Analisi a due fotoni dellaccumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto Candidato:...

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Analisi a due fotoni dell’accumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto Candidato: Alessandro Esposito INFM Istituto Nazionale per la Fisica della Materia IBF - CNR Istituto di Biofisica Consiglio Nazionale delle Ricerche Università degli Studi di Genova Relatori: Prof.Mauro Robello Dott.sa Carla Marchetti Correlatore: Prof.Maurizio Canepa Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica

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Analisi a due fotonidell’accumulo di ioni divalentiin colture cerebellari di ratto

Candidato: Alessandro Esposito

INFMIstituto Nazionale per laFisica della Materia

IBF - CNRIstituto di Biofisica Consiglio Nazionale delle Ricerche

Università degli Studi di Genova

Relatori: Prof.Mauro RobelloDott.sa Carla Marchetti Correlatore: Prof.Maurizio Canepa

Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica

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Importanza degli ioni divalenti Ca2+ e Pb2+

Ca2+

Pb2+

Ca2+ Il calcio, secondo messaggero

Pb2+ Il piombo, interferisce con alcune funzioni del calcio

Meccanismi di permeazione

Azione del piombo

Pb2+

Pb2+

Ca2+

Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM

2H.A.Godwin, “The Biological Chemisrty of Lead”, Current Opinion in Chemical Biology 5, 223-227 (2001)

M.Mazzolini,S.Traverso,C.Marchetti, “Multiple pathways of Pb(2+) […]”, J.Neurochem.2001 Oct;79(2):407-16

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Modello biologico

neuroni cerebellari di ratto

Caratterizzazione:

- Microscopia in fluorescenza con eccitazione a due fotoni (TPM)- sonda fluorescente permeabile alla membrana: Indo-1

Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM

Ca2+

Ca2+

Ca2+

3A.Periasamy, “Methods in Cellular Imaging”, Oxford University Press (2001)

A.Takahashi […] and B.Herman, “Mesurement of Intracellular Calcium”, Physiol.Review Vol.79 No4 (1999)

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Eccitazione a singolo fotone

Microscopia a due fotoni

Microscopia in fluorescenza a scansione laser

TPLSM

CLSM

J.J. Sakurai, “Modern Quantum Mechanics”, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1985) Max Born and Emil Wolf, “Principles of Optics”, Pergamon Press (1970)

Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM

Microscopia a due fotoni

Iw SPE1

0

20

40

60

80

100

120

290 340 390

Lunghezza d'onda (nm)

Sezi

one d

'urt

o a

sin

golo

foto

ne (

a.u

.) ~350nm

(Teoria perturbativa al second’ordine)

22 Iw TPE

i

f

E0

E1

P1 m

P2

P2

422

0

22

1

4,,0

z

w

tPtzIn

Rzz

e

Selezione del piano focale durante l’eccitazioneUtilizzo di radiazione rossa e nel vicino infrarosso anziché Vis-UV

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Caratteristiche rilevanti della TPM

Luce IR-NIR per eccitare sonde Vis-UV

Minore fototossicità e fotodanneggiamento

Confocalità

Lunghezza d’onda: 700nm (680-1050nm)Potenza media sul campione: 5-7mW (0-70mW)Laser pulsato: 80MHz ; 100-200fs

RisoluzioneAssiale: 700nm Laterale: 250nm Temporale: 3s/pxl

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Sezioni ottiche

2m

Analisi delle distribuzioni di fluorescenzanello spazio (3D) e nel tempo

superfici

volumi

5A.Diaspro, “Confocal and Two-Photon Microscopy”, Wiley-Liss (New York, 2002)

F.M. Wahl, “Digital Image Signal Processing”, Artech House (1987)

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TPM: apparato sperimentale

A.Diaspro […] and M.Robello (1999b), “Adapting a compact confocal […]”, Microsc. Res. Tech. 47, 196-205 A.Diaspro […] M.Robello and F.Olivini (2001), “Two-photon microscopy […]”, J.Biomed.Opt.

TsunamiMillennia

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Filtro neutro

MicroscopioTE300Eclipse

(Nikon)

Testa diScansione (PCM2000)

PMT1

PMT2

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Perfusione e soluzioni

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Misure di calcio intracellulare:Depolarizzazione (KCl75mM)Acido N-metil-D-aspartico 100M (NMDA)

Misure di accumulo di piombo:Piombo (20M)Lantanio (25M)

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Proprietà spettrali dell’Indo-1: misure raziometriche

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Ca2+

HQ405/30 HQ485/30

30/485

30/405

HQ

HQ

F

FR

Fotodanneggiamento e perdita di sonda

Disomogeneità della marcatura

RRRR

QKCaMAX

MINCa

][

nMKCa 230

Concentrazioni assolute di calcio8

G.Grynkiewicz, M.Poenie and R.Y.Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, The Journal of Biological Chemistry Vol.260 No.6 25th March 1985 3440-3450

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Immagini raziometriche

1m

controllo

Indo-1 libero (485nm)

0 Intensità (a.u.) 183

Indo-1 legato (405nm)

0 Intensità (a.u.) 250

NMDA (100M)

0 Rapporto (a.u.) 2.0

Rapporto 405nm/485nm

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Misure raziometriche

Sonda legata (405nm)Sonda libera (485nm)Rapporto

NMDA(100M)KCl (75mM)

Intensità di fluorescenza (a.u.) Rapporto 405nm/485nm

Tempo (s)

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Proprietà spettrali dell’Indo-1: quenching

HQ460/50

Pb2+

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pMKPb 35

FF

fPb legato

0][

FFF

F

Pblibero KPb

1][

Non è più una sonda raziometrica

Stimare la concentrazione di sonda

Stimare il fotodanneggiamento della sonda

11M.E.Legare, R.Barhoumi, E.Hebert, G.R.Bratton, R.C.Burghardt and E.Tiffany-Castiglioni, “Analysis of Pb2+

Entry into Cultured Astroglia”, Toxicological Sciences 46, 90-100 (1998)

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Marcatura tramite micropipetta

La sonda diffonde piuttosto velocemente nel citoplasma. Indo-1 100M fornisce misure di intensità di fluorescenza prossime a quelle osservate con la la marcatura tramite diffusione da membrana

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Micropipetta con Indo-1 100M

Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM

Brust-Mascher and Webb, “Calcium Induced by Large Voltage Pulses in Fish Keratocytes”,Biophy.J. Vol75 1998

Ricostruzione 3D e sezionamento virtuale di un neurone marcato tramite micropipetta.

5m

0 255Intensità (a.u.)

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-75%

-60%

-45%

-30%

-15%

0%

0 2 4 6 8

Tempo (min)va

riazi

oni d

i flu

ores

cenz

a (%

)

Variazioni di fluorescenza

Fotodanneggiamento della sonda

Pb20µM Pb20µM

Permeazione del piombo

Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching ConclusioniTPM

-5

5

15

25

35

45

55

65

75

0 2 4tempo (min)

Con

cent

razi

one

(M

)

Statistica sulle concentrazioni stimate

Pb20µM Pb20µM6115M

5411M

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Inibizione del lantanio

Pb2+

La3+

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-5

5

15

25

35

45

55

0 2 4tempo (min)

Con

cent

razi

one

(pM

)Pb20µM Pb20µM

+La25µM

Analisi dell’accumulo di piombo

4411pMPiombo legato:6115Me probabile saturazione del trasporto

Piombo libero: 4411pM

Parziale inibizione del lantanio

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15R.H.S.Westerink and Henk P.M.Vijverberg, “Ca2+-indipendent vesicular catecholamine release in PC12

cells by nanomolar concentrations of Pb2+”, Journal of Neurochemistry, 2002 Vol.80 861-873

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Conclusioni

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Caratterizzazione dell’autofluorescenza, fotodanneggiamento e spettri dell’Indo-1

Elaborazione di codici (Matlab – VisualBasic) per l’elaborazione ed analisi (3D-t) delle immagini, l’assistenza all’acquisizione

Studio delle tecniche raziometrica e del quenchingAnalisi delle variazioni di concentrazioni di calcioProbabile saturazione del trasporto del piomboInibizione del lantanio

16Per approfondimenti: http://www.fantagp.net/alessandro/research/