all’organismo, per esempio le battere mie sono assai ... · MODALITA’ DI PRELIEVO Si sceglie...
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Lezione 11/10/13 Prof. Marilena Galdiero
La prof la riferimento alle ultime diapositive della precedente
lezione:
Isolamento batterico, queste sono info che abbiamo già visto
nelle lezioni precedenti;
E’ necessario tener conto del sito di provenienza del
campione;
Generalmente i campioni provengono da siti sterili o da un
campione es PUS estraiamo un solo microrganismo
(NB:materiale fecale, tampone orofaringeo e altri tipi di
materiali biologici generalmente contengono microrganismi
contaminanti oltre ai patogeni responsabili dell’infezione).
Andiamo ora a vedere le tecniche che si applicano a vari
apparati, in particolare parleremo di:
1. EMOCOLTURA
2. ESAME DELL’ESPETTORATO
3. ESAME DEL LIQUIDO CEFALORACHIDIANO
Diffusione dei microrganismi tramite il sangue: virus o piccole
quantità di batteri possono entrare nel sangue senza causare danno
all’organismo, per esempio le battere mie sono assai comuni ma
falliscono negli individui sani- Si verificano ad esempio dopo il
lavaggio dei denti, perché i batteri sono solitamente espulsi o
distrutti dai macrofagi. In certe condizioni però, cosa può
accadere? Che questi microrganismi hanno la possibilità di
localizzarsi a livello delle valvole cardiache. Vi ricordate che
abbiamo già fatto questo esempio? Infatti i portatori di protesi
valvolari anche se si sottopongono ad un’estrazione di un dente
devono effettuare profilassi antibiotica. Questo perché uno
Streptococco alpha-emolitico può andarsi a localizzare a livello
del danno e causare ENDOCARDITE INFETTIVA
BATTERICA. Pertanto queste categorie di pazienti sono
considerate a rischio e debbono effettuare profilassi.
Se l’intervento dei macrofagi del sistema reticolo endoteliale non
è completato in un breve periodo, e se è presente una grande
quantità di microrganismi nel sangue, è possibile la
colonizzazione secondaria di organi bersaglio, pertanto si parla di
SETTICEMIA.
La presenza di batteri in circolo induce febbre e l’esame indicato
per identificare l agente eziologico è l’ EMOCOLTURA:
Si definisce Batteremiala presenza di batteri in circolo che può
essere di 3 tipi:
TRANSITORIO: quando i microrganismi facenti parte della
flora locale di un certo distretto corporeo, entrano
accidentalmente in circolo. In genere regredisce rapidamente;
INTERMITTENTE:quando i microrganismi presenti in un
processo infettivo entrano in circolo in modo non costante es:
da un ascesso, empiema, peritonite, artrite settica e cellulite..
Domanda: Anche dalla cellulite entrano i batteri? P: Si ma
non intesa come cellulite da adipe, quella batterica!
CONTINUA: quando i microrganismi hanno un accesso
diretto al circolo es endocardite batterica, fistole artero-
venose infette;
La FASE PREANALITICA è di fondamentale importanza: il
volume di sangue è la variabile più importante per il
ritrovamento dei microrganismi, la conservazione, l’intervallo
e il numero di prelievi.
L a fase pre-analitica è tutto ciò che precede l’analisi del nostro
campione biologico che arriva al laboratorio, e che è
responsabile della positività o meno del campione e
dell’eventualità di falsi positivi o negativi. Individuare per
esempio due microrganismi nel corso dell’emocoltura significa
che qualcosa non è andato bene nell’isolamenti e che il
campione è stato contaminato o durante il prelievo o durante il
trasporto. Quindi bisogna ripetere l’esame.
Il prelievo di sangue è effettuato 3 volte nel corso della giornata
circa 30 minuti prima del rialzo febbrile, cioè quando la carica
microbica in circolo è più alta. Questo però si può fare solo se la
febbre è regolare. Per gli altri tipi di febbre come ci si
comporta? Dato che l’acme febbrile è imprevedibile, il prelievo
è effettuato dopo il rialzo termico.
Il volume di sangue è il fattore più importante per un corretto
isolamento:
10ml per l’adulto
1-5ml per i bambini
Considerando che per ogni ml di sangue sono presenti circa o,5-
1um di microrganismi.
Questa è la quantità di sangue che va poi insemensata sul
contenitore per l’emocoltura che presenta un terreno per i
microrganismi aerobi e uno per gli anaerobi.
Terreni per l’emocoltura:
Il campione è raccolto in un flacone sterile, perforato,
contenente terreni nutritivi liquidi addizionati ad anticoagulante.
I terreni utilizzati sono generalmente il brain-
hearthinfusionbroth, il Columbia broth .Per ciascun prelievo
di sangue è necessario disporre di 2 flaconi : 1 per gli aerobi e
l’altro per gli anaerobi. I flaconi vengono incubati a 35 °C per
72 ore. I tempi di incubazione dipendono dalla richiesta del
medici e dal suo sospetto clinico, ci sono tempi di incubazione
maggiori.
Come notiamo se l’emocoltura è positiva? Noteremo che
all’interno del nostro flacone un intorbidimento, indice della
positività e pertanto dovremmo procedere con l’identificazione
del microrganismo insemensandolo su piastre. Se ciò non si
verifica si attendono altre 72 ore e poi si può dire che
l’emocoltura è negativa.
Di solito si utilizzano contemporaneamente almeno 3 terreni per
: GRAM+, GRAM-, MICETI.
Ricapitolando:
FASE1 :incubazione in flacone sterile x 72 ore; se è torbido
l’emocoltura è + ;
FASE2:si prelevaun quantità di questo liquido biologico e si
insemensa su i terreni di coltura
FASE3: dopo 24h si identifica la colonia valutando la
morfologia dopo crescita su terreno solido.
In un terreno liquido possiamo osservare solo la crescita
batterica, rilevabile mediante intorbidimento dell’emocoltura, il
terreno solido invece ci consente di osservarne la morfologia e
in base a questa si può presupporre di che tipo di colonia si
tratti facendo ricorso alla microbiologia di base. Valutando ad
esempio se ci sono colonie mucose,alonegiallatro, possiamo
procedere con l’identificazione e procedere con altre prove, es
se si sospetta un’infezione da GRAM + si effettua coagulasi e
catalasi.
A questo punto si procede con l’ANTIBIOGRAMMA. e’
IMPORTANTE ESEGUIRE CONTESTUALMENTE L’ESAME
PER EVITARE DI DOVER RIPETERE L’ESAME, ciò
risulterebbe difficile perché bisognerebbe individuare nuovamente
l’acme febbrile.
MODALITA’ DI PRELIEVO
Si sceglie l’accesso venoso, si disinfetta con cura con garza sterile
imbevuta di clorexidina e alcol. Togliere il tappo del flacone e
disinfettare anche la superficie esterna del tappo. Si inocula il
campione di sangue nella quantità esatta, senza introdurre aria, si
disinfetta nuovamente il diaframma dopo il prelievo.
Questa che abbiamo visto è la fase preclinica che riguarda il
prelievo, è importante disinfettare la cute, perché se non la
disinfetto potrei trovare in circolo uno S. Epidermidis che sulla
cute non è mai patologico, ma in circolo si.
TEMPI PER IL PRELIEVO
Il numero si prelievi è pari a 3 in 24h. Oltre tale numero non
aumenta la probabilità di isolamento, ne bastano 3 per avere un
risultato attendibile. Ci può essere anche un caso del genere:
1° Prelievo –
2° Prelievo +
3° Prelievo –
Ciò non vuol dire che ci sia un errore, ma semplicemente che nel
secondo prelievo avevamo una carica batterica tale da poter essere
isolata. Se invece tutti e 3 sono + vuol dire che la carica microbica
è elevata. In genere 2 su 3 sono +.
CONSERVAZIONE
Bisogna inviare il campione nel più breve tempo possibile al
laboratorio, in quanto il prelievo è effettuato al letto del malato.
TEMPI DI REFERTAZIONE
Variano a seconda del sospetto clinico. Nella procedura standard il
campione è considerato negativo dopo 5giorni di incubazione.
In media si valuta la positività dopo 48-72ore, tuttavia ci sono casi
ove va valutata dopo + giorni:
BRUCELLE E MICETI 14gg
MICOBATTERI 42gg
Quindi nei moduli di richiesta bisogna far riferimento al tipo di
patogeno che si sospetta esser presente. Se abbiamo tenuto conto
del materiale di raccolta, numero e tempo di prelievi,
conservazione possiamo essere certi del risultato
ESAME DEL LIQUOR
Diffusione di microrganismi attraverso il fluido cerebrospinale,
dato che i microrganismi hanno attraversato la barriera
ematoencefalica e diffondono rapidamente negli spazi del fluido
cerebrospinale.
I flaconi sono gli stessi dell’emocoltura, debbono essere sterili e
devono essere inviati rapidamente al laboratorio anche se al di
fuori dell’orario di lavoro, debbono essere rapidamente analizzati
perché non possono essere ripetuti.
Il campione viene raccolto per la diagnosi di meningite ed è
prelevato mediante puntura lombare tra L3-L4, L4-L5, L5-S1.
Previa disinfettazione della cute, una volta raggiunto lo spazio sub
aracnoideo si aspirano o,5ml di campione che deve essere
immediatamente inviato al laboratorio per effettuare i seguenti
esami:
1. Determinazione glucosio ( glucorrachia)
2. Determinazione proteine ( protidorrachia)
3. Conteggio elementi figurati.
Queste tre indagini fanno parte dell’esame chimico-fisico che
eseguiremo sul liquido. Di solito con il campione si riempiono 3
provette: il primo campione va al laboratorio di biochimica clinica
per eseguire il chimico-fisico, il secondo va al laboratorio di
microbiologia, il terzo magari al laboratorio di ematologia a
seconda poi di quale sia anche il sospetto clinico.
All’interno del liquor osserviamo:
- Aumento dei leucociti neutrofili
- pleiocitosi
- aumento dei granulociti neutrofili (maggiore di 500 per mm
cubico) nelle meningiti purulente, ossia dove abbiamo
un’infezione batterica.
- aumento dei linfociti nelle meningiti virali
- aumento dei monociti nelle meningiti croniche da amebe,
toxoplasma, ascesso cerebrale
-aumento di eosinofili in meningiti causate da parassiti
-aumento dei macrofagi nella meningite tubercolare
Andiamo a vedere cosa si valuta nell’ Esame chimico-fisico che
eseguo sul campione (esame che è d’ausilio per quello
microbiologico):
Nelle meningiti batteriche osserviamo una riduzione della
glicemia, ossia valori inferiori a 40 mg/dl. Ovviamente se il pz
parte da una glicemia di 90-100 e trovo la glicemia inferiore a 40,
allora è un altro tassello che mi aiuta a capire che l’agente
eziologico è batterico; invece se il pz già parte da una glicemia
bassa per esempio di 60, allora trovarla inferiore a 40 non sarà
necessariamente indicativo e non conferma ancora la diagnosi.
Aumento dell’acido lattico (che è il prodotto finale della glicolisi
anaerobia: si formano 2 lattato per ogni molecola di glucosio) si
osserva sempre nelle infezioni batteriche, quindi è un altro esame
chimico-fisico che viene eseguito sul campione di liquor.
Aumento delle proteine plasmatiche (più di 100 mg/dl), il loro
aumento si osserva in caso di un processo infiammatorio, per la
presenza del cosiddetto “danno di barriera”, con il passaggio di
proteine dal plasma al liquor: questo è un altro indice di infezione.
Questi risultati vanno in associazione a quello che osserverò al
microscopio durante l’esame microbiologico. Attualmente le
metodologie all’avanguardia per la ricerca di batteri o virus
all’interno del liquor si basano sulla biologia molecolare, perché
sono rapide.
Esame microbiologico:
a causa della mancanza di specificità dei segni clinici, l’aspetto
chiave della diagnosi di meningite è costituito dall’esame del
liquido cerebro-spinale. In caso di infezione batterica, il liquor,
anche se non purulento, è nettamente torbido e mai limpido. Il
campione viene centrifugato in un tubo sterile e sul sedimento si
procede con un esame batterioscopico diretto, che nel caso del
liquor è di particolare importanza perché ci indirizza verso la
diagnosi: valuta l’aspetto morfologico e la quantità di
microrganismi presenti, che normalmente nel liquor NON devono
esserci. Attraverso questo tipo di esame, ci rendiamo conto se ci
sono gram + o gram – oppure se ci sono granulociti neutrofili. Noi
sappiamo che una delle responsabili della meningite batterica è
proprio la Neisseria meningiditis, che al microscopio appare
proprio in una forma caratteristica, quasi scolastica. Quindi se
troviamo questi leucociti infarciti di tali Neisserie, subito
possiamo iniziare una terapia specifica.
Nel caso del liquor, poiché i tempi sono molto stretti, noi facciamo
anche un esame colturale ma sappiamo che questi sono lenti, ecco
perché è importante l’esame con il microscopio. Il campione viene
seminato su terreno di coltura appropriato ed è necessario allestire
i preparati a breve distanza dal prelievo perché i pneumococchi e
soprattutto i meningococchi, fuori dall’organismo, sono
rapidamente distrutti: in presenza di un liquor torbido, con
abbondanti polimorfonucleati più o meno disfatti e assenza di
flora microbica deve far sempre sospettare una meningite
meningococcica. In queste forme di meningite c’è un disfacimento
totale dei meningococchi, che vengono completamente fagocitati,
per cui potremmo non vederli proprio, ma c’è un aumento
notevole dei leucociti, che normalmente non devono esser presenti
nel liquor e se ci sono c’è un aumento dei polimorfonucleati e
quindi un’infezione batterica.
Dopo aver eseguito la puntura lombare, i risultati della conta
leucocitaria e linfocitaria, della colorazione col metodo di Gram e
dei livelli di glucosio vanno valutati con urgenza da una persona
che coordina tutti questi risultati e i vari tasselli devono coincidere
tra loro. La conta leucocitaria nel sangue periferico NON è utile
per la distinzione tra meningite batterica e meningite asettica, in
particolare nei bambini.
In rari casi, i pazienti con meningite batterica possono evidenziare
livelli normali o quasi della conta leucocitaria, nonché livelli
normali di glucosio e di proteine nel liquido cerebro-spinale, solo
in bambini piccoli con neutropenia o altre condizioni di
immunodepressione, per esempio. L’assenza di altre condizioni di
leucocitosi e riscontro di livelli di glucosio normali nel liquido
cerebro-spinale sono possibili anche in pz con infezione da HIV e
meningite criptococcica. Quindi, tutti gli esami (chimico- fisico, la
citometria e quindi l’emocromo, il microbiologico) vanno
interpretati insieme e bisogna tener conto di alcuni fattori, ad
esempio se il bambino è già di per sé immunodepresso e i valori
riferimento sono diversi, non possiamo esser sicuri che i valori del
numero dei globuli bianchi siano una conseguenza dell’infezione o
dello stato immunitario del paziente. Ciò ci fa capire che quello di
cui dobbiamo primariamente tener conto è l’esame microscopico
diretto e quello colturale, perché solo con la ricerca diretta ho la
sicurezza che ci troviamo di fronte ad un’infezione data da quel
tipo di agente. Per fare una diagnosi differenziale tra meningite
batterica e virale, certamente NON andiamo a fare un esame
indiretto, piuttosto esame microscopico e biologia molecolare.
Dunque, partendo dallo schema del protocollo diagnostico, noi
dobbiamo andare a capire in che situazione ci troviamo e quale
fase andiamo applicare. Dal protocollo diagnostico noi abbiamo
come primo step la ricerca diretta del patogeno, che può essere
eseguita mediante esame microscopico, terreno colturale o
microbiologia innovativa o esami in biologia molecolare; poi
abbiamo la ricerca indiretta, che in questo caso NON andiamo ad
eseguire.
Le specie che più frequentemente sostengono la meningite
batterica acuta:
- nei neonati sono StreptococcusAgalactiae, E. Coli, Neisseria,
specie appartenenti al genere Klebsiella.
- nei bambini abbiamo: Emophilusinfluenzae di tipo B, la
Neisseria Meningiditis e StreptococcusPneumoniae.
-negli adulti: Neisseria Meningiditis e StreptococcusPneumoniae.
Nella meningite cronica possono essere coinvolti:
Mycobacteriumtubercolosis e Streptococcusneoformans.
Anche sapere quali sono le specie coinvolte ci indirizza che cosa
dobbiamo andare a ricercare.
Il trattamento empirico iniziale della meningite batterica va
impostato in base all’età del pz, ai fattori di rischio presenti e al
quadro clinico. Gli esami emoculturali condotti sui campioni di
sangue ottenuti prima di iniziare la terapia antimicrobica risultano
positivi nel 61-66% dei pz. La somministrazione di antimicrobici
prima di eseguire la puntura lombare diminuisce il valore
diagnostico dell’esame colturale del liquido cerebro-spinale e
riduce la probabilità di osservare bassi livelli di glucosio e livelli
elevati di proteine. Il trattamento antimicrobico, però, non
influenza in maniera marcata i risultati della colorazione di Gram
del liquido cerebro-spinale, che rimangono positivi nel 60-70%
dei pz. Questo concetto è fondamentale, in quanto abbiamo detto
che qualsiasi esame va effettuato prima di iniziare una terapia
antibiotica, ma nel caso del liquor ciò non è possibile perché si
inizia una terapia antibiotica a largo spettro o, in verità, in base a
quello che è il sospetto del medico. In ogni caso, quello che fa
fede è l’esame microscopico. Se vi dovesse esser chiesto all’
esame “l’esame del liquor” ricordate che questo parte dall’esame
microscopico, che rappresenta la parte più importante e poi se ne
viene tutto il resto.
Meningite asettica.
I liquidi cerebro-spinali, che mostrano una pleiocitosi in assenza di
microrganismi, vengono descritti come meningite asettica, ma
molti casi in realtà sono dovuti a virus, parassiti, funghi e anche
ad alcuni batteri. L’eziologia più frequente della meningite
asettica:
-nei bambini: Enterovirus, Herpes Simplex, Borreliaburgdorferi
-nell’adulto: Enterovirus, Herpes Simplex, Virus della varicella
zooster.
Quando parliamo di meningite è una patologia che preoccupa
soprattutto per i focolai che ne possono derivare. È chiaro che in
una meningite batterica, il pz subito viene sottoposto ad una
terapia per tenerla sotto controllo; le meningiti virali sono ancora
più allarmanti.
L’esame dell’espettorato.
È qui mostrata l’immagine di un contenitore a bocca larga con
tappo a vite, nel quale il paziente viene invitato ad espettorare.
L’esame batteriologico va eseguito entro 30 minuti. Anche qui
molto importante è la fase pre-analitica perché esistono tanti
campioni non idonei perché il paziente non sa molte volte neppure
come raccoglierlo questo campione che deve essere inviato al
laboratorio. Quali devono essere le modalità di raccolta?
Al mattino
A digiuno
Effettuare una pulizia accurata del cavo orale mediante
gargarismi con acqua distillata, sterile
Raccogliere l’espettorato con un colpo di tosse. Il materiale
deve provenire infatti dalle basse vie aeree e non essere
materiale salivare (se il campione non è idoneo, deve essere
scartato, bisogna invitare il paziente a ripetere l’esame)
Se il paziente ha difficoltà ad espettorare, si può ricorrere
all’induzione AEROSOLICA,fare quindi ispirare il paziente,
lentamente e profondamente, un aerosol di soluzione salina tiepida
per una decina di volte, espettorando successivamente nel nostro
contenitore. Quindi vedere questa fase pre-analitica, ancora una
volta, per raccogliere l’espettorato che sembra un esame banale, è
molto importante. Fin ora abbiamo visto dei campioni mono-
microbici, dei campioni che devono essere normalmente
considerati sterili, come il prelievo di sangue nel quale noi
isoliamo un solo microrganismo sia dal sangue che dal liquor. Ora
invece parliamo di campioni poli-microbici perché nel momento
in cui viene raccolto il campione, esso passa attraverso le prime
vie respiratorie e quindi può contaminarsi da quella che è la flora
batterica oro-faringea. Sicuramente una procedura accurata è
quella di effettuare una pulizia del cavo orale con dei gargarismi
con acqua sterile, certamente non con una sostanza disinfettante
perché me la porterei appresso nel momento in cui vado a
raccogliere il mio campione, avremmo un falso negativo. Devo
stare molto attenta quindi a questa frase pre-analitica, perché il
campione è un campione poli-microbico, mentre prima dovevamo
stare attenti sia perché avevamo avanti un campione che era stato
difficile prelevare, sia perché nell’emocultura dovevamo
acchiappare il picco febbrili per ottenere un isolamento giusto e
sia nel liquor perché non possiamo rischiare di dover ripetere il
campione. Qui invece è molto facile ripetere il campione, però
siamo avanti ad un campione poli-microbico, quindi dobbiamo
fare sicuramente la diagnosi del microrganismo responsabile della
patologia che stiamo osservando e non dei microrganismi
eventualmente presenti. La raccolta dell’espettorato viene fatta
quindi al mattino, perché si sono accumulate molte secrezioni
durante il clinostatismo della notte, quindi è più facile fare questo
colpo di tosse profondo. Un solo campione, in generale, è
sufficiente a fare una sola diagnosi di polmonite batterica. Se è
richiesta invece la diagnosi d’infezione tubercolare sono
consigliabili dai 3 ai 5 campioni raccolti ad intervalli di un giorno,
in quanto l’eliminazione di micobatteri con le secrezioni
bronchiali non è costante. Anche in questo caso interviene quello
che è il sospetto clinico del medico che suggerisce al paziente di
eseguire un esame dell’espettorato per la ricerca del
MicobacteriumTubercolosis. Una volta effettuata la diagnosi di
tubercolosi polmonare la racconta dell’espettorato deve essere
eseguita una volta alla settimana al fine poi di valutare l’efficacia
della terapia.
Che cosa facciamo del campione dopo averlo racconto?
Anche in questo caso è fondamentale L’ESAME
MICROSCOPICO DIRETTO. Preleviamo questo nostro
campione ed andiamo ad osservarlo, prima lo fissiamo al nostro
vetrino, lo coloriamo con una semplice colorazione GRAM e lo
andiamo ad osservare al microscopio. Questa osservazione già vi
indirizzerà verso la nostra diagnosi, che poi deve essere solo
confermata, ma un occhio esperto può già qui fare diagnosi.
Che cosa andiamo a vedere?
Andiamo a vedere sicuramente una flora microbica, se sono
GRAM POSITIVI O GRAM NEGATIVI in presenza per esempio
di granulociti, di neutrofili. Anche qui è come se dovessimo
riempire dei tasselli che vanno letti poi tutti assieme.
Accanto all’esame MICROSCOPICO DIRETTO andiamo sempre
a fare anche nell’espettorato un esame culturale che ha
ovviamente dei tempi più lunghi. Anche in questo caso l’esame
microscopico diretto ci fa fare subito la diagnosi o una pseudo-
diagnosi nel senso che poi dobbiamo solo confermarla, ma
abbiamo già il nostro sospetto clinico. Quindi nel caso, ad
esempio, di infezione tubercolare, sapete già bene i tempi della
coltura del MicobacteriumTuberculosis, i tempi sono lunghi,
quindi noi andiamo a vedere con la colorazione di ziehl-neelsen se
è presente o no. Nel caso sia presente già a livello microscopico,
poi dobbiamo solo confermarlo, ma nel frattempo refertiamo già
l’esame microscopico, perchè non può essere un FALSO
POSITIVO, perché non esistono falsi positivi per il micobatterio
della tubercolosi. Quindi abbiamo detto che è un campione poli-
microbico, quindi più difficile da interpretare, può essere
contaminato dalla flora microbica del cavo orale e delle vie aeree
superiori e quindi ciò può portare all’isolamento di un
microrganismo commensale al posto dell’agente eziologico
responsabile della polmonite che noi osserviamo nel paziente con
conseguente insuccesso sulla terapia antibiotica. È chiaro che per
evitare tutto ciò è fondamentale conoscere l’ecosistema microbico,
ritorniamo sull’importanza dell’ecosistema batterico nei vari siti
corporei, quindi conoscendo l’ecosistema delle prime vie
respiratorie e del cavo oro-faringeo, io so già cosa mi posso
aspettare nel mio campione.
Prima di processare il campione d’espettorato è opportuno però
stimare il grado di contaminazione che si può valutare solamente
con l’esame MICROSCOPICO. È necessario determinare quindi il
relativo numero di cellule epiteliali squamose che sono indicative
di contaminazione salivare, in questo caso andremo a ripetere
l’esame. Quindi se la presenza di queste cellule epiteliali
squamose è elevata vuol dire che siamo avanti ad una campione
contaminato di saliva, probabilmente il campione non proviene
dalle basse vie respiratorie. Andremo a determinare la presenza di
neutrofili che sono indicative di un processo infiammatorio, di
cellule epiteliali colonnali ciliate che originano dalle vie
respiratorie profonde e il numero di cellule infiammatorie
mononucleate che ricordano i macrofagi alveolari. Quindi noi
andiamo a valutare questi parametri per validare il nostro
campione. Se il campione è buono, proviene dalle basse vie
respiratorie, nell’esame microscopico osserveremo per esempio la
presenza di pneumococco e potremmo già fare diagnosi di
polmonite pneumococcica. Se invece in questo campione, che è
già dubbio, perché il numero delle cellule epiteliali squamose è
elevato, noi isoliamo uno streptococco alfa emolitico, vuol dire
che ci troviamo avanti ad un campione contaminato. Quello che
abbiamo isolato è un microrganismo delle prime vie respiratorie e
non fa diagnosi.
Perche è più importante l’esame microscopico rispetto all’esame
colturale?
Perché l’esame microscopico rappresenta in quel momento un
esatta fotografia di quelli che sono i rapporti tra le diverse specie
microbiche eventualmente presenti nel mio campione, soprattutto
per i campioni poli-microbici. L’esame colturale può essere
falsato dal sopravvento di una specie microbica sull’altra, anche di
specie microbiche normalmente presenti in quel determinato
distretto che possono in questo modo camuffare l’agente patogeno
che non ha la forza di prendere il sopravvento nel mio terreno di
coltura. Quindi ho un falso positivo, io vado ad isolare una specie
batterica che però non è la causa dell’infezione.
È ovvio che finito l’esame microscopico, al quale abbiamo dato
tantissima importanza, noi processeremo il campione su di un
terreno di coltura, che saranno diversi a seconda del sospetto
clinico, a seconda se il sospetto sia di polmonite pneumococcica,
infezione da micobatteri o infezione fungina. Di solito quando un
campione di (parola incomprensibile) viene processato per prassi
si fa su 3 tipi di terreni:
1) Uno contenente miceti
2) Uno per batteri gram negativi
3) Uno per i batteri gram positivi
Nel caso di infezione tubercolare ci sono terreni particolati, il
medico deve fare richiesta di un esame particolare, di routine non
viene processato su terreni di coltura specifici per la crescita dei
micobatteri, ciò non toglie che se l’esame dell’espettorato è
racconto in maniera corretta e nel primo campione il microbo
evidenzia già quella che può essere il sospetto di una determinata
infezione tubercolare, sul vetrino si fa oltre la colorazione di gram,
quella di ziehl-neelsen , si ha comunque la diagnosi.
Vediamo come ultima metodica. Stiamo vedendo delle metodiche
che abbracciano diverse patologie, perché non riuscendo a trovare
tutti i diversi apparati, dovrete voi applicare queste metodiche alle
varie infezioni negli apparati. Esempio: la conoscenza dell’esame
dell’espettorato, significa poterlo utilizzare come esame di
partenza per tutte le infezioni respiratorie (sospetto polmonite,
infezione da micobatteri, in questo caso andremo anche a valutare
la ricerca indiretta)
RACCOLTA Dei CAMPIONI DI FECI è quella più semplice, uno
di quegli esami in cui potete richiedere al paziente di ripeterlo se
qualcosa non vi convince.
L’ISOLAMENTO degli agenti patogeni presenti in questo
distretto è alquanto complicata perché rappresenta uno dei distretti
più ricchi di microrganismi commensali. Al livello dell’intestino
abbiamo un elevato ecosistema microbico, il mancato equilibrio
tra le diverse specie microbiche normalmente presenti può
determinare l’istaurarsi di un certo quadro patologico, di una
sintomatologica clinica nel paziente. È difficile isolare da questi
campioni l’agente patogeno, quello che è realmente responsabile
dell’infezione. Le coco(????)colture, di bacillo di Kock sempre a
parte, e data l’assoluta eccezionalità di quello per il vibrione
colerico, si eseguono per ricercare salmonella e shigella. Il
campione deve essere trasportato in laboratorio entro un ora dalla
raccolta, servono almeno 2 grammi di feci prelevate con un
tampone e trasportati su un terreno di trasporto. Anche qui il
tempo è importante, altrimenti immaginate la moltiplicazione
batterica in questo nostro campione, anche in questo caso potrebbe
dare un FALSO POSITIVO, una specie batterica non presente in
vivo a quelle concentrazioni, può prendere il sopravvento rispetto
alle altre specie batteriche e quindi alla fine mi porta ad isolare
quella specie batterica. In questo caso è un errore perché,
processato in breve tempo il campione presenta l’equilibrio, quello
che è in vivo, quello che si verifica in quel momento nel paziente e
quindi non rischio che una specie prenda il sopravvento su di
un’altra. Anche i tempi di crescita sono importanti nelle
coco(???)colture perché ci sono dei batteri che prendono il
sopravvento perché hanno ritmi replicativi più rapidi di altri,
quindi alla fine andrò ad identificare sempre gli stessi, ma non
sono quelli i patogeni che volevo identificare, ma sono
microrganismi che fanno parte della flora normalmente presente a
livello intestinale.
Per l’isolamento di microrganismi patogeni facente parte della
famiglia delle enterobacteriace, il campione viene inoculato in un
terreno liquido, IL BRODO DI SELENITO. Perché serve??
Questo brodo di A(non si capisce) di SELENITO DI SODIO
inibisce molti batteri della flora commensale dell’intestino, tra cui
E.COLI, e altri batteri coliformi, gram negativi e lieviti. Noi
sappiamo che dobbiamo isolare salmonella e shigella, per poterle
isolare dobbiamo inibire la crescita di altri microrganismi,
altrimenti non li riusciremo a vedere perché i ritmo moltiplicativo
è diverso. Questa inibizione consiste nell’induzione di una
prolungata fase di latenza di tali organismi, mentre le specie
salmonella e shigella, essendo molto meno inibite, dopo una fase
di latenza di poche ore entrano in una fase di crescita logaritmica.
Si ha cosi un’alterazione del rapporto tra specie patogene e
microrganismi commensali che indubbiamente favorisce
l’isolamento delle prime. Noi vogliamo isolare le specie patogene,
non vogliamo far crescere E.coli che normalmente è presente a
livello intestinale. Per poter isolare in questo caso le salmonelle e
shigelle dobbiamo inibire la crescita dei batteri che sono
normalmente presenti a livello intestinale. Andiamo a fare con il
nostro campione di feci, quei famosi 2 grammi, un arricchimento
in brodo di selenito, questo dopo 24 ore avrà inibito leggermente
la crescita di E.coli, cresce lo stesso , le troviamo comunque le
colonie di E.coli, ma non inibiscono la crescita di salmonelle e
shigelle. Questa è la differenza , non è che non crescono proprio,
sono leggermente inibite, quindi se alla fine nella mia piastra avrà
comunque solo E.coli, potrò refertare la presenza di E.coli, però
ho dato la possibilità alle salmonelle presenti nel mio campione
comunque di crescere. Dopo 8-12 ore è necessario fare una sub-
coltura. Dopo l’incubazione in questo liquidi, brodo di selenito,
preleviamo un ansata di questo campione e lo andiamo ad
insemensare su un terreno solido. Perché ? (non si capisce la rix)
La piastra utilizzata è Ss (salmonella-shigella) che inibisce la
crescita di molti batteri gram positivi e gram negativi e favorisce
la crescita di salmonella e shigella. Una volta che dal campione
biologico, nei terreni solidi, sia stata verificata la crescita di
colture isolate si procede all’identificazione. La determinazione
delle specie si basa sul profilo di assimilazione degli zuccheri e
sulla produzione di enzimi o prodotti metabolici da parte del
germe in esame. L’esame microscopico in questo caso è l’unica
cosa che non serve, va fatto se devo fare un chimico-fisico, per
risalire a sangue occulto nelle feci o se devo cercare leucociti
fecali. Ma non vado a fare l’esame microscopico per valutare la
presenza di batteri. In questi casi devo approcciare direttamente
con il brodo di selenito, successivamente attraverso la diagnosi su
terreni selettivi e l’identificazione della colonia che io osservo.