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Lezione 11/10/13 Prof. Marilena Galdiero La prof la riferimento alle ultime diapositive della precedente lezione: Isolamento batterico, queste sono info che abbiamo già visto nelle lezioni precedenti; E’ necessario tener conto del sito di provenienza del campione; Generalmente i campioni provengono da siti sterili o da un campione es PUS estraiamo un solo microrganismo (NB:materiale fecale, tampone orofaringeo e altri tipi di materiali biologici generalmente contengono microrganismi contaminanti oltre ai patogeni responsabili dell’infezione). Andiamo ora a vedere le tecniche che si applicano a vari apparati, in particolare parleremo di: 1. EMOCOLTURA 2. ESAME DELL’ESPETTORATO 3. ESAME DEL LIQUIDO CEFALORACHIDIANO Diffusione dei microrganismi tramite il sangue: virus o piccole quantità di batteri possono entrare nel sangue senza causare danno all’organismo, per esempio le battere mie sono assai comuni ma falliscono negli individui sani- Si verificano ad esempio dopo il lavaggio dei denti, perché i batteri sono solitamente espulsi o distrutti dai macrofagi. In certe condizioni però, cosa può accadere? Che questi microrganismi hanno la possibilità di localizzarsi a livello delle valvole cardiache. Vi ricordate che abbiamo già fatto questo esempio? Infatti i portatori di protesi valvolari anche se si sottopongono ad un’estrazione di un dente devono effettuare profilassi antibiotica. Questo perché uno

Transcript of all’organismo, per esempio le battere mie sono assai ... · MODALITA’ DI PRELIEVO Si sceglie...

Lezione 11/10/13 Prof. Marilena Galdiero

La prof la riferimento alle ultime diapositive della precedente

lezione:

Isolamento batterico, queste sono info che abbiamo già visto

nelle lezioni precedenti;

E’ necessario tener conto del sito di provenienza del

campione;

Generalmente i campioni provengono da siti sterili o da un

campione es PUS estraiamo un solo microrganismo

(NB:materiale fecale, tampone orofaringeo e altri tipi di

materiali biologici generalmente contengono microrganismi

contaminanti oltre ai patogeni responsabili dell’infezione).

Andiamo ora a vedere le tecniche che si applicano a vari

apparati, in particolare parleremo di:

1. EMOCOLTURA

2. ESAME DELL’ESPETTORATO

3. ESAME DEL LIQUIDO CEFALORACHIDIANO

Diffusione dei microrganismi tramite il sangue: virus o piccole

quantità di batteri possono entrare nel sangue senza causare danno

all’organismo, per esempio le battere mie sono assai comuni ma

falliscono negli individui sani- Si verificano ad esempio dopo il

lavaggio dei denti, perché i batteri sono solitamente espulsi o

distrutti dai macrofagi. In certe condizioni però, cosa può

accadere? Che questi microrganismi hanno la possibilità di

localizzarsi a livello delle valvole cardiache. Vi ricordate che

abbiamo già fatto questo esempio? Infatti i portatori di protesi

valvolari anche se si sottopongono ad un’estrazione di un dente

devono effettuare profilassi antibiotica. Questo perché uno

Streptococco alpha-emolitico può andarsi a localizzare a livello

del danno e causare ENDOCARDITE INFETTIVA

BATTERICA. Pertanto queste categorie di pazienti sono

considerate a rischio e debbono effettuare profilassi.

Se l’intervento dei macrofagi del sistema reticolo endoteliale non

è completato in un breve periodo, e se è presente una grande

quantità di microrganismi nel sangue, è possibile la

colonizzazione secondaria di organi bersaglio, pertanto si parla di

SETTICEMIA.

La presenza di batteri in circolo induce febbre e l’esame indicato

per identificare l agente eziologico è l’ EMOCOLTURA:

Si definisce Batteremiala presenza di batteri in circolo che può

essere di 3 tipi:

TRANSITORIO: quando i microrganismi facenti parte della

flora locale di un certo distretto corporeo, entrano

accidentalmente in circolo. In genere regredisce rapidamente;

INTERMITTENTE:quando i microrganismi presenti in un

processo infettivo entrano in circolo in modo non costante es:

da un ascesso, empiema, peritonite, artrite settica e cellulite..

Domanda: Anche dalla cellulite entrano i batteri? P: Si ma

non intesa come cellulite da adipe, quella batterica!

CONTINUA: quando i microrganismi hanno un accesso

diretto al circolo es endocardite batterica, fistole artero-

venose infette;

La FASE PREANALITICA è di fondamentale importanza: il

volume di sangue è la variabile più importante per il

ritrovamento dei microrganismi, la conservazione, l’intervallo

e il numero di prelievi.

L a fase pre-analitica è tutto ciò che precede l’analisi del nostro

campione biologico che arriva al laboratorio, e che è

responsabile della positività o meno del campione e

dell’eventualità di falsi positivi o negativi. Individuare per

esempio due microrganismi nel corso dell’emocoltura significa

che qualcosa non è andato bene nell’isolamenti e che il

campione è stato contaminato o durante il prelievo o durante il

trasporto. Quindi bisogna ripetere l’esame.

Il prelievo di sangue è effettuato 3 volte nel corso della giornata

circa 30 minuti prima del rialzo febbrile, cioè quando la carica

microbica in circolo è più alta. Questo però si può fare solo se la

febbre è regolare. Per gli altri tipi di febbre come ci si

comporta? Dato che l’acme febbrile è imprevedibile, il prelievo

è effettuato dopo il rialzo termico.

Il volume di sangue è il fattore più importante per un corretto

isolamento:

10ml per l’adulto

1-5ml per i bambini

Considerando che per ogni ml di sangue sono presenti circa o,5-

1um di microrganismi.

Questa è la quantità di sangue che va poi insemensata sul

contenitore per l’emocoltura che presenta un terreno per i

microrganismi aerobi e uno per gli anaerobi.

Terreni per l’emocoltura:

Il campione è raccolto in un flacone sterile, perforato,

contenente terreni nutritivi liquidi addizionati ad anticoagulante.

I terreni utilizzati sono generalmente il brain-

hearthinfusionbroth, il Columbia broth .Per ciascun prelievo

di sangue è necessario disporre di 2 flaconi : 1 per gli aerobi e

l’altro per gli anaerobi. I flaconi vengono incubati a 35 °C per

72 ore. I tempi di incubazione dipendono dalla richiesta del

medici e dal suo sospetto clinico, ci sono tempi di incubazione

maggiori.

Come notiamo se l’emocoltura è positiva? Noteremo che

all’interno del nostro flacone un intorbidimento, indice della

positività e pertanto dovremmo procedere con l’identificazione

del microrganismo insemensandolo su piastre. Se ciò non si

verifica si attendono altre 72 ore e poi si può dire che

l’emocoltura è negativa.

Di solito si utilizzano contemporaneamente almeno 3 terreni per

: GRAM+, GRAM-, MICETI.

Ricapitolando:

FASE1 :incubazione in flacone sterile x 72 ore; se è torbido

l’emocoltura è + ;

FASE2:si prelevaun quantità di questo liquido biologico e si

insemensa su i terreni di coltura

FASE3: dopo 24h si identifica la colonia valutando la

morfologia dopo crescita su terreno solido.

In un terreno liquido possiamo osservare solo la crescita

batterica, rilevabile mediante intorbidimento dell’emocoltura, il

terreno solido invece ci consente di osservarne la morfologia e

in base a questa si può presupporre di che tipo di colonia si

tratti facendo ricorso alla microbiologia di base. Valutando ad

esempio se ci sono colonie mucose,alonegiallatro, possiamo

procedere con l’identificazione e procedere con altre prove, es

se si sospetta un’infezione da GRAM + si effettua coagulasi e

catalasi.

A questo punto si procede con l’ANTIBIOGRAMMA. e’

IMPORTANTE ESEGUIRE CONTESTUALMENTE L’ESAME

PER EVITARE DI DOVER RIPETERE L’ESAME, ciò

risulterebbe difficile perché bisognerebbe individuare nuovamente

l’acme febbrile.

MODALITA’ DI PRELIEVO

Si sceglie l’accesso venoso, si disinfetta con cura con garza sterile

imbevuta di clorexidina e alcol. Togliere il tappo del flacone e

disinfettare anche la superficie esterna del tappo. Si inocula il

campione di sangue nella quantità esatta, senza introdurre aria, si

disinfetta nuovamente il diaframma dopo il prelievo.

Questa che abbiamo visto è la fase preclinica che riguarda il

prelievo, è importante disinfettare la cute, perché se non la

disinfetto potrei trovare in circolo uno S. Epidermidis che sulla

cute non è mai patologico, ma in circolo si.

TEMPI PER IL PRELIEVO

Il numero si prelievi è pari a 3 in 24h. Oltre tale numero non

aumenta la probabilità di isolamento, ne bastano 3 per avere un

risultato attendibile. Ci può essere anche un caso del genere:

1° Prelievo –

2° Prelievo +

3° Prelievo –

Ciò non vuol dire che ci sia un errore, ma semplicemente che nel

secondo prelievo avevamo una carica batterica tale da poter essere

isolata. Se invece tutti e 3 sono + vuol dire che la carica microbica

è elevata. In genere 2 su 3 sono +.

CONSERVAZIONE

Bisogna inviare il campione nel più breve tempo possibile al

laboratorio, in quanto il prelievo è effettuato al letto del malato.

TEMPI DI REFERTAZIONE

Variano a seconda del sospetto clinico. Nella procedura standard il

campione è considerato negativo dopo 5giorni di incubazione.

In media si valuta la positività dopo 48-72ore, tuttavia ci sono casi

ove va valutata dopo + giorni:

BRUCELLE E MICETI 14gg

MICOBATTERI 42gg

Quindi nei moduli di richiesta bisogna far riferimento al tipo di

patogeno che si sospetta esser presente. Se abbiamo tenuto conto

del materiale di raccolta, numero e tempo di prelievi,

conservazione possiamo essere certi del risultato

ESAME DEL LIQUOR

Diffusione di microrganismi attraverso il fluido cerebrospinale,

dato che i microrganismi hanno attraversato la barriera

ematoencefalica e diffondono rapidamente negli spazi del fluido

cerebrospinale.

I flaconi sono gli stessi dell’emocoltura, debbono essere sterili e

devono essere inviati rapidamente al laboratorio anche se al di

fuori dell’orario di lavoro, debbono essere rapidamente analizzati

perché non possono essere ripetuti.

Il campione viene raccolto per la diagnosi di meningite ed è

prelevato mediante puntura lombare tra L3-L4, L4-L5, L5-S1.

Previa disinfettazione della cute, una volta raggiunto lo spazio sub

aracnoideo si aspirano o,5ml di campione che deve essere

immediatamente inviato al laboratorio per effettuare i seguenti

esami:

1. Determinazione glucosio ( glucorrachia)

2. Determinazione proteine ( protidorrachia)

3. Conteggio elementi figurati.

Queste tre indagini fanno parte dell’esame chimico-fisico che

eseguiremo sul liquido. Di solito con il campione si riempiono 3

provette: il primo campione va al laboratorio di biochimica clinica

per eseguire il chimico-fisico, il secondo va al laboratorio di

microbiologia, il terzo magari al laboratorio di ematologia a

seconda poi di quale sia anche il sospetto clinico.

All’interno del liquor osserviamo:

- Aumento dei leucociti neutrofili

- pleiocitosi

- aumento dei granulociti neutrofili (maggiore di 500 per mm

cubico) nelle meningiti purulente, ossia dove abbiamo

un’infezione batterica.

- aumento dei linfociti nelle meningiti virali

- aumento dei monociti nelle meningiti croniche da amebe,

toxoplasma, ascesso cerebrale

-aumento di eosinofili in meningiti causate da parassiti

-aumento dei macrofagi nella meningite tubercolare

Andiamo a vedere cosa si valuta nell’ Esame chimico-fisico che

eseguo sul campione (esame che è d’ausilio per quello

microbiologico):

Nelle meningiti batteriche osserviamo una riduzione della

glicemia, ossia valori inferiori a 40 mg/dl. Ovviamente se il pz

parte da una glicemia di 90-100 e trovo la glicemia inferiore a 40,

allora è un altro tassello che mi aiuta a capire che l’agente

eziologico è batterico; invece se il pz già parte da una glicemia

bassa per esempio di 60, allora trovarla inferiore a 40 non sarà

necessariamente indicativo e non conferma ancora la diagnosi.

Aumento dell’acido lattico (che è il prodotto finale della glicolisi

anaerobia: si formano 2 lattato per ogni molecola di glucosio) si

osserva sempre nelle infezioni batteriche, quindi è un altro esame

chimico-fisico che viene eseguito sul campione di liquor.

Aumento delle proteine plasmatiche (più di 100 mg/dl), il loro

aumento si osserva in caso di un processo infiammatorio, per la

presenza del cosiddetto “danno di barriera”, con il passaggio di

proteine dal plasma al liquor: questo è un altro indice di infezione.

Questi risultati vanno in associazione a quello che osserverò al

microscopio durante l’esame microbiologico. Attualmente le

metodologie all’avanguardia per la ricerca di batteri o virus

all’interno del liquor si basano sulla biologia molecolare, perché

sono rapide.

Esame microbiologico:

a causa della mancanza di specificità dei segni clinici, l’aspetto

chiave della diagnosi di meningite è costituito dall’esame del

liquido cerebro-spinale. In caso di infezione batterica, il liquor,

anche se non purulento, è nettamente torbido e mai limpido. Il

campione viene centrifugato in un tubo sterile e sul sedimento si

procede con un esame batterioscopico diretto, che nel caso del

liquor è di particolare importanza perché ci indirizza verso la

diagnosi: valuta l’aspetto morfologico e la quantità di

microrganismi presenti, che normalmente nel liquor NON devono

esserci. Attraverso questo tipo di esame, ci rendiamo conto se ci

sono gram + o gram – oppure se ci sono granulociti neutrofili. Noi

sappiamo che una delle responsabili della meningite batterica è

proprio la Neisseria meningiditis, che al microscopio appare

proprio in una forma caratteristica, quasi scolastica. Quindi se

troviamo questi leucociti infarciti di tali Neisserie, subito

possiamo iniziare una terapia specifica.

Nel caso del liquor, poiché i tempi sono molto stretti, noi facciamo

anche un esame colturale ma sappiamo che questi sono lenti, ecco

perché è importante l’esame con il microscopio. Il campione viene

seminato su terreno di coltura appropriato ed è necessario allestire

i preparati a breve distanza dal prelievo perché i pneumococchi e

soprattutto i meningococchi, fuori dall’organismo, sono

rapidamente distrutti: in presenza di un liquor torbido, con

abbondanti polimorfonucleati più o meno disfatti e assenza di

flora microbica deve far sempre sospettare una meningite

meningococcica. In queste forme di meningite c’è un disfacimento

totale dei meningococchi, che vengono completamente fagocitati,

per cui potremmo non vederli proprio, ma c’è un aumento

notevole dei leucociti, che normalmente non devono esser presenti

nel liquor e se ci sono c’è un aumento dei polimorfonucleati e

quindi un’infezione batterica.

Dopo aver eseguito la puntura lombare, i risultati della conta

leucocitaria e linfocitaria, della colorazione col metodo di Gram e

dei livelli di glucosio vanno valutati con urgenza da una persona

che coordina tutti questi risultati e i vari tasselli devono coincidere

tra loro. La conta leucocitaria nel sangue periferico NON è utile

per la distinzione tra meningite batterica e meningite asettica, in

particolare nei bambini.

In rari casi, i pazienti con meningite batterica possono evidenziare

livelli normali o quasi della conta leucocitaria, nonché livelli

normali di glucosio e di proteine nel liquido cerebro-spinale, solo

in bambini piccoli con neutropenia o altre condizioni di

immunodepressione, per esempio. L’assenza di altre condizioni di

leucocitosi e riscontro di livelli di glucosio normali nel liquido

cerebro-spinale sono possibili anche in pz con infezione da HIV e

meningite criptococcica. Quindi, tutti gli esami (chimico- fisico, la

citometria e quindi l’emocromo, il microbiologico) vanno

interpretati insieme e bisogna tener conto di alcuni fattori, ad

esempio se il bambino è già di per sé immunodepresso e i valori

riferimento sono diversi, non possiamo esser sicuri che i valori del

numero dei globuli bianchi siano una conseguenza dell’infezione o

dello stato immunitario del paziente. Ciò ci fa capire che quello di

cui dobbiamo primariamente tener conto è l’esame microscopico

diretto e quello colturale, perché solo con la ricerca diretta ho la

sicurezza che ci troviamo di fronte ad un’infezione data da quel

tipo di agente. Per fare una diagnosi differenziale tra meningite

batterica e virale, certamente NON andiamo a fare un esame

indiretto, piuttosto esame microscopico e biologia molecolare.

Dunque, partendo dallo schema del protocollo diagnostico, noi

dobbiamo andare a capire in che situazione ci troviamo e quale

fase andiamo applicare. Dal protocollo diagnostico noi abbiamo

come primo step la ricerca diretta del patogeno, che può essere

eseguita mediante esame microscopico, terreno colturale o

microbiologia innovativa o esami in biologia molecolare; poi

abbiamo la ricerca indiretta, che in questo caso NON andiamo ad

eseguire.

Le specie che più frequentemente sostengono la meningite

batterica acuta:

- nei neonati sono StreptococcusAgalactiae, E. Coli, Neisseria,

specie appartenenti al genere Klebsiella.

- nei bambini abbiamo: Emophilusinfluenzae di tipo B, la

Neisseria Meningiditis e StreptococcusPneumoniae.

-negli adulti: Neisseria Meningiditis e StreptococcusPneumoniae.

Nella meningite cronica possono essere coinvolti:

Mycobacteriumtubercolosis e Streptococcusneoformans.

Anche sapere quali sono le specie coinvolte ci indirizza che cosa

dobbiamo andare a ricercare.

Il trattamento empirico iniziale della meningite batterica va

impostato in base all’età del pz, ai fattori di rischio presenti e al

quadro clinico. Gli esami emoculturali condotti sui campioni di

sangue ottenuti prima di iniziare la terapia antimicrobica risultano

positivi nel 61-66% dei pz. La somministrazione di antimicrobici

prima di eseguire la puntura lombare diminuisce il valore

diagnostico dell’esame colturale del liquido cerebro-spinale e

riduce la probabilità di osservare bassi livelli di glucosio e livelli

elevati di proteine. Il trattamento antimicrobico, però, non

influenza in maniera marcata i risultati della colorazione di Gram

del liquido cerebro-spinale, che rimangono positivi nel 60-70%

dei pz. Questo concetto è fondamentale, in quanto abbiamo detto

che qualsiasi esame va effettuato prima di iniziare una terapia

antibiotica, ma nel caso del liquor ciò non è possibile perché si

inizia una terapia antibiotica a largo spettro o, in verità, in base a

quello che è il sospetto del medico. In ogni caso, quello che fa

fede è l’esame microscopico. Se vi dovesse esser chiesto all’

esame “l’esame del liquor” ricordate che questo parte dall’esame

microscopico, che rappresenta la parte più importante e poi se ne

viene tutto il resto.

Meningite asettica.

I liquidi cerebro-spinali, che mostrano una pleiocitosi in assenza di

microrganismi, vengono descritti come meningite asettica, ma

molti casi in realtà sono dovuti a virus, parassiti, funghi e anche

ad alcuni batteri. L’eziologia più frequente della meningite

asettica:

-nei bambini: Enterovirus, Herpes Simplex, Borreliaburgdorferi

-nell’adulto: Enterovirus, Herpes Simplex, Virus della varicella

zooster.

Quando parliamo di meningite è una patologia che preoccupa

soprattutto per i focolai che ne possono derivare. È chiaro che in

una meningite batterica, il pz subito viene sottoposto ad una

terapia per tenerla sotto controllo; le meningiti virali sono ancora

più allarmanti.

L’esame dell’espettorato.

È qui mostrata l’immagine di un contenitore a bocca larga con

tappo a vite, nel quale il paziente viene invitato ad espettorare.

L’esame batteriologico va eseguito entro 30 minuti. Anche qui

molto importante è la fase pre-analitica perché esistono tanti

campioni non idonei perché il paziente non sa molte volte neppure

come raccoglierlo questo campione che deve essere inviato al

laboratorio. Quali devono essere le modalità di raccolta?

Al mattino

A digiuno

Effettuare una pulizia accurata del cavo orale mediante

gargarismi con acqua distillata, sterile

Raccogliere l’espettorato con un colpo di tosse. Il materiale

deve provenire infatti dalle basse vie aeree e non essere

materiale salivare (se il campione non è idoneo, deve essere

scartato, bisogna invitare il paziente a ripetere l’esame)

Se il paziente ha difficoltà ad espettorare, si può ricorrere

all’induzione AEROSOLICA,fare quindi ispirare il paziente,

lentamente e profondamente, un aerosol di soluzione salina tiepida

per una decina di volte, espettorando successivamente nel nostro

contenitore. Quindi vedere questa fase pre-analitica, ancora una

volta, per raccogliere l’espettorato che sembra un esame banale, è

molto importante. Fin ora abbiamo visto dei campioni mono-

microbici, dei campioni che devono essere normalmente

considerati sterili, come il prelievo di sangue nel quale noi

isoliamo un solo microrganismo sia dal sangue che dal liquor. Ora

invece parliamo di campioni poli-microbici perché nel momento

in cui viene raccolto il campione, esso passa attraverso le prime

vie respiratorie e quindi può contaminarsi da quella che è la flora

batterica oro-faringea. Sicuramente una procedura accurata è

quella di effettuare una pulizia del cavo orale con dei gargarismi

con acqua sterile, certamente non con una sostanza disinfettante

perché me la porterei appresso nel momento in cui vado a

raccogliere il mio campione, avremmo un falso negativo. Devo

stare molto attenta quindi a questa frase pre-analitica, perché il

campione è un campione poli-microbico, mentre prima dovevamo

stare attenti sia perché avevamo avanti un campione che era stato

difficile prelevare, sia perché nell’emocultura dovevamo

acchiappare il picco febbrili per ottenere un isolamento giusto e

sia nel liquor perché non possiamo rischiare di dover ripetere il

campione. Qui invece è molto facile ripetere il campione, però

siamo avanti ad un campione poli-microbico, quindi dobbiamo

fare sicuramente la diagnosi del microrganismo responsabile della

patologia che stiamo osservando e non dei microrganismi

eventualmente presenti. La raccolta dell’espettorato viene fatta

quindi al mattino, perché si sono accumulate molte secrezioni

durante il clinostatismo della notte, quindi è più facile fare questo

colpo di tosse profondo. Un solo campione, in generale, è

sufficiente a fare una sola diagnosi di polmonite batterica. Se è

richiesta invece la diagnosi d’infezione tubercolare sono

consigliabili dai 3 ai 5 campioni raccolti ad intervalli di un giorno,

in quanto l’eliminazione di micobatteri con le secrezioni

bronchiali non è costante. Anche in questo caso interviene quello

che è il sospetto clinico del medico che suggerisce al paziente di

eseguire un esame dell’espettorato per la ricerca del

MicobacteriumTubercolosis. Una volta effettuata la diagnosi di

tubercolosi polmonare la racconta dell’espettorato deve essere

eseguita una volta alla settimana al fine poi di valutare l’efficacia

della terapia.

Che cosa facciamo del campione dopo averlo racconto?

Anche in questo caso è fondamentale L’ESAME

MICROSCOPICO DIRETTO. Preleviamo questo nostro

campione ed andiamo ad osservarlo, prima lo fissiamo al nostro

vetrino, lo coloriamo con una semplice colorazione GRAM e lo

andiamo ad osservare al microscopio. Questa osservazione già vi

indirizzerà verso la nostra diagnosi, che poi deve essere solo

confermata, ma un occhio esperto può già qui fare diagnosi.

Che cosa andiamo a vedere?

Andiamo a vedere sicuramente una flora microbica, se sono

GRAM POSITIVI O GRAM NEGATIVI in presenza per esempio

di granulociti, di neutrofili. Anche qui è come se dovessimo

riempire dei tasselli che vanno letti poi tutti assieme.

Accanto all’esame MICROSCOPICO DIRETTO andiamo sempre

a fare anche nell’espettorato un esame culturale che ha

ovviamente dei tempi più lunghi. Anche in questo caso l’esame

microscopico diretto ci fa fare subito la diagnosi o una pseudo-

diagnosi nel senso che poi dobbiamo solo confermarla, ma

abbiamo già il nostro sospetto clinico. Quindi nel caso, ad

esempio, di infezione tubercolare, sapete già bene i tempi della

coltura del MicobacteriumTuberculosis, i tempi sono lunghi,

quindi noi andiamo a vedere con la colorazione di ziehl-neelsen se

è presente o no. Nel caso sia presente già a livello microscopico,

poi dobbiamo solo confermarlo, ma nel frattempo refertiamo già

l’esame microscopico, perchè non può essere un FALSO

POSITIVO, perché non esistono falsi positivi per il micobatterio

della tubercolosi. Quindi abbiamo detto che è un campione poli-

microbico, quindi più difficile da interpretare, può essere

contaminato dalla flora microbica del cavo orale e delle vie aeree

superiori e quindi ciò può portare all’isolamento di un

microrganismo commensale al posto dell’agente eziologico

responsabile della polmonite che noi osserviamo nel paziente con

conseguente insuccesso sulla terapia antibiotica. È chiaro che per

evitare tutto ciò è fondamentale conoscere l’ecosistema microbico,

ritorniamo sull’importanza dell’ecosistema batterico nei vari siti

corporei, quindi conoscendo l’ecosistema delle prime vie

respiratorie e del cavo oro-faringeo, io so già cosa mi posso

aspettare nel mio campione.

Prima di processare il campione d’espettorato è opportuno però

stimare il grado di contaminazione che si può valutare solamente

con l’esame MICROSCOPICO. È necessario determinare quindi il

relativo numero di cellule epiteliali squamose che sono indicative

di contaminazione salivare, in questo caso andremo a ripetere

l’esame. Quindi se la presenza di queste cellule epiteliali

squamose è elevata vuol dire che siamo avanti ad una campione

contaminato di saliva, probabilmente il campione non proviene

dalle basse vie respiratorie. Andremo a determinare la presenza di

neutrofili che sono indicative di un processo infiammatorio, di

cellule epiteliali colonnali ciliate che originano dalle vie

respiratorie profonde e il numero di cellule infiammatorie

mononucleate che ricordano i macrofagi alveolari. Quindi noi

andiamo a valutare questi parametri per validare il nostro

campione. Se il campione è buono, proviene dalle basse vie

respiratorie, nell’esame microscopico osserveremo per esempio la

presenza di pneumococco e potremmo già fare diagnosi di

polmonite pneumococcica. Se invece in questo campione, che è

già dubbio, perché il numero delle cellule epiteliali squamose è

elevato, noi isoliamo uno streptococco alfa emolitico, vuol dire

che ci troviamo avanti ad un campione contaminato. Quello che

abbiamo isolato è un microrganismo delle prime vie respiratorie e

non fa diagnosi.

Perche è più importante l’esame microscopico rispetto all’esame

colturale?

Perché l’esame microscopico rappresenta in quel momento un

esatta fotografia di quelli che sono i rapporti tra le diverse specie

microbiche eventualmente presenti nel mio campione, soprattutto

per i campioni poli-microbici. L’esame colturale può essere

falsato dal sopravvento di una specie microbica sull’altra, anche di

specie microbiche normalmente presenti in quel determinato

distretto che possono in questo modo camuffare l’agente patogeno

che non ha la forza di prendere il sopravvento nel mio terreno di

coltura. Quindi ho un falso positivo, io vado ad isolare una specie

batterica che però non è la causa dell’infezione.

È ovvio che finito l’esame microscopico, al quale abbiamo dato

tantissima importanza, noi processeremo il campione su di un

terreno di coltura, che saranno diversi a seconda del sospetto

clinico, a seconda se il sospetto sia di polmonite pneumococcica,

infezione da micobatteri o infezione fungina. Di solito quando un

campione di (parola incomprensibile) viene processato per prassi

si fa su 3 tipi di terreni:

1) Uno contenente miceti

2) Uno per batteri gram negativi

3) Uno per i batteri gram positivi

Nel caso di infezione tubercolare ci sono terreni particolati, il

medico deve fare richiesta di un esame particolare, di routine non

viene processato su terreni di coltura specifici per la crescita dei

micobatteri, ciò non toglie che se l’esame dell’espettorato è

racconto in maniera corretta e nel primo campione il microbo

evidenzia già quella che può essere il sospetto di una determinata

infezione tubercolare, sul vetrino si fa oltre la colorazione di gram,

quella di ziehl-neelsen , si ha comunque la diagnosi.

Vediamo come ultima metodica. Stiamo vedendo delle metodiche

che abbracciano diverse patologie, perché non riuscendo a trovare

tutti i diversi apparati, dovrete voi applicare queste metodiche alle

varie infezioni negli apparati. Esempio: la conoscenza dell’esame

dell’espettorato, significa poterlo utilizzare come esame di

partenza per tutte le infezioni respiratorie (sospetto polmonite,

infezione da micobatteri, in questo caso andremo anche a valutare

la ricerca indiretta)

RACCOLTA Dei CAMPIONI DI FECI è quella più semplice, uno

di quegli esami in cui potete richiedere al paziente di ripeterlo se

qualcosa non vi convince.

L’ISOLAMENTO degli agenti patogeni presenti in questo

distretto è alquanto complicata perché rappresenta uno dei distretti

più ricchi di microrganismi commensali. Al livello dell’intestino

abbiamo un elevato ecosistema microbico, il mancato equilibrio

tra le diverse specie microbiche normalmente presenti può

determinare l’istaurarsi di un certo quadro patologico, di una

sintomatologica clinica nel paziente. È difficile isolare da questi

campioni l’agente patogeno, quello che è realmente responsabile

dell’infezione. Le coco(????)colture, di bacillo di Kock sempre a

parte, e data l’assoluta eccezionalità di quello per il vibrione

colerico, si eseguono per ricercare salmonella e shigella. Il

campione deve essere trasportato in laboratorio entro un ora dalla

raccolta, servono almeno 2 grammi di feci prelevate con un

tampone e trasportati su un terreno di trasporto. Anche qui il

tempo è importante, altrimenti immaginate la moltiplicazione

batterica in questo nostro campione, anche in questo caso potrebbe

dare un FALSO POSITIVO, una specie batterica non presente in

vivo a quelle concentrazioni, può prendere il sopravvento rispetto

alle altre specie batteriche e quindi alla fine mi porta ad isolare

quella specie batterica. In questo caso è un errore perché,

processato in breve tempo il campione presenta l’equilibrio, quello

che è in vivo, quello che si verifica in quel momento nel paziente e

quindi non rischio che una specie prenda il sopravvento su di

un’altra. Anche i tempi di crescita sono importanti nelle

coco(???)colture perché ci sono dei batteri che prendono il

sopravvento perché hanno ritmi replicativi più rapidi di altri,

quindi alla fine andrò ad identificare sempre gli stessi, ma non

sono quelli i patogeni che volevo identificare, ma sono

microrganismi che fanno parte della flora normalmente presente a

livello intestinale.

Per l’isolamento di microrganismi patogeni facente parte della

famiglia delle enterobacteriace, il campione viene inoculato in un

terreno liquido, IL BRODO DI SELENITO. Perché serve??

Questo brodo di A(non si capisce) di SELENITO DI SODIO

inibisce molti batteri della flora commensale dell’intestino, tra cui

E.COLI, e altri batteri coliformi, gram negativi e lieviti. Noi

sappiamo che dobbiamo isolare salmonella e shigella, per poterle

isolare dobbiamo inibire la crescita di altri microrganismi,

altrimenti non li riusciremo a vedere perché i ritmo moltiplicativo

è diverso. Questa inibizione consiste nell’induzione di una

prolungata fase di latenza di tali organismi, mentre le specie

salmonella e shigella, essendo molto meno inibite, dopo una fase

di latenza di poche ore entrano in una fase di crescita logaritmica.

Si ha cosi un’alterazione del rapporto tra specie patogene e

microrganismi commensali che indubbiamente favorisce

l’isolamento delle prime. Noi vogliamo isolare le specie patogene,

non vogliamo far crescere E.coli che normalmente è presente a

livello intestinale. Per poter isolare in questo caso le salmonelle e

shigelle dobbiamo inibire la crescita dei batteri che sono

normalmente presenti a livello intestinale. Andiamo a fare con il

nostro campione di feci, quei famosi 2 grammi, un arricchimento

in brodo di selenito, questo dopo 24 ore avrà inibito leggermente

la crescita di E.coli, cresce lo stesso , le troviamo comunque le

colonie di E.coli, ma non inibiscono la crescita di salmonelle e

shigelle. Questa è la differenza , non è che non crescono proprio,

sono leggermente inibite, quindi se alla fine nella mia piastra avrà

comunque solo E.coli, potrò refertare la presenza di E.coli, però

ho dato la possibilità alle salmonelle presenti nel mio campione

comunque di crescere. Dopo 8-12 ore è necessario fare una sub-

coltura. Dopo l’incubazione in questo liquidi, brodo di selenito,

preleviamo un ansata di questo campione e lo andiamo ad

insemensare su un terreno solido. Perché ? (non si capisce la rix)

La piastra utilizzata è Ss (salmonella-shigella) che inibisce la

crescita di molti batteri gram positivi e gram negativi e favorisce

la crescita di salmonella e shigella. Una volta che dal campione

biologico, nei terreni solidi, sia stata verificata la crescita di

colture isolate si procede all’identificazione. La determinazione

delle specie si basa sul profilo di assimilazione degli zuccheri e

sulla produzione di enzimi o prodotti metabolici da parte del

germe in esame. L’esame microscopico in questo caso è l’unica

cosa che non serve, va fatto se devo fare un chimico-fisico, per

risalire a sangue occulto nelle feci o se devo cercare leucociti

fecali. Ma non vado a fare l’esame microscopico per valutare la

presenza di batteri. In questi casi devo approcciare direttamente

con il brodo di selenito, successivamente attraverso la diagnosi su

terreni selettivi e l’identificazione della colonia che io osservo.