Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web:

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I recettori a sette domini transmembrana

Forme di Signaling Cellulare

(A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine sono secreti nel flusso sanguigno e possono essere distribuiti all’intero organismo. (B) I messaggeri paracrini sono rilasciati dalle cellule nel mezzo extracellulare e possono diffondere e agire localmente. (C) I segnali nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule bersaglio remote. (D) Il signaling contatto-dipendente richiede che le cellule siano a contatto l’una con l’altra membrana contro membrana. Le differenze cruciali tra le varie modalità riguardano la velocità e la selettività con cui I segnali sono trasmessi alle cellule bersaglio.

(A) ENDOCRINO (B) PARACRINO

(C) NEUROCRINO (D) CONTATTO-DIPENDENTE

cellula endocrina

Flusso sanguigno

recettore

cellula bersaglio

ormonecellule

bersaglio

mediatore locale

cellula segnalatrice

neuronesinapsi

cellula bersagliocorpo

cellulare

assone

neurotrasmetttore

cellula segnalatrice

cellula bersaglio

messaggero legato alla membrana

Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice

ormone citochina

fattore dicrescita

recettore accoppiatoa proteina G

recettore tirosin chinasi

recettore per le citochine

via dell’AMPc

via dell’IP3 via del PI 3-kinasi

via delle MAP kinasi

via del JAK-STAT

recettore

tsqiG proteina

cAMPCa2+

messaggerointracellulare

enzimacanale effettore

Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G

Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di membrana

Lipide di membrana Idrofobico + Idrofilico = Anfipatico

Glicerofosfolipide

Sfingomielina

Glicosfingolipide

Colesterolo

Diacilglicerolo

Ceramide

Ceramide

Anelli idrocarburici

Alcool fosforilato

Fosforilcolina

Residui glucidici

Gruppo OH di C3

Glicerofosfolipide

Glicosfingolipide

Colesterolo

Lipidi di Membranasemplice organizzazione di molecole anfipatiche

Lipidi di MembranaSezione di un bilayer di glicerofosfolipidi

idrofilico

idrofobico

Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici

Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana

Proteine Acilate e Prenilate

acido grasso legato mediante legame estere a una Cys; aggiunto in fase post-traslazionale

Esempi: recettore per l’insulinarecettore beta-adrenergicorodopsina

Acido palmitico

Isoprenoide (farnesil;geranilgeranil)

Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una Cys vicina all’estremità C-terminale; aggiunto in fase post-traslazionale

Esempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)

Acido miristico

acido grasso legato mediante legame amidico a una Gly; aggiunto in fase co-traslazionaleEsempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)

I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.

Recettori accoppiati a proteine G (GPCR)

siti di glicosilazione (legame tramite Asn)

siti di fosforilazione

ancoraggio lipidico citosol

extracell.

Recettori Accoppiati a Proteine G

1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad es. rodopsina)

2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel genoma. (di molti di essi non si conosce ancora il ligando)

3. I singoli recettori rispondono a: un neurotrasmettitore come la serotonina o la dopamina,

una piccola proteina (8-40 amminoacidi, un “peptide”) come le endorfine

uno stimolo olfattorio

la luce, nell’occhio

Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono: domini transmembrana ad -elica, ancoraggio ai lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti di fosforilazione citosolici che ne regolano l’attività, e siti di glicosilazione extracellulare che permettono l’interazione con molecole extracellulari e altre cellule.

Struttura Generale dei Recettori a 7 DTsiti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell.

citosol

ancoraggio lipidico

siti di fosforilazione

dominio transmembrana

Rodopsina PDB 1F88

La Rodopsina è stato il primo membro della famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua struttura determinata mediante cristallografia ai raggi-x

Gli effetti di queste interazioni includono alterata affinità per il ligando, dimerizzazione del recettore che può aumentarne o alterarne l’attività, alterata localizzazione del recettore, ecc.

Varie proteine interagiscono con I GPCR o Recettori a 7-DT

per modularne l’attività

RUOLO DELLA -ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE

legame del messaggero

fosforilazione del recettore

interazione con -ARR associazione con

CLATRINAFormaazione della vescicola endocitosi

1.     Dopo un certo tempo che si è stabilito il legame dell’agonista al GPCR, una kinasi (GRK) fosforila alcuni residui aminoacidici intracellulari del recettore;

2.     La fosforilazione porta a un disaccoppiamento del GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al reclutamento della -arrestina;

3.     La -arrestina a sua volta recluta molecole di clatrina;

4.     Le molecole di clatrina favoriscono la formazione di una cavità da cui originerà la vescicola

5.     La successiva endocitosi della vescicola provocherà l’internalizzazione del recettore.

Recettore di classe A

Recettore di classe B

Le Proprietà dell’Internalizzazione definiscono due classi di GPCRs.

Nel caso dei recettori di classe A (-Adre), l’interazione -arrestina–GPCR è transitoria, e la -arrestina non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i recettori di classe B (Vaso2), l’interazione -arrestina–GPCR è più stabile, e recettore e –arrestina co-localizzano negli endosomi.

Traffico Cellulare della arr2-GFP con i Recettori 2AR (adre) e V2R (vasopr)

Assenza di agonista, la arr2-GFP era omogeneamente distribuita nel citoplasma delle cellule che esprimevano 2AR o V2R. (0 min)

Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida redistribuzione dal citosol alla membrana plasmatica. (2 min)

Una esposizione piu prolungata all’ agonista produceva una marcata differenza nel traffico della arr2-GFP (15 min):

2AR : rimaneva nella membrana plasmatica (A)

V2R : nell’arco di 2-3 min, finisce nellevescicole endocitotiche (B)

Cellule HEK-293

Co-transfettate con un plasmide contenente il cDNA per arr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore

Per visualizzare la arr2-GFP fluorescente in cellule prima e dopo il trattamento con agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)

adre

nva

sop

r

Colocalizzazione della arr2-GFP con i Recettori 2AR e V2R internalizzati

Cellule HEK-293

Co-transfettate con arr2-GFP e ciascun recettore

Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo che marca I recettori

trattate per 15 min a 37C con l’agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)

visualizzazione al confocale del recettore (rosso) e della arr2-GFP (verde) nelle stesse cellule. Colocalizzazione (giallo) del recettore con la arr2-GFP

V2R : estesa colocalizzazione 2AR : nessuna colocalizzazione

I recettori 2AR e V2R reclutano arrestin con un meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma poi c’è divergenza. Il complesso arrestin- 2AR si dissocia a livello della membrana. arrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole endocitotiche.

adre

nva

sop

r

esterno

interno

GTP

GDP + Pi

Il neurotrasmettitore o l’ormone si lega al recettore

Attiva unaG proteina

Risposta

Effettore: enzima o canale

Recettori accoppiati a proteine GQuanto veloce?da 100 ms a 10 s

Quanto lontano?probabilmente <1 m