteri lattici danno una risposta negativa. Commenti: Occorre considerare che il test della catalasi non è sufficiente, dato che possono essere presenti anche batteri diversi da quelli lattici e acetici. Principio: Il test catalasi si basa sulla proprietà dei micro-organismi aerobici di decomporre il perossido di idrogeno con rilascio di ossigeno: catalasi 2H2O2 2H2O + O2

Reagente: Soluzione di perossido di idrogeno a 12 volumi (3%). Preparazione: Misurare 10 mL di perossido di idrogeno al 30% vol. in una beuta tarata da 100 mL e riempire con acqua distillata appena bollita. Agitare e tenere in frigorifero entro una beuta scura. La soluzione deve essere preparata al momento. Procedura: Mettere una goccia di perossido di idrogeno al 3% vol. su un vetrino e aggiungere un piccolo campione di colonia giovane. In presenza di rilascio di gas, si può concludere che la coltura presenta attività di catalasi. Qualche volta è difficile osservare immediatamente il rilascio del gas, soprattutto con le colonie batteriche. Si consiglia perciò di osservare la coltura con un microscopio (obiettivo 10x).




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5.4. Conteggio delle cellule di lievito – Emocitometria 5.4.1 Campo d’applicazione Determinazione della concentrazione delle cellule di lievito nei vini o nei mosti in fermentazione e del LSA (lievito secco attivo). Occorre un’elevata concentrazione di cellule: almeno 5 × 106 cellule/mL. I vini e i mosti in fermentazione possono essere conteggiati direttamente, mentre l’ADY deve essere diluito 1000 o 10 000 volte. I mosti o i vini contenenti una quantità inferiore di cellule devono essere centrifugati (3000 g per 5 minuti) e il sedimento va rimesso in sospensione in un volume noto . 5.4.2 Principio Si mette una goccia di sospensione di cellule di lievito sulla superficie di un vetrino con una camera di conteggio. La camera di conteggio ha un volume definito ed è suddivisa in quadrati sulla superficie del vetrino. Il conteggio è eseguito sotto il microscopio in campo chiaro. In caso di cellule colorate, l’osservazione in contrasto di fase non è indicata. 5.4.3 Reagenti e materiali - Emocitometro, camera contaglobuli, preferibilmente con fermagli: Bürker, Thoma, Malassez, Neubauer. - Vetrino coprioggetti per emocitometro: I comuni vetrini di protezione scorrevoli (larghi 0,17 mm) non sono adatti a questo impiego, perché sono flessibili e non garantiscono la costanza della larghezza della camera. - Pipette, puntali sottili, con volume di 1 e 10 mL. - Beute volumetriche, 100 mL. - Beaker, 250 mL. 5.4.4 Impianti e attrezzature - Microscopio con illuminazione a campo luminoso: ingrandimento 250-500x. Contrasto di fase controindicato. - Piatto magnetico e barra di agitazione. Sono disponibili haemocitometri con varie camere di conteggio: Bürker, Thoma, Malassez, Neubauer. Confermare il tipo e il volume della camera di conteggio da utilizzare. Le camere Bürker, Thoma e Neubauer hanno una profondità di 0,1 mm, la cellula di Malassez 0,2 mm. La camera Thoma ha un unico, grande (1 mm2) quadrato centrale, perciò il suo volume è di 0,1 mm3 (10-4 mL). Questo grande quadrato è suddiviso in 16 quadrati, ciascuno dei quali è suddiviso in 16 quadrati più piccoli. Questi quadrati più piccoli hanno lati di 0,05 mm x 0,05 e profondità di 0,1 mm, perciò il volume do ogni quadratino è di 0,00025 mm3 (25 x 10-8 mL). Si possono anche riconoscere dei quadrati medi. Ogni quadrato medio ha 16 quadratini di lato 0,2 mm e volume di 0,004 mm3, pari a 4 x 10-6 mL. La camera Bürker contiene 9 quadrati grandi con lati di 1 mm², suddivisi in 16 quadrati medi con lati di 0,2 mm separati da doppie linee distanti 0,5 mm. La superficie di ogni quadrato medio è di 0,04 mm² e il loro volume di 0,004mm3. I quadratini formati dalle doppie linee hanno una superficie di 0,025mm². I quadrati grandi, medi e piccoli delle camere Neubauer, Thoma e Bürker hanno le stesse dimensioni. I quadrati medi della camera Bürker non contengono altre linee all’interno, perciò sono probabilmente quelli che consentono il conteggio più facile. 5.4.5 Tecniche di esame La camera di conteggio e il vetrino coprioggetti devono essere puliti e asciutti prima dell’uso. Potrebbe essere necessario strofinare l’area quadrettata, poiché le camere sporche influenzano il volume del campione. Pulire con acqua demineralizzata o etanolo e asciugare con carta morbida. Se si deve eseguire il conteggio su lievito flocculento, il terreno di sospensione deve essere acido solforico allo 0,5%, per evitare la flocculazione, ma in questo modo si compromette la possibilità di colorazione al blu di metilene e di conteggiare le cellule vitali e quelle morte. La nuova immissione in sospensione può essere effettuata mediante sonicazione. Porre il campione sul vetrino servendosi di una pipetta a puntale sottile, secondo una delle due procedure seguenti.




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Procedura 1 Mescolare bene la sospensione di lievito. Se occorre diluire, ottenere le solite diluizioni decimali. Per eseguire una colorazione al blu di metilene, applicarla al campione più diluito e mescolare 1 mL di campione con 1 mL di soluzione di blu di metilene. Agitare costantemente la sospensione del lievito. Prelevare un campione con una pipetta a puntale sottile, espellere 4-5 gocce di sospensione e depositare una piccolo goccia di sospensione di lievito (eventualmente diluita) su ciascuna delle due aree quadrettate del vetrino. Coprire con il vetrino coprioggetti entro 20 secondi e premere saldamente con i fermagli. L’area di conteggio deve essere completamente piena, ma il liquido non deve assolutamente giungere alla depressione circostante. Procedura 2 Porre il vetrino rigido di protezione in modo che entrambe le camere di conteggio siano ugualmente coperte. Usare i fermagli per premere il vetrino coprioggetti contro le superfici di contatto, fino al comparire di linee iridescenti (anelli di Newton). In assenza di fermagli, non spostare il vetrino coprioggetti durante il riempimento della camera. Agitare costantemente la sospensione del lievito. Prelevare un campione con una pipetta a puntale sottile, espellere 4-5 gocce di sospensione e lasciare fluire una piccola goccia di campione tra l’emocitometro e il vetrino coprioggetti. Fare lo stesso sull’altra parte della striscia. L’area di conteggio deve essere completamente piena, ma il liquido non deve assolutamente giungere alla depressione circostante. Lascare riposare per tre minuti il vetrino preparato, per consentire alle cellule di lievito di stabilizzarsi, quindi porlo sotto il microscopio. Conteggiare 10 quadrati medi in ciascuna area quadrettata; occorre stabilire procedure standardizzate per evitare di contare due volte lo stesso quadrato. Non si contano le cellule che toccano o attraversano le linee di delimitazione in alto o a destra dei quadrati; si contano quelle che toccano o attraversano le linee di delimitazione in basso o a sinistra. Le cellule di lievito in fase di gemmazione si contano come una cellula unica se le dimensioni della gemma sono inferiori alla metà della cellula madre, altrimenti si contano come due cellule. Per ottenere conteggi precisi delle cellule, è consigliabile contare in media 200 – 500 cellule di lievito in tutto. I conteggi sulle due facce del vetrino devono concordare entro il 10%. Se si utilizza una diluizione, occorre usare nel calcolo il fattore di diluizione. 5.4.6 Espressione dei risultati Per la camera Thoma Sia C il numero medio di cellule contate in un quadrato medio con lati di 0,02 mm; la popolazione T totale nel campione è allora: Espressa in cellule/mL T= C x 0,25 x106 x fattore di diluizione Per la camera Bürker Sia C il numero medio di cellule contate in un quadrato piccolo con lati di 0,05 mm; la popolazione T totale nel campione è allora: Espressa in cellule/mL T= C x 4 x106 x fattore di diluizione 5.4.7 Riferimenti European Brewery Convention. Analitica Microbiologica – EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001 5.5 Conta delle cellule di lievito – Colorazione al blu di metilene delle cellule di lievito 5.5.1 Campo d’applicazione Questo metodo consente di valutare rapidamente la percentuale di cellule vitali di lievito, che non assumono colorazione, dato che le cellule morte si colorano di blu. Questo metodo è applicabile a tutti i campioni contenenti lieviti, tranne i mosti contenenti più di 100 g/l di zucchero. I batteri sono troppo piccoli, perciò la loro colorazione non è rilevabile con questo metodo. Nota: è importante la focalizzazione delle cellule a varie profondità, per visualizzarne correttamente la colorazione con il blu di metilene..




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5.5.2 Principio Il blu di metilene è trasformato nel suo derivato incolore dall’attività riduttrice delle cellule di lievito vitali. Le cellule di lievito morte assumeranno la colorazione blu. La vitalità si calcola sulla base del rapporto tra cellule vitali e le cellule totali. Questo metodo sovrastima la vitalità “reale” se le cellule vitali sono meno dell’80%, poiché esso non fa distinzione tra le cellule "vive" e la loro capacità di riprodursi (Cellule vitali ma non adatte a coltura). Se la concentrazione di zucchero supera i 100 g/l, quasi tutte le cellule sono celesti, rendendo sconsigliabile questo metodo. Il colorante non può funzionare correttamente con i vini a basso pH e fortemente tamponati. In questi casi il conteggio va eseguito almeno sulla prima diluizione decimale. 5.5.3 Reagenti e materiali Soluzione A: Soluzione di blu di metilene in acqua distillata, 0,1 g/500 mL. Soluzione B: Soluzione di KH2PO4,in acqua distillata, 13,6 g/500 mL. Soluzione C: Soluzione in acqua distillata di Na2HPO4 x 12 H2O, 2,4 g/100 mL Soluzione D: 498.75 mL di Soluzione B + 1,25 mL di soluzione C. Soluzione E: Mescolare i 500 mL di soluzione D con 500 mL di soluzione A per ottenere la soluzione finale tamponata di blu di metilene, con pH 4,6 circa. 5.5.4 Impianti e attrezzature Microscopio, 250-500 x ingrandimenti. Contrasto di fase controindicato. Vetrini e vetrini di protezione scorrevoli per microscopio o emocitometro (camera di Thoma, Bürker o Neubauer). Provette da test e asta agitatrice. Pipette, puntali sottili. 5.5.5 Tecniche di esame Determinazione della vitalità Diluire il lievito in sospensione con la soluzione di blu di metilene in una provetta da test, fino a che la sospensione non abbia circa 100 cellule di lievito in un campo microscopico. Deporre una piccola goccia di sospensione ben mescolata su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino coprioggetti. Esaminare al microscopio con un ingrandimento di 400 x entro 10 minuti dal contatto con il colorante. Contare un totale di 400 cellule, annotando il numero di cellule morte, rotte, avvizzite e plasmolizzate colorate di blu. Le cellule di lievito in fase di gemmazione si contano come una cellula unica se le dimensioni della gemma sono inferiori alla metà della cellula madre. Se le dimensioni della gemma sono uguali o maggiori di metà di quelle della cellula madre, si contano entrambe le cellule. Le cellule colorate di celeste vanno considerate vive. 5.5.6 Espressione dei risultati Siano T il numero totale delle cellule e C il numero delle cellule colorate di blu; la percentuale delle

cellule vitali è allora 100xT

CT

5.5.7 Riferimenti European Brewery Convention. Analitica Microbiologica – EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001 6. CONTA DEI MICRO-ORGANISMI PER COLTURA Obiettivo: Lo scopo del conteggio dei micro-organismi per coltura è di valutare il livello di contaminazione del campione, valutandone cioè la prodotto quantità di microrganismi coltivabili. Secondo il terreno di coltura usato e le condizioni di coltura, si possono contare tre tipi di micro-organismi: i lieviti, i batteri lattici e i batteri acetici e muffe. Principio: Il conteggio per coltura si basa sul fatto che i micro-organismi viventi sono in grado di moltiplicarsi in terreno nutriente e in adeguate condizioni d’incubazione per formare delle colonie sul mezzo solidificato




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da agar o un intorbidamento in ambiente liquido. In ambiente agar una cellula produce mediante moltiplicazione un ammasso di cellule visibile a occhio nudo chiamato colonia. 6.1 Rilevazione, differenziazione e conta dei micro-organismi (conta in piastra). 6.1.1 Campo d’applicazione Questo standard fornisce una guida generale al conteggio dei lieviti, delle muffe e dei batteri lattici e nei batteri acetici nei mosti, nei mosti concentrati, nei mosti parzialmente fermentati, nei vini (compresi i vini spumanti) durante la loro produzione e dopo l’imbottigliamento, contando le colonie cresciute su un terreno di coltura solido dopo adeguata incubazione. Lo scopo dell’analisi microbiologica è di controllare il processo di vinificazione per prevenire il deterioramento microbico di mosti o vini. 6.1.2 Terminologia e definizioni I termini “piastra” e “scatola di Petri” sono usati come sinonimi. CFU = Unità formanti colonie (Colony Forming Units). 6.1.3 Metodo Il numero dei micro-organismi vitali presenti nei mosti o nei vini si determina spalmando un piccolo volume noto di campione sulla superficie di un terreno di coltura o con l’aggiunta secondo il metodo di incorporazione (vedere par. 6.1.7.4), e incubando le piastre per il tempo necessario nelle condizioni migliori per la crescita dei micro-organismi. Ogni cellula - o ammasso di cellule – si suddivide e cresce in un ammasso, diventando visibile come colonia. Il numero di colonie trovate sulla superficie di una piastra indica le cellule presenti nel campione originale, perciò i risultati sono espressi come CFU. Se si suppone che il campione abbia un numero elevato di cellule, occorre realizzare le opportune diluizioni decimali in serie per ottenere colonie in numero variante tra 10 e 300 per ogni piastra. Se si suppone che il campione abbia un basso numero di CFU, occorre raccogliere queste ultime sulla superficie di un filtro sterile da 0,45 a 0,88 µm per i lieviti e da 2,22 a 0,45 µm per i batteri, che va quindi posto nella scatola di Petri sulla superficie del terreno di coltura. Il campo di variabilità della misurazione con questo metodo passa da < 1 CFU/(volume analizzato) a 109 CFU/mL o 1010 CFU/g nel campione originale. 6.1.4 Reagenti e materiali Quelli indicati nel paragrafo 1 della risoluzione, più: - Provette (16x160 mm o simili) contenenti 9 mL di acqua al peptone sterile (Triptone: 1 g/l) o altri diluenti da usare per le diluizioni dei campioni (Allegato 4). Un numero di massima delle provette necessarie per i seguenti campioni è fornito qui sotto: Mosti non fermentati: 4 / campione. Mosti in fermentazione: 7 / campione. Vini immagazzinati: 2 / campione. - Micropipette con puntali sterili: da 1 mL e 0,2 mL. - Aste di vetro piegate a L o a triangolo (“aste di Digralsky”) o spatole di plastica. - Scatole di Petri con diametro di 90 mm (con 15-20 ml di terreno di coltura) (56 cm2) per la tecnica di coltura in piastra, e piastre con diametro di 90 mm o 60 mm (con 6-8 ml si terreno di coltura) per la tecnica della membrana filtrante, riempite 18-24 ore prima con 15-20 mL di terreno di coltura (semplice o in duplicato scatole per ogni campione testato): - Per conteggi dei lieviti e delle muffe: YM, YEPD, Agar nutriente WL, Agar per lieviti o Agar TGY (Triptone-glucosio-estratto di lievito) o equivalente se convalidato. Se si cercano lieviti diversi dai Saccharomyces Agar alla lisina e piastre con Agar differenziale WL (allegato 1) o equivalente se convalidato se si cercano lieviti non Saccharomyces (Allegato 5 terreno di coltura). - Per i conteggi dei batteri acetici: Agar GYC, G2 o terreno di coltura Kneifel (Allegato 5 terreno di coltura) o equivalente se convalidato. - Per i conteggi dei batteri lattici: MRS più 20% di succo di pomodoro (o di mela o d’uva), o Agar ATB modificato (terreno di coltura dell’Oenococcus oeni), o Agar TJB plus, o terreno di coltura di Lafon-Lafourcade, terreno di coltura 104, Agar MTB (Allegato 5 terreno di coltura) o equivalente se convalidato. - Per il conteggio dei funghi filamentosi si usano l’Agar modificato di Czapek-Dox, Agar DRBC o MEA addizionato con tetraciclina (100 mg/l) e streptomicina (100 mg/l). (Allegato 5 terreno di coltura) o equivalente se convalidato




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- Occorre aggiungere antibiotici per rendere il conteggio selettivo, poiché nel vino tutti i micro-organismi si trovano insieme (vedere Allegato I terreni di coltura) 6.1.5 Impianti e attrezzature Quelli indicati nel paragrafo 2 della risoluzione. 6.1.6 Campionatura Come indicato nel paragrafo 3 della risoluzione. Per la conta in piastra sono richieste le seguenti quantità di campioni: Mosto, o mosto in fermentazione o vino in botte: almeno 250 mL; Vino in bottiglia o in pack: almeno un’unità, indipendentemente dalla capacità; 6.1.7 Tecniche di esame 6.1.7.1 Prerequisiti Tutti i materiali e le attrezzature usati nei test devono essere sterili, e tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni asettiche. La cappa a flusso laminare deve essere messa in funzione 5 minuti prima di iniziare il lavoro, in modo da avere un flusso sterile e stabile. 6.1.7.2 Sterilizzazione I terreni di coltura devono essere sterilizzati in autoclave a 121°C per almeno 15 minuti (20 minuti per grandi volumi). I materiali sterili monouso e la vetreria devono essere aperti e utilizzati sotto la cappa a flusso laminare. Le pinzette e le spatole devono essere immerse in etanolo e passate alla fiamma prima dell’uso. Gli imbuti d’acciaio inossidabile devono essere passati alla fiamma con etanolo dopo ogni utilizzo, mentre gli imbuti di vetro o di policarbonato devono essere messi in autoclave prima dell’uso, in modo da averne a disposizione tanti quanti sono i campioni testati. 6.1.7.3 Diluizione del campione (Allegato 1) Un mL di campione è trasferito con una pipetta in una provetta sterile con 9 mL di acqua e peptone. La provetta è agitata con un agitatore “Vortex” per 20 secondi. Questa è la prima diluizione decimale, 1 mL della quale è trasferito nella successiva provetta sterile con 9 mL di acqua e peptone, a formare la seconda diluizione. Dopo 20 secondi di agitazione, si ripete l’operazione per tutte le volte necessarie. Un numero di massima delle diluizioni in serie necessarie per i seguenti campioni è fornito qui sotto: Mosti non fermentati: 4 diluizioni decimali. Mosti in fermentazione: 7 diluizioni decimali. Vini non filtrati durante la maturazione (conteggi dei lieviti): 2 diluizioni decimali. Vini non filtrati durante la maturazione (conteggi dei batteri lattici): 6 diluizioni decimali. Vini filtrati o in pack (imbottigliati) Nessuna diluizione. Mosti concentrati Diluire 10 mL in 100 mL di acqua e peptone (o 100 mL in 1000 mL). I vini imbottigliati o filtrati e i mosti concentrati dopo diluizione in acqua e peptone sterile si analizzano con la tecnica della membrana filtrante. 6.1.7.4 Preparazione delle piastre Occorre preparare le diluizioni in serie necessarie per il numero di campioni da coltivare in piastra. Se si devono coltivare in piastra molti campioni, si possono preparare più diluizioni in serie, ma ogni diluizione deve essere coltivata in piastra entro 20 minuti. Inoculare ciascuna piastra con 0,1 o 0,2 mL delle tre diluizioni più basse preparate, nel modo seguente: Mosti non fermentanti diluizioni -2; -3; -4. Mosti in fermentazione diluizioni -5; -6; -7. Vini non filtrati durante la maturazione diluizioni 0; -1; -2. In caso di dubbio, inoculare un numero maggiore di diluizioni, mai inferiore. In condizioni asettiche (preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare) spalmare il campione sulla superficie del terreno di coltura prima dell’assorbimento del liquido (di solito entro 1-2 minuti) con un’asta ripiegata di vetro sterile (“asta di Digralsky") o con un’astina monouso. Per ciascuna piastra si deve utilizzare un “asta di Digralsky ” separato, oppure si devono spalmare i campioni sulle piastre partendo dal




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campione più diluito e procedendo con quelli via via meno diluiti. Lasciare le piastre per alcuni minuti sotto il flusso di aria sterile, finché il liquido non sia assorbito. Nota 1: La coltura su piastra di 0,2 mL invece di 0,1 mL, come spesso indicato, consente una spalmatura più facile e ritardata. Occorre tenerne conto nei calcoli. Nota 2: Per il conteggio del lievito, si evita l’accrescimento batterico aggiungendo 50 mg/l di cloramfenicolo (o equivalente se convalidato) al terreno di coltura dopo averlo passato in autoclave, e l’accrescimento delle muffe aggiungendo 150 mg/L di difenile (o equivalente se convalidato). Nota 3: Per il conteggio dei batteri lattici, si evita l’accrescimento dei lieviti aggiungendo natamicina (pimaricina) (0,1 g/L) (o equivalente se convalidato) e l'accrescimento dei batteri acetici con l’incubazione anaerobica. Nota 4: Per il conteggio dei batteri acetici, si evita l’accrescimento del lievito aggiungendo natamicina (pimaricina) (0,1 g/L) (o equivalente se convalidato) e quello dei batteri lattici aggiungendo penicillina (12,5 mg/L). (o equivalente se convalidato) Gli antibiotici devono essere aggiunti dopo la sterilizzazione in autoclave. Quando si esegue una ricerca specifica del lievito non-Saccharomyces, inoculare come descritto in precedenza tre piastre di Agar lisina e tre piastre di Agar differenziale WL con le opportune diluizioni. - Metodo di incorporazione (metodo alternativo). Preparare e sterilizzare 15 mL di terreno di coltura in provette e tenere le provette a bagnomaria (o equivalente se convalidato) a 471°C. Versare 1 mL di campione o diluizione in una scatola di Petri vuota. Aggiungere 15 mL di terreno di coltura e agitare delicatamente la scatola di Petri, in modo da ottenere una distribuzione omogenea di micro-organismi all’interno della massa del terreno di coltura. Lasciare raffreddare e solidificare mettendo le scatole di Petri su una superficie orizzontale fredda (il tempo di solidificazione dell’agar non deve superare i 10 minuti). 6.1.7.5 Conteggio con concentrazione mediante filtrazione con membrana La porosità della membrana deve essere di 0,45 o 0,8 µm per il conteggio dei lieviti; di 0,2 o 0,45 µm per il conteggio dei batteri. La superficie della membrane deve essere preferibilmente coperta da una quadrettatura per facilitare il conteggio delle colonie. Le piastre sulle quali si pongono le membrane possono contenere un terreno di agar nutriente o un tampone, nel quale va disperso il terreno di coltura secco, imbevuto di acqua sterile immediatamente prima dell’uso. Alcuni fornitori offrono piastre sterili contenenti un cuscinetto sterile, sul quale si versa il contenuto di un terreno di coltura liquido sterile monouso da 2 mL immediatamente prima dell’uso. Assemblare asetticamente l’attrezzatura di filtrazione, sterilizzare l’imbuto come indicato in 9.2 e collegare alla pompa da vuoto. Mettere in funzione la pompa da vuoto. Immergere le pinzette nell’etanolo ed esporle alla fiamma: una volta spenta la fiamma, aspettare qualche secondo e, servendosi delle pinzette, mettere la membrana sul suo supporto nell’unità di filtrazione. Prima di aprire la bottiglia, agitarla per bene; immergere il collo della bottiglia capovolto in etanolo (per 1-2 cm) ed esporlo alla fiamma per sterilizzarlo. Prelevare tre quantità di ciascun campione: 10 mL con una pipetta sterile da 10 mL, 100 mL con una provetta cilindrica sterile da 100 mL, e il resto direttamente dalla bottiglia se applicabile. Per filtrare, versare il vino nell’imbutomLmL e attivare il vuoto. Una volta filtrato il quantitativo di vino desiderato, disattivare il vuoto, esporre le pinzette alla fiamma, aprire l’imbuto, tenere la membrana con le pinzette, deporne il lato opposto sul terreno di coltura solido di una piastra e farla aderire alla superficie del terreno di coltura, evitando la formazione di bolle sotto la membrana.




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6.1.7.6 Incubazione del campione Incubare anaerobicamente le piastre capovolte per 4 giorni a 25 ± 2C per i lieviti e i batteri acetici. Se la temperatura è < 23°C, prolungare l'incubazione di un altro giorno; se la temperatura è < 20°C prolungare di altri tre giorni. La temperatura massima non deve superare i 28°C. Nel caso dei conteggi dei lieviti Brettanomyces o Dekkera, raddoppiare il tempo di incubazione. In caso di conteggio dei LAB, disporre le piastre in un vaso o sacco anaerobico e incubarle capovolte per 10 giorni a 30 ± 2C. Se la temperatura è < 28°C, prolungare l’incubazione di un altro giorno; se è < 25°C, prolungarla di altri tre giorni. La temperatura massima non deve superare i 33°C. 6.1.8 Espressione dei risultati

6.1.8.1 Conta delle colonie di lievito e batteri: Contare le colonie cresciute in 4 giorni per i lieviti e i batteri acetici (8 giorni per i lieviti Brettanomyces/Dekkera), e 10 giorni per i eventualmente servendosi di un contatore di colonie e ignorando la diversa morfologia delle colonie se si esegue un conteggio dei lieviti totali, o tenendone conto se necessario. I terreni e le condizioni d’incubazione sono sufficientemente specifici affinché le colonie visibili ad occhio nudo permettano il conteggio dei vari tipi di micro-organismi . 6.1.8.2 Calcolo dei risultati. I risultati più affidabili provengono dalle piastre di conteggio contenenti 10-300 colonie (ISO 7218:2007 – Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Regole generali degli esami microbiologici). Calcolare il numero N di micro-organismi presenti nel campione testato come media ponderata di due successive diluizioni decimali servendosi dell’equazione seguente:

dV

CN

1,1

dove:

C è la somma delle colonie contate sulle due piastre tenute da due successive diluizioni decimali,

almeno una delle quali contiene un minimo di 10 colonie. V è il volume in millilitri dell’inoculo immesso in ciascuna piastra. d è la diluizione corrispondente alla prima diluizione tenuta [d=1 se si tiene il prodotto liquido non diluito (campione di test)]. In altre parole, se le piastre di due diluizioni decimali consecutive contengono 10-300 colonie, calcolare il numero di CFU/mL per ciascuna diluizione, quindi la media dei due valori: questo è il valore CFU/mL del campione. Se uno dei due valori è più del doppio dell’altro, considerare il più basso come CFU/mL. Arrotondare i risultati alla seconda cifra significativa solo al momento della conversione in CFU/mL ed esprimere i risultati come un numero tra 1,0 e 9,9 moltiplicato per l’opportuna potenza di 10 (ISO 7218:2007 – Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Regole generali degli esami microbiologici). Se i campioni sono stati inoculati in serie duplicate e una o due piastre, inoculate con la stessa diluizione, contengono colonie, per ottenere il numero di CFU/mL calcolare la media del numero di colonie e moltiplicarla per il reciproco del fattore di diluizione. Se nessuna piastra contiene da 10 a 300 colonie e tutte le piastre contengono più di 300 colonie, contare quelle meno affollate. Se contengono meno di 10 colonie/cm², conteggiare 12 quadrati di 1 cm2 e moltiplicare la media per 56 (l’area di una piastra del diametro di 90 mm); se le colonie sono più affollate, conteggiare 4 quadrati di 1 cm2 e moltiplicare la media per 56. Esprimere i risultati come “CFU/mL stimate”. Esprimere i risultati come TNTC (Troppo numerose per poterle contare) solo in assenza di ogni alternativa. Se le uniche piastre contenenti colonie ne contengono meno di 10, ma almeno 4, calcolare il risultato come nel caso generale e indicarlo come “CFU/mL stimate”.




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Se il totale è compreso tra 3 e 1, la precisione del risultato è troppo bassa e occorre riportarlo come “(i micro-organismi cercati) sono presenti, ma meno di 4 × d CFU/mL”. Se le piastre di tutte le diluizioni di un qualsiasi campione non presentano colonie, riferire il risultato come “meno di 1/d CFU/mL”, ma non escludere la possibile presenza di inibitori nel campione. Nel caso in cui si applica la tecnica di filtrazione su membrana, esprimere i risultati rispetto alla quantità di liquido filtrata, per esempio CFU/bottiglia, CFU/100 mL o CFU/10 mL. 6.1.9 Incertezza della misura 6.1.9.1 Criteri di controllo dei risultati. Per ciascuna serie di terreni di coltura, una piastra è usata come controllo di sterilità dopo la sterilizzazione. Una piastra per ogni terreno di coltura usato durante i test è lasciata aperta sotto la cappa a flusso laminare durante tutte le operazioni, come controllo di sterilità dell’ambiente di lavoro. Tale piastra sarà incubata come quelle inoculate. Periodicamente, un campione è inoculato in doppio e il Kp sperimentale si calcola con la seguente equazione:

21

21 ||

CC

CCKp

dove C1 e C2 sono i risultati dei due conteggi. Se Kp < 1,96 ≈ 2,0 i risultati sono accettabili: la media dei due conteggi può essere usata come risultato. Se 2,0<Kp ≤ 2,576 ≈ 2,6 la differenza dei due conteggi è critica e deve essere attentamente valutata prima di accettare i risultati come media dei due conteggi. Se Kp >2,6 la differenza dei due conteggi è anomala. Il risultato va scartato e occorre ripetere il test. In tal caso, il responsabile del laboratorio deve esaminare tutti i risultati ottenuti dopo gli ultimi accettabili. 6.1.9.2 Incertezza della misura Se il numero delle colonie contate nella piastra conteggiabile è inferiore a 10, il risultato è accettabile, ma si considera che la popolazione delle colonie segua la distribuzione di Poisson. La tabella seguente riporta il livello di confidenza del 95%, e pertanto l’incertezza della misura, del conteggio stimato su una singola scatola di Petri.




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Numero di colonie

Limite di confidenza al 95% Errore percentuale del limite*

Inferiore Superiore Inferiore Superiore 1 <1 6 -97 457 2 <1 7 -88 261 3 <1 9 -79 192 4 1 10 -73 156 5 2 12 -68 133 6 2 13 -63 118 7 3 14 -60 106 8 3 16 -57 97 9 4 17 -54 90 10 5 18 -52 84 11 6 20 -50 79 12 6 21 -48 75 13 7 22 -47 71 14 8 24 -45 68 15 8 25 -44 65 * Rispetto al conteggio dei micro-organismi (1ª colonna)

Se il conteggio delle colonie è >10, il limite di confidenza a un livello p di probabilità si calcola con la seguente equazione:

C = Ci Kp √Ci, dove Ci è il numero di colonie sulla piastra e Kp è il fattore di copertura. Il fattore di copertura è di solito 2 o 1,96. Il valore C è calcolato su ogni piastra e moltiplicato per il numero di diluizioni, insieme al risultato del conteggio.

6.2. Coltura in terreno di coltura liquido – “Numero più probabile” (MPN). 6.2.1 Obiettivo Questa tecnica serve a valutare il numero di micro-organismi vitali nei vini a elevato contenuto di particelle solide in sospensione e/o a elevata incidenza di tampone. 6.2.2 Principio Questa tecnica si basa sulla stima del numero di micro-organismi vitali in un terreno di coltura liquido, partendo dal principio della sua normale distribuzione nel campione. 6.2.3 Diluenti e terreni di coltura liquidi (Allegati 4 e 5) 6.2.4 Procedura Si preparano parecchie soluzioni quantitative e successive; dopodiché, dopo l’incubazione, una certa percentuale di test non porterà ad alcun accrescimento (test negativi), mentre altri inizieranno a presentare accrescimento (test positivi). Se il campione e le diluizioni sono omogenei e se il numero di diluizioni è sufficientemente elevato, i risultati possono essere elaborati statisticamente, utilizzando opportune tabelle (tabelle basate cui calcoli di probabilità di McCrady), ed estrapolati al campione iniziale. 6.2.5 Preparazione delle diluizioni Partendo da un campione di vino omogeneizzato, preparare una serie di diluizioni decimali (1/10) nel diluente. Prendere 1 mL di vino e aggiungerlo a 9 mL di diluente nella prima provetta. Omogeneizzare. Prendere 1 mL di questa diluizione e aggiungerla a 9 mL di diluente nella seconda provetta. Continuare seguendo questo protocollo di diluizione fino all’ultima diluizione adatta, in base alla popolazione microbica presunta, servendosi di pipette sterilizzate per ogni diluizione. Le diluizioni devono essere eseguite fino all’estinzione, cioè all’assenza di sviluppo nelle diluizioni più basse (Allegato 2).




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6.2.6 Preparazione delle inoculazioni Inoculare 1 mL di vino e 1 mL di ciascuna delle diluizioni preparate, mescolati al momento, rispettivamente in 3 provette contenenti l’opportuno terreno di coltura (Allegato 5). Mescolare accuratamente. Incubare le provette inoculate nell’incubatore a 25°C per i lieviti (3 giorni, fino a 10 giorni), in condizioni aerobiche e, per i batteri lattici, in condizioni anaerobiche o microaerofile (8 giorni, fino a 10 giorni), eseguendo osservazioni periodiche fino all’ultimo giorno di incubazione. 6.2.7 Risultati Tutte le provette che presentano uno sviluppo microbico sotto forma di deposito biancastro, più o meno evidente e/o con un più o meno marcato disturbo, si considerano positive. I risultati devono essere confermati tramite osservazione al microscopio. Indicare il periodo di incubazione. La lettura delle provette si effettua annotando il numero di provette positive o negative in ogni combinazione di tre provette (per ogni diluizione). Per esempio, “3-1-0” significa: 3 provette positive nella diluizione 100 (vino), 1 nella diluizione 10-1 e zero nella diluizione 10-2. Per un numero di diluizioni superiore a 3, solo 3 di questi risultati sono significativi. Per scegliere i risultati che permettono di determinare il “MPN”, occorre determinare il “numero tipico” sulla base degli esempi riportati nella seguente tabella: Tabella

Numero di provette positive per ciascuna diluizione Numero tipico Esempio 10 10 10 10 10 3-1-0

a 3 3 3 1 0 3-2-0

a 3 3 2 0 0 3-2-1

a 3 2 1 0 0 3-0-1

a 3 0 1 0 0 3-2-3

b 3 2 2 1 0 3-2-3

b 3 2 1 1 0 3-2-2

c 2 2 2 2 0 2-2-2

d 0 1 0 0 0 0-1-0

Esempio a: prendere la diluizione maggiore per la quale tutte le provette sono positive e le due successive.

Esempio b: se un risultato positivo spicca per una diluizione maggiore rispetto all’ultima scelta, è necessario aggiungerlo a questa.

Esempio c: se nessuna diluizione fornisce tre provette positive, prendere le diluizioni corrispondenti alle ultime tre provette positive.

Esempio d: caso in cui il numero di provette positive è molto ridotto, scegliere il numero tipico affinché la diluizione positiva occupi la riga delle decine

Adattato da Bourgeois, C.M. e Malcoste, R. in : Bourgeois, C.M. et Leveau, J.Y. (1991). Calcolo del Numero più probabile (MPN) Tenendo conto del numero tipico ottenuto, il MPN si determina tramite la Tabella A (Allegato 3) basata sui calcoli di probabilità di McCrady, considerando la diluizione effettuata. Se la serie delle diluizioni è 100 ; 10-1 ; 10-2, la lettura è diretta. Se la serie delle diluizioni è 101; 100; 10-1, la lettura è pari a 0,1 volte questo valore. Se la serie delle diluizioni è 10-1; 10-2; 10-3, la lettura è pari a 10 volte questo valore. Nota: Se occorre aumentare la sensibilità, si può usare una concentrazione 101 del vino. Per ottenere questa concentrazione di micro-organismi in 1 mL, centrifugare 10 mL di vino, prelevare 1 mL di deposito (dopo avere prelevato 9 mL di liquido in eccesso) e inoculare secondo il metodo precedentemente descritto.




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6.2.8 Espressione dei risultati Il contenuto di micro-organismi del vino deve essere espresso in cellule per mL, in notazione scientifica con una cifra decimale. Se il contenuto è inferiore a 1,0 cellule per mL, il risultato deve essere presentato come “<1,0 cellule/mL”. (Vedere gli allegati nelle pagine seguenti) 7. BIBLIOGRAFIA - ISO 4833:2003. Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Terreno di coltura orizzontale per il conteggio dei micro-organismi – Tecnica di conteggio delle colonie a 30°C. - ISO 7218:2007 – Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Regole generali degli esami microbiologici. - ISO 7667:1983. Microbiologia – Schema standard per i metodi di esame microbiologico. - Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills and L. F. Bisson. 2001. Use of WL medium to profile native flora fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203; - A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica di mosti e vini. Vignevini, 9-1992 17-20.- ANDREWS, W. et MESSER, J. (1990). Microbiological Methods. in: AOAC Official Methods of Analysis, 15th edition, 1, 425-497, Association of Analytical Chemist, Washington. - BIDAN, P. (1992). Analisi microbiologiche del vino. F.V. O.I.V. nº 910, Parigi. - BOURGEOIS, C.M. et LEVEAU, J.Y. (1991). Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agro alimentaires, 2ème édition, 3. Le Contrôle Microbiologique Lavoisier, Tec. & Doc., APRIA Ed. Paris. - CARR, J. G. (1959). Acetic acid bacteria in ciders. Ann. Rep. Long Ashton Res. Sta., 160. - DE MAN, J. C. (1975). The probability of most probable number. European Journal of Applied Microbiology, 1, 67-78. - LAFON-LAFOURCADE, S. et al. (1980). Quelques observations sur la formation d'acide acétique par les bactéries lactiques. Conn. Vigne Vin, 14, 3, 183-194. - MAUGENET, J. (1962). Les Acétobacter du cidre. Identification de quelques souches. An. Technol. Agric., 11, 1, 45-53. - PLARIDIS et LAFON-LAFOURCADE, S. (1983). Controllo microbiologico dei vini. Boll. O.I.V., 618, 433-437, Parigi. - RIBÉREAU-GAYON, J. et PEYNAUD, E. (2004). Traité d'Oenologie, Tome 2, Librairie Polytechnique CH. Béranger, Paris et Liège. - Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1976). 14th edition, American Public Health Association, Incorporated, New York. - Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1985). 16th edition, American Public Health Association, DC 20005, Washington. - VAZ OLIVEIRA, M., BARROS, P. e LOUREIRO, V. (1995). Analisi microbiologica del vino. Tecnica delle provette multiple per il conteggio dei micro-organismi nei vini – «Numero più probabile" (MPN), F.V. O.I.V. n° 987, Parigi. - VAZ OLIVEIRA, M., e LOUREIRO, V. (1993). Il conteggio dei micro-organismi nei vini con indice di colmatura elevato, Resoconto dei lavori del gruppo di esperti "Microbiologia del Vino" dell'O.I.V., 12ª sessione, allegato 2, Parigi. - VAZ OLIVEIRA, M., e LOUREIRO, V. (1993). Il conteggio dei micro-organismi nei vini con indice di colmatura elevato, 2ª parte, Doc. di lavoro del gruppo di esperti "Microbiologia del Vino" dell'O.I.V., 13ª sessione, Parigi.




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Campione

Preparazione di diluizioni e inoculi Allegato 1

Diluizione

Diluizione ottenuta

Inoculo delle piastre

Quantità di campione

Campione

Allegato 2 Preparazione di diluizioni e inoculi




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Allegato 3 - (ENO 8/95) Tabella A

«Numero più probabile» (MPN) per 1 mL di campione utilizzando 3 provette

con 1 mL, 0,1 mL e 0,01 mL

Provette positive Provette positive Provette positive 1 mL

0,1 mL

0,01 mL

MPN 1 mL

1 mL

0,1 mL

0,01 mL

MPN 1 mL

1 mL

0.1 mL

0,01 mL

MPN 1 mL

0 0 0 0,0 2 0 2 2,0 1 1 1 7,5 0 0 1 0,3 2 1 0 1,5 3 1 2 11,5 0 1 0 0,3 2 1 1 2,0 3 1 3 16,0 0 1 1 0,6 2 1 2 3,0 3 2 0 9,5 0 2 0 0,6 2 2 0 2,0 3 2 1 15,0 1 0 0 0,4 2 2 1 3,0 3 2 2 20,0 1 0 1 0,7 2 2 2 3,5 3 2 3 30,0 1 0 2 1,1 2 2 3 4,0 3 3 0 25,0 1 1 0 0,7 2 3 0 3,0 3 3 1 45,0 1 1 1 1,1 2 3 1 3,5 3 3 2 110,0 1 2 0 1,1 2 3 2 4,0 3 3 3 >140,0 1 2 1 1,5 3 0 0 2,5 1 3 0 1,6 3 0 1 4,0 2 0 0 0,9 3 0 2 6,5 2 0 1 1,4 3 1 0 4,5

Adattamento da “Metodi standard di esame dell’acqua e delle acque reflue” (1976).

Allegato 4 Diluenti: I diluenti sono indicati a titolo di esempio. Si deve usare acqua distillata, bidistillata o deionizzata, senza tracce di metalli, inibitori o altre sostanze antimicrobiche. 1. Soluzione fisiologica Preparazione: Pesare 8,5 g di cloruro di sodio in una beuta tarata da 1000 mL. Dopo il suo scioglimento nell’acqua, regolare il volume di riferimento. Mescolare accuratamente. Filtrare. Distribuire 9 mL nelle provette per il test. Chiudere con cotone cardato e mettere in autoclave per 20 minuti a 121°C. 2. Soluzione di Ringer 1/4 Preparazione: Pesare 2,250 g di cloruro di sodio, 0,105 g di cloruro di potassio, 0,120 g di cloruro di calcio (CaCl2.6H2O) e 0,050 g di idrogenocarbonato di sodio in una beuta tarata da 1000 mL. Dopo lo scioglimento in acqua, portare a livello. Mescolare accuratamente. Distribuire 9 mL nelle provette per il test. Chiudere con cotone cardato e mettere in autoclave per 15 minuti a 121°C. (Questa soluzione è disponibile in commercio) 3. Acqua peptonata Preparazione: Pesare 1g di peptone in una beuta tarata da 1000 mL. Dopo il suo scioglimento nell’acqua, regolare il volume di riferimento. Mescolare accuratamente. Distribuire 9 mL nelle provette del test. Chiudere con cotone cardato e mettere in autoclave per 20 minuti a 121°C.




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Allegato 5 Terreni di coltura I terreni di coltura e gli antimicrobici sono indicati a titolo di esempio. Si deve usare acqua distillata, bidistillata o deionizzata, senza tracce di metalli, inibitori o altre sostanze antimicrobiche. 1. Terreni di coltura solidi Salvo diverse indicazioni, il pH di tutti i terreni di coltura deve essere regolato a pH 5,5 – 6,0 1 TERRENI DI COLTURA PER IL CONTEGGIO DEI LIEVITI 1.1 YM Glucosio 50 g Peptone 5 g Estratto di lievito 3 g Estratto di malto 3 g Agar-agar 20 g Acqua: fino a 1000 mL Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare l’accrescimento batterico e 150 mg di difenile per eliminare l’accrescimento delle muffe. 1.2 YEPD Glucosio 20 g Peptone 20 g Estratto di lievito 10 g Agar-agar 20 g Acqua: fino a 1000 mL Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare l’accrescimento batterico e 150 mg di difenile per eliminare l’accrescimento delle muffe. 1.3 Agar nutriente WL Glucosio 50 g Peptone 5 g Estratto di lievito 4 g Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) 0,55 g Cloruro di potassio (KCl) 0,425 g Cloruro di calcio (CaCl2) 0,125 g Solfato di magnesio (MgSO4) 0,125 g Cloruro ferrico (FeCl3) 0,0025 g Solfito di manganese (MnSO4) 0,0025 g Verde di bromocresolo 0,022 g Agar batteriologico 12 g Acqua: fino a 1000 mL pH 5.5 L’agar differenziale WL si ottiene aggiungendo 4 mg/l di cycloheximide all’Agar nutriente WL. Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare la crescita batterica. 1.4 Agar lisina ASBC Soluzione A: Base di carbonio del lievito 2,35 g Acqua: fino a 100 mL Sterilizzare con filtrazione a membrana Soluzione B: Lisina HCl 0,5 g Agar-agar 4 g Acqua: fino a 100 mL




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Sterilizzare per 20 minuti a 121°C. Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare la crescita batterica. 2 TERRENI DI COLTURA PER CONTEGGIO BATTERI LATTICI 2.1 M.R.S. + succo di pomodoro (o di mela). Glucosio 20 g Peptone 10 g Estratto di carne bovina 8 g Estratto di lievito 4 g Fosfato di potassio dibasico (KH2PO4) 2 g Acetato di sodio · 3H2O 5 g Citrato di ammonio 2 g Solfato di magnesio 6H2O 0,2 g Solfato di manganese 4H2O 0,05 g "Tween 80" 1 mL Agar-agar 12 g Succo di pomodoro (o di mela, o d’uva) 200 mL Acqua per fare 1000 mL Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso. 2.2 Agar al succo di pomodoro Succo di pomodoro (estratto secco da 400 mL) 20 g Peptone 10 g Latte peptonizzato 10 g Agar-agar 14 g Acqua: fino a 1000 mL pH 6.1 Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso. 2.3 Terreno di coltura ATB modificato, o terreno di coltura Oenococcus oeni (in precedenza terreno di coltura Leuconostoc oenos) Soluzione A: Glucosio 10 g Estratto di lievito 5 g Peptone 10 g Solfato di magnesio 0,2 g Solfato di manganese 0,050 g Succo di pomodoro (o di mela, o d’uva) 250 mL Agar-agar 12 g Acqua 750 mL Sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 121°C. Soluzione B: Cisteina HCl 1 g Acqua: fino a 100 mL pH 4.8 Sterilizzare con filtrazione a membrana Aggiungere 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso. Aggiungere 1 mL di soluzione B a 20 mL di soluzione A al momento dell’uso 2.4 Terreno di coltura di Lafon-Lafourcade Glucosio 20 g Estratto di lievito 5 g Estratto di carne bovina 10 g




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Peptone 10 g Acetato di sodio 5 g Citrato triammonico 2 g Solfato di magnesio 6H2O 0,2 g Solfato di manganese 4H2O 0,05 g "Tween 80" 1 mL Agar-agar 20 g Acqua: fino a 1000 mL pH 5.4 Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso. 2.5 Terreno di coltura di Dubois (Terreno di coltura 104) Succo di pomodoro 250 mL Estratto di lievito 5 g Peptone 5 g Acido malico 3 g Solfato di magnesio 6H2O 0,05 g Solfato di manganese 4H2O 0,05 g Agar-agar 20 g Acqua: fino a 1000 mL pH 4.8 Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso. 2.6 MTb. Glucosio 15 g Polvere Lab-Lemco (Oxoid) 8 g Caseina idrolizzata 1 g Estratto di lievito 5 g Succo di pomodoro 20 mL Acetato di sodio 3 g Citrato di ammonio 2 g Acido malico 6 g Solfato di magnesio 0,2 g Solfato di manganese 0,035 g "Tween 80" 1 mg TC Vitamins Minimal Eagle, 100x (BD-Difco) 10 mL* pH (con KOH) 5.0 Acqua per fare 1000 mL * aggiungere dopo la sterilizzazione. Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso. 3 TERRENI DI COLTURA PER CONTA BATTERI ACETICI 3.1 GYC Glucosio 50 g Estratto di lievito 10 g Carbonato di calcio (CaCO3) 3 g Agar 25 g Acqua: fino a 1000 mL Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire lo sviluppo dei lieviti, nonché 12,5 mg/L di pennicillina per eliminare la crescita dei batteri lattici immediatamente prima dell’uso.




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3.2 Terreno di coltura G2 Estratto di lievito 1,2 g Fosfato di ammonio 2 g Succo di mela 500 mL Agar 20 g Acqua: fino a 1000 mL pH 5.0 Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, nonché 12,5 mg/L di pennicillina per eliminare la crescita dei batteri lattici immediatamente prima dell’uso. 3.3 Terreno di coltura di Kneifel Estratto di lievito 30 g Etanolo 20 mL* Agar 20 g Verde di bromocresolo 2,2% 1 mL Acqua: fino a 1000 mL * da aggiungere dopo la sterilizzazione. Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, nonché 12,5 mg/L di pennicillina per eliminare la crescita dei batteri lattici immediatamente prima dell’uso. Colonie blu: Acetobacter, Gluconacetobacter Colonie verdi: Gluconobacter 4 TERRENI DI COLTURA PER IL CONTEGGIO DELLE MUFFE 4.1 Czapek-Dox, Modificato Saccarosio 30 g NaNO3 3 g K2HPO4 1 g MgSO4 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4 0,01g Agar 15 g pH finale (a 25°C) 7,3 ± 0,2 Aggiungere 10 mg/l di cycloheximide per eliminare l’accrescimento dei lieviti (l’accrescimento dei lieviti resistenti al cycloheximide è di norma più lento dell’accrescimento delle muffe). Nota: Questo terreno di coltura permette solo l’accrescimento delle muffe che si sviluppano con nitrati. Aggiungere tetraciclina (100 mg/l) e streptomicina (100 mg/l) per eliminare l’accrescimento dei batteri. 4.2 Agar Dichloran Rosa Bengala Cloramfenicolo (DRBC Agar) Glucosio 10 g Peptone 5 g KH2PO4 1 g MgSO4 0,5 g Rosa Bengala 0,025 g Dicloran (2,6 dicloro-4-nitroanilina) 0,002g Soluzione di cloramfenicolo (0,1 g/10 mL)* 10 mL Agar 15 g pH finale (a 25°C) 5,6 ± 0,2 * Da aggiungere dopo la sterilizzazione.




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4.3 Agar all’estratto di malto (MEA) Glucosio 20 g Estratto di malto 20 g Peptone 5 g Agar 15 g pH finale (a 25°C) 5,5 ± 0,2 Aggiungere tetraciclina (100 mg/l) e streptomicina (100 mg/l) per eliminare l’accrescimento dei batteri.

2. Terreni di coltura liquidi

2.1. Per lieviti Terreno di coltura YEPD (estratto di malto, peptone, destrosio) + cloramfenicolo Preparazione: Pesare 10,0 g di estratto di lievito (Difco o equivalente), 20 g di peptone, 20 g di glucosio e 100 mg di cloramfenicolo. Sciogliere, portare al volume di 1000 mL con acqua e mescolare. Distribuire porzioni di 5 mL di questo terreno di coltura nelle provette dei test e passare in autoclave per 15 minuti a 121°C.

2.2. Per i batteri lattici Terreno di coltura MTJ (50% terreno di coltura MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth" + 50% terreno di coltura TJB "Tomato Juice Broth") + actidione Preparazione: Pesare 27,5 g di MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth" (Difco o equivalente). Aggiungere 500 mL di acqua, scaldare fino all’ebollizione per consentire il completo scioglimento e aggiungere 20,5 g di TJB "Tomato Juice Broth" (Difco o equivalente). Aggiungere 50 g di actidione. Sciogliere in acqua per ottenere 1000 mL di soluzione, correggendo prima il pH a 5 con 1N di acido cloridrico e mescolare. Distribuire porzioni di 10 mL di questo terreno di coltura3) nelle provette e passare in autoclave per 15 minuti a 121°C.

3) Si usa un volume di 10 mL, invece del volume di 5 mL come per i lieviti, a causa della maggiore sensibilità all’ossigeno dei batteri dell’acido lattico.




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ALLEGATO 6: RICONOSCIMENTO DI MICRO-ORGANISMI SPECIFICI 6.1 Riconoscimento delle colonie di lieviti su Agar nutriente WL. L’uso di questo terreno di coltura non costituisce un metodo di identificazione delle specie, ma può fornire ai laboratori non specializzati un metodo rapido ed economico per predire il genus dei lieviti vitali e adatti alla coltura. Dopo un’incubazione di 4 giorni, valutare la morfologia delle colonie come segue (Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills and L. F. Bisson. 2001. Use of WL medium to profile native flora fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203; A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica di mosti e vini. Vignevini, 9-1992 17-20): - Saccharomyces spp.: Le colonie crescono bene in 4 giorni sull’Agar nutriente WL, presentando colonie circolari di colore dal crema al verde pallido. Diverse sfumature di colore non indicano necessariamente la presenza di ceppi diversi, ma la presenza di alcuni mutanti; le colonie si presentano umbonate, con superficie regolare e uniforme, la consistenza è burrosa. Non cresce sull’Agar lisina. - Torulaspora spp.: le colonie sono simili a quelle del Saccharomyces spp. Cresce sull’Agar lisina. - Hanseniaspora spp. (Kloeckera spp.) Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie verde scuro opaco, regolari e burrose. Cresce sull’Agar lisina e sull’Agar differenziale WL. - Candida stellata Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie verde pisello, regolari e burrose che, con il tempo, si scuriscono al centro. Cresce sull’Agar lisina. - Saccharomycodes spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie verde chiaro convesse, regolari e burrose. Cresce dull’Agar lisina e non sull’Agar differenziale WL. Nota: le sue cellule, viste al microscopio, sono molto grandi (fino a 25 m). - Schizosaccharomyces pombe Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie verde scuro, di dimensioni puntiformi, regolari e burrose. Cresce sull’Agar lisina. Nota: le sue cellule sono facilmente riconoscibili al microscopio a causa della tipica divisione di scissione. - Rhodotorula spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie burrose con superficie rosa scuro, regolare e mucosa. Cresce sull’Agar lisina. - Metschnikowia spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando piccole colonie chiare, regolari e burrose. Nel terreno di coltura sotto le colonie si diffonde un pigmento rossastro. Cresce sull’Agar lisina. - Pichia membranifaciens Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie convesse scabre e polverose di tonalità grigiastre o bluastre. Cresce sull’Agar lisina. - Pichia anomala (in precedenza Hansenula anomala) cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie di colore crema o bluastro, nettamente bluastro dopo 8 giorni. Le colonie sono circolari, la superficie è regolare e la consistenza è burrosa, ma qualche volta nettamente mucosa. Cresce sull’Agar lisina. - Dekkera spp. o Brettanomyces spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 8 giorni, presentando piccole colonie a forma di cupola, di colore crema, regolari e burrose. Produce grandi quantità di acido acetico, nettamente percepibile all’olfatto, che rende giallo il terreno di coltura. Cresce sull’Agar lisina e sull’Agar differenziale WL. La crescita su quest’ultimo terreno di coltura permette di distinguerlo dallo Zygosaccharomyces bailii. Nota: una conferma è possibile con l’esame microscopico: il Dekkera presenta cellule piccole, alcune delle quali dalla tipica sagoma ogivale. - Zygosaccharomyces bailii Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando piccole colonie circolari, di colore crema, regolari e burrose. Cresce sull’Agar lisina, ma non sull’Agar differenziale WL. Intorno alle colonie giovani è spesso presente un alone giallastro. Nota: quando cresce sul vino imbottigliato, produce grappoli marrone di 0,5-1 mm. Le sue cellule non hanno forma ogivale. - Batteri acetici crescono sull’Agar nutriente WL in colonie piccole o puntiformi verde scuro e brillanti, fortemente positive al test di catalasi. (Nota: Questo terreno di coltura non è adatto al loro conteggio).




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- Batteri lattici crescono sull’Agar nutriente WL in 10 giorni in colonie puntiformi chiare negative alla catalasi. (Nota: Questo terreno di coltura non è adatto al loro conteggio). 6.2 Riconoscimento delle colonie di batteri lattici. Le colonie di LAB hanno dimensioni da puntiformi a qualche mm e sono traslucide. Sono Gram-positive e catalasi-negative. Oenococcus oeni crescono in brevi catene, i pediococchi formano tetradi e i diplococchi e i lactobacilli formano bacilli lunghi o corti. 6.3 Riconoscimento delle colonie di batteri acetici. Le colonie di AAB sono catalasi-positive e Gram-negative e sono forti produttrici di acido: questo può essere rilevato dalla zona chiara del terreno di coltura intorno alle loro colonie, contenente carbonato di calcio, o da un diverso colore se il terreno di coltura contiene un indicatore di pH. Le loro cellule sono cocchi o bacilli, di solito un leggermente più grandi dei LAB.

Analisi microbiologica di vini e mosti · di peptidoglicano e la deidratazione provocata...

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