A

Alessandro Pini

Anticorpi e peptidi

I farmaci del XXI secolo

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ISBN ––––

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I edizione: maggio

Indice

Prefazione

Capitolo IIntroduzione

Capitolo IIGli anticorpi. Struttura, funzione e genetica

.. Introduzione agli anticorpi, – .. Struttura degli anticorpi, –.. Le classi degli anticorpi, – .. Legame anticorpo–antigene, –.. Organizzazione dei geni delle immunoglobuline, – .. Regola-zione della ricombinazione mediante sequenze specifiche, – .. Re-golazione trascrizionale dei geni degli anticorpi, – .. Maturazionedi affinità, – .. Commutazione di classe, – .. I frammentianticorpali, – .. Riferimenti bibliografici, .

Capitolo IIIPeptidi. Definizione, struttura, isolamento e stabilità

.. Introduzione ai peptidi, – .. Definizione e struttura dei peptidi, – .. Emivita e stabilità in vivo, – .. Librerie di peptidi, – .. Peptidicome farmaci, – .. Riferimenti bibliografici, .

Capitolo IVAffinità di legame

.. Definizione di affinità e importanza a fini terapeutici, – .. Misu-razione dell’affinità di legame, – .. Riferimenti bibliografici, .

Capitolo VLe tecniche di isolamento di anticorpi e peptidi

.. La tecnologia dell’ibridoma, – .. Il ‘phage display’, – ... Il

Anticorpi e peptidi

batteriofago M, – ... Fagemidi e vettori fagici, – ... Costruzionedi librerie fagiche di frammenti anticorpali, – ... Costruzione di libreriefagiche di peptidi, – ... Strategie di selezione delle librerie fagiche (‘pan-ning’), – ... Strategie alternative di esposizione di proteine su superficibiologiche, – .. Maturazione di affinità degli anticorpi ricombinan-ti, – ... Maturazione dell’affinità intrinseca, – ... Maturazione diavidità, – .. Riferimenti bibliografici, .

Capitolo VIAnticorpi bispecifici e immuconiugati

.. Anticorpi bispecifici, – .. Immunoconiugati, Immunotossine,Immunocitochine, – .. Riferimenti bibliografici, .

Capitolo VIIGli anticorpi in clinica

.. Rituxan™, – .. Remicade®, – .. Avastin™, – .. Hercep-tin®, – .. Humira™, – .. Riferimenti bibliografici, .

Capitolo VIIII peptidi in clinica

.. Hematide™, – .. Kalbitor®, – .. Nplate™, – .. Ri-ferimenti bibliografici,

Prefazione

La ricerca scientifica nel campo bio–medico è volta alla scopertadegli intimi meccanismi che regolano i processi biologici con l’obiet-tivo finale di alleviare le pene dovute alle malattie. I settori oggettodello studio dei ricercatori bio–medici possono essere grossolana-mente sintetizzati come segue: l’identificazione dei meccanismi difunzionamento dei sistemi biologici (cellule e interazioni molecola-ri), l’individuazione di marcatori diagnostici e terapeutici (molecolepresenti nei tumori, nei microrganismi e nei processi infiammatori),e l’identificazione e produzione di molecole a scopo diagnostico, pre-ventivo e terapeutico (i farmaci). In questo libro saranno affrontatii principali aspetti relativi ai farmaci terapeutici, ed in particolareai farmaci biotecnologici di nuova generazione basati su molecolepeptidiche e anticorpali.

La ricerca di nuovi farmaci terapeutici si sta sempre più rivolgendoalla identificazione di molecole capaci di bersaglire in maniera piùspecifica possibile un dato marcatore patologico, con l’obiettivo fi-nale di colpire solo ed esclusivamente quelle cellule che trasportanoquel marcatore, senza portare danni collaterali a tutti quei distrettidell’organismo ancora sani. Gli anticorpi, e da qualche tempo anche ipeptidi, sono universalmente riconosciuti come le migliori molecolecapaci di svolgere questa attività di proiettili selettivi e sempre piùfarmaci basati su queste molecole stanno entrando nella pratica clini-ca. In questo libro saranno affrontati i principali aspetti relativi allaidentificazione, produzione e sviluppo di queste molecole, portan-do esperienze dirette dell’autore e degli scienziati di tutto il mondooperanti in questo campo. Sarà dato inoltre un particolare rilievo allatecnologia oggi più sfruttata per l’identificazione di nuovi peptidi eanticorpi: il “phage display”. Prima dell’avvento della moderna bio-tecnologia la maggior parte dei farmaci veniva sviluppata attraverso

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una combinazione di procedure di sintesi chimica e di screening siste-matici di composti complessi generalmente presenti in natura nellepiante e nei microrganismi. L’avvento delle tecniche biotecnologicheha aperto nuove strade all’identificazione di farmaci utilizzando inmolti casi la chimica e la biologia combinatoriale e il disegno moleco-lare in silico. In particolare, la biologia combinatoriale permette didisporre oggi di grandi librerie di molecole da cui è possibile pescareselettivamente il composto desiderato e di identificarlo mediante ap-propriati strumenti di rivelazione. Il phage display, tecnologia messaa punto negli anni del secolo scorso, è certamente una delle tecno-logie più usate nel campo della biologia combinatoriale, sfruttandola possibilità di esporre molecole di natura proteica sulla superficie divirus batterici, i fagi.

Saranno qui descritti i dettagli che permettono di costruire librerie“fagiche” di peptidi e anticorpi insieme ai principali metodi utilizza-ti per selezionare i ligandi specifici presenti in tali librerie. Sarannoinoltre descritti alcuni anticorpi e peptidi che sono stati identificaticon questa tecnologia e che sono diventati farmaci usati nella praticaclinica o che si trovano attualmente nelle fasi precliniche o clini-che di sperimentazione prima dell’approvazione da parte degli entiinternazionali preposti all’immissione in commercio dei farmaci.

Questo testo è rivolto agli studenti e agli studiosi che operano nelcampo della biotecnologia, segnatamente nel settore della biologiacombinatoriale e nell’identificazione e sviluppo di farmaci biotecno-logici sotto forma di anticorpi ricombinanti e peptidi.

Mi auguro che questo lavoro, ancorché modesto, possa aiutareparte della comunità scientifica a comprendere più approfonditamen-te una tecnologia che si sta rivelando di importanza cruciale perl’industria biofarmaceutica, e che possa essere di stimolo ai giovaniscienziati che hanno intenzione, con il loro entusiasmo e la loro de-dizione, di giocare un qualsiasi ruolo nella difficile partita contro lemalattie.

Capitolo I

Introduzione

Agli inizi del XX secolo lo scienziato tedesco Paul Ehrlich propose ilconcetto di proiettile magico (“magic bullet”) riferendosi a molecoledel sistema immunitario capaci di bersagliare selettivamente i marca-tori patologici. A quel tempo ancora non erano noti gli anticorpi elui fu uno dei primi ad ipotizzare l’esistenza di queste molecole chechiamò in un primo momento recettori. Gli studi di immunologia deiprimissimi anni del XX secolo permisero di identificare in manierapiù dettagliata le molecole che Erlich chiamava recettori e, al giornod’oggi, gli anticorpi, dal punto di vista strettamente molecolare, nonhanno praticamente più segreti da rivelare.

La possibilità di sfruttare dei proiettili magici per colpire seletti-vamente cellule malate o microrganismi è sempre stato il desideriopiù ambito da tutti gli operatori biomedici, ma le possibilità di iden-tificare molecole che si adattassero bene a questo scopo sono statelimitatissime fino a tempi molto recenti. Tra la fine dell’ e l’iniziodel , si cercò di sfruttare la capacità degli animali di produrre anti-corpi in grande quantità. A questo scopo, animali come cavalli e buoivenivano immunizzati con uno specifico agente infettivo (batterio ovirus), dopo un certo periodo di tempo venivano salassati e il sangueveniva lavorato per ottenere un preparato sufficientemente puro, econtenente gli anticorpi specifici, per combattere la malattia la cuietiologia era dovuta allo stesso agente usato per l’immunizzazionedell’animale. Il siero ottenuto veniva cioè iniettato a pazienti chein molti casi trovavano un giovamento dovuto all’azione biologicadegli anticorpi esogeni. Questa procedura, che nel nostro tempo ciappare approssimativa e priva dei minimi requisiti di sicurezza algiorno d’oggi necessari per un farmaco, ha invece permesso per gran

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parte del secolo XX, di salvare centinaia di migliaia di vite umane eha fatto sì che si sviluppassero le prime industrie di farmaci a scopopreventivo: gli istituti sieroterapici. Oggi sappiamo bene che questaprocedura comporta dei rischi enormi perché le immunoglobulinedi origine non umana sono antigenicamente diverse da quelle da noiprodotte e quindi immunogene, e soprattutto perché, nonostanteche i sistemi di purificazione si siano molto evoluti, le malattie dasiero dovute alla somministrazione di sieri animali possono ancoraessere un grave problema per la salute dei riceventi. La sommini-strazione di sieri animali è stata quindi molto limitata man manoche le conoscenze sulla biologia fornivano informazioni relative airischi di tali protocolli. A metà degli anni due scienziati operanti alMedical Research Council di Cambridge in Inghilterra, Cesar Milsteine Georges Kohler, misero a punto una tecnica che permetteva di pro-durre in laboratorio colture continue di cellule esprimenti anticorpi aspecificità predeterminata: la tecnologia degli anticorpi monoclonali,detta anche tecnologia dell’ibridoma. Questa tecnica laboratoristi-ca, di cui si parlerà in dettaglio in seguito, è considerata il primoprotocollo veramente biotecnologico sfruttato per la produzione dimolecole con potenzialità farmaceutica. La tecnologia dell’ibridomaha rivoluzionato la ricerca, con un impatto sulla comunità scienti-fica enorme. Basti pensare che oggi la maggior parte dei reagentidi laboratorio usati in tutto il mondo sono anticorpi ottenuti conquesta tecnica. I due scienziati furono insigniti del premio Nobel mala tecnica dell’ibridoma non fu mai brevettata. Questa cosa al giornod’oggi appare impensabile considerando come la biotecnologia simuove nel mondo dei mercati finanziari. Gli anticorpi monoclonalisembrarono in un primo momento la soluzione ai problemi deglieffetti collaterali della sieroterapia classica e il concetto di “proiettilemagico” riprese vigore. Si pensò cioè che si potessero produrre conrelativa facilità in vitro, ed in grande scala, anticorpi contro specificimarcatori patologici da poter usare per la cura delle più gravi malattieinfettive o tumorali. Il problema dell’immunogenicità però non eraancora risolto in quanto gli anticorpi monoclonali potevano essereprodotti solo dopo immunizzazione di un animale da cui venivanoprelevate le cellule del sistema immunitario facendole crescere, dopo

. Introduzione

appropriata immortalizzazione, in laboratorio. Quindi, gli anticor-pi prodotti erano, e tutt’ora sono, di natura animale. L’entusiasmoiniziale si spense dopo che gli scienziati si resero conto che l’utilizzodi queste molecole rimaneva quindi limitatissimo. Almeno fino aglianni del XX secolo, periodo in cui si cominciarono ad applicare lemoderne tecniche di ingegneria genetica alle molecole del sistemaimmunitario, permettendo di creare degli ibridi anticorpali formati inparte da porzioni proteiche di origine animale ed in parte di origineumana, e quindi con ridotta immunogenicità. Questi anticorpi chi-merici o umanizzati sono degli anticorpi ottenuti con la tecnologiadell’ibridoma, e quindi di origine animale, a cui si sostituisce granparte della struttura molecolare (tranne quella che lega l’antigene)con strutture molecolari di origine umana. Tali anticorpi sono entratinella pratica clinica da alcuni anni e sempre un numero maggioredi anticorpi chimerici o umanizzati stanno entrando nelle fasi disviluppo e produzione per la commercializzazione.

Un ulteriore sviluppo ai proiettili magici si è avuto applicandoagli anticorpi le tecniche di biologia molecolare e combinatoriale,segnatamente la tecnica del ‘phage display’ di cui parleremo esten-sivamente in questo libro. Una spinta enorme a questo processo èstata data dal lavoro del gruppo di ricerca di uno scienziato britan-nico, anche lui operante al Medical Reserch Council di Cambridgein Inghilterra: Sir Greg Winter. Egli ha enormemente contribuito afare luce sui dettagli delle strutture molecolari degli anticorpi e haportato significativi miglioramenti nelle conoscenze dei geni delleimmunoglobuline. In pratica è stato uno dei pionieri di quella tecnicache oggi viene chiamata ‘ingegnerizzazione’ degli anticorpi. La tecno-logia cioè che, tramite l’ingegneria genetica, permette di costruire, apartire da geni umani, frammenti di anticorpi capaci di avere proprie-tà di legame identiche agli anticorpi interi. Questi frammenti possonoessere trasformati in vere e proprie immunoglobuline in modo dacostruire in laboratorio anticorpi completamente umani. Nell’anno è uscito in commercio il primo anticorpo monoclonale comple-tamente umano derivato dal phage display: il farmaco Humira per lacura dei sintomi dell’Artrite reumatoide. La possibilità di costruireenormi librerie combinatoriali di questi frammenti anticorpali, da cui

Anticorpi e peptidi

è possibile ‘pescare’ l’anticorpo con la specificità desiderata, ha quindiportato la comunità scientifica, e di conseguenza l’intera umanità,molto vicino al concetto di proiettile magico.

La comunità scientifica non si è comunque fossilizzata sugli an-ticorpi per la ricerca di farmaci selettivi. Sono infatti al vaglio degliscienziati molte molecole di tipo diverso che, insieme agli anticorpi,possono avere la capacità di bersagliare selettivamente le malattie.Allo stato attuale le molecole di origine proteica a breve sequenzaaminoacidica, i peptidi, sembrano essere i più ragionevoli candidati amimare le proprietà di legame tipiche degli anticorpi. In realtà i pepti-di non posseggono quelle proprietà biologiche tipiche degli anticorpiche noi conosciamo come funzioni effettrici cioè le funzioni che,dopo che è avvenuto il legame, distruggono il bersaglio riconosciuto.Oggi comunque queste funzioni possono essere conferite artificial-mente ai peptidi mediante la coniugazione o fusione con specifichemolecole che svolgono una determinata funzione effettrice. I pepti-di possono quindi essere considerati degli anticorpo–mimetici. È damolto tempo che i peptidi vengono studiati per questi scopi ma alcuniinconvenienti ne hanno, fino a pochi anni fa, limitato il loro utilizzo.Oggi, grazie a nuove tecniche per la modificazione molecolare inlaboratorio, la sintesi chimica, e, al solito, grazie alle tecniche com-binatoriali che sfruttano grandi librerie molecolari, i peptidi stannoassumendo un ruolo sempre più rilevante nella produzione di farmaciselettivi. In questo libro saranno quindi prese in considerazione anchequeste molecole fornendo informazioni circa la loro identificazione,sviluppo e sintesi, portando anche degli esempi di peptidi attualmentenelle fasi più avanzate dello sviluppo farmaceutico.

Capitolo II

Gli anticorpi. Struttura, funzione e genetica

: .. Introduzione agli anticorpi, – .. Struttura degli anti-corpi, – .. Le classi degli anticorpi, – .. Legame anticorpo–antigene, – .. Organizzazione dei geni delle immunoglobuline, –.. Regolazione della ricombinazione mediante sequenze specifiche, – .. Regolazione trascrizionale dei geni degli anticorpi, – .. Matura-zione di affinità, – .. Commutazione di classe, – .. I frammentianticorpali, – .. Riferimenti bibliografici, .

.. Introduzione agli anticorpi

Gli anticorpi sono una componente del sistema immunitario che ècostituito da un articolato sistema di interazioni molecolari e cellularifinalizzato alla protezione dagli agenti esterni al corpo. Dal punto divista biochimico gli anticorpi sono delle glicoproteine appartenentialla classe delle gamma–globuline dette immunoglobuline, ed i ter-mini “anticorpo” e “immunoglobulina” vengono generalmente usaticome sinonimi. Il sistema immunitario viene convenzionalmentesuddiviso in “immunità umorale” ed “immunità cellulo mediata”. Inrealtà i due sistemi sono strettamente collegati, comunque si può direche il primo sistema sottende alla produzione da parte dei linfocitiB di molecole, gli anticorpi appunto, capaci di legare ed eliminaregli agenti estranei, ed il secondo all’attivazione di cellule, i linfociti T,capaci di distruggere le cellule infettate o malate. I linfociti prendonoorigine da una cellula staminale comune (pluripotente) che si trovanel midollo osseo. Questa cellula staminale nel corso della sua vitava incontro ad una maturazione che la porta a circolare nel sangue enei fluidi corporei come linfocita B o linfocita T. La cellula staminaleche diventa linfocita B, durante la sua maturazione inizia a subire

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Figura . (a), schema di differenziamento da cellula staminale a plasmacellula. (b),schema del riconoscimento di un antigene da parte di un anticorpo. L’epitopo è laregione dell’antigene legata dall’anticorpo.

dei cambiamenti radicali, tanto che ad un certo punto produce unaspecifica immunoglobulina che viene esposta sulla superficie cellularefunzionando come un recettore. La cellula a questo stadio è conside-rata un linfocita B maturo. Quando l’anticorpo sulla superficie dellacellula incontra la sua specifica molecola bersaglio, l’antigene, il linfo-cita si attiva, prolifica e va incontro ad un ulteriore differenziamentodiventando un nuovo tipo cellulare, la plasmacellula, che produceanticorpi solubili in grande quantità (Figura a). Un linfocita B, e tuttii suoi cloni derivati dall’attivazione, produce una grande quantitàdello stesso anticorpo che prende il nome di “anticorpo monoclona-le”. Un anticorpo monoclonale riconosce un singolo determinanteantigenico, o epitopo, sulla superficie di un intero antigene. In prati-ca un antigene è ciò che stimola il sistema immunitario a produrreanticorpi, l’epitopo è invece quella porzione di antigene che entra indiretto contatto con il sito di legame dell’anticorpo (Figura b). Conil termine aptene si intende invece una molecola molto piccola cheviene riconosciuta dagli anticorpi ma, al contrario dell’antigene, nonè in grado di scatenare una risposta immunitaria.

. Gli anticorpi. Struttura, funzione e genetica

Figura . Struttura schematica di un anticorpo

.. Struttura degli anticorpi

Un classico anticorpo visto al microscopio elettronico mostra unaevidente struttura a Y. Gli anticorpi sono formati da quattro polipep-tidi distinti, uguali due a due, legati tra loro da ponti disolfuro. Tuttii domini delle immunoglobuline hanno una struttura secondaria afoglietto–β. Il peso molecolare di una singola immunoglobulina variada tipo a tipo (vedi sotto) aggirandosi intorno ai KDa. In ognianticorpo ci sono due catene pesanti identiche e due catene leggereidentiche (Figura ). Le catene pesanti sono divise in quattro o, in al-cuni casi, cinque domini: VH (Variable Heavy), CH (Constant Heavy), CH, CH e, quando presente, CH. Nel dominio CH si trovanoi siti di glicosilazione a cui si attaccano i gruppi glicosidici che rendo-no gli anticorpi delle glicoproteine. Le catene leggere sono divise indue domini: VL (Variable Light) e CL (Constant Light). L’estremitàamino–terminale si trova in VH e VL e quella carbossi–ternimale inCL e in CH, o in CH quando questo è presente. Le regioni VH eVL sono quelle deputate al riconoscimento antigenico e sono carat-

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terizzate da una forte variabilità aminoacidica tra anticorpi diversi.All’interno di queste regioni si trovano tre zone ad enorme variabilitàaminoacidica dette regioni ipervariabili o CDR (ComplementarityDetermining Region). Le porzioni di proteina che stanno tra le varieCDR si chiamano regioni “framework” e sono molto meno variabilirispetto alle CDR. Le tre CDR della VH si ripiegano insieme alle treCDR della VL in modo da formare la regione dell’anticorpo che legal’antigene. Questa regione è detta sito di riconoscimento antigenico osito di legame, oppure, con una terminologia ormai desueta, “parato-po”. Il sito di riconoscimento antigenico permette ad ogni anticorpodi avere una specifica complementarità con un singolo epitopo. Ognisingolo anticorpo ha due siti di legame per lo stesso epitopo ed èquindi bivalente.

Le parti costanti delle catene pesanti e delle catene leggere nonhanno la funzione di legare l’antigene ma hanno una cruciale im-portanza strutturale e mostrano diverse proprietà biologiche, dettefunzioni effettrici, concentrate nella porione Fc dell’anticorpo, cioèla porzione di proteina identificata con il gambo della Y (Tabella ).Esistono diversi tipi di regioni costanti che definiscono le differen-ti proprietà biologiche. Ci sono due tipi di CL, le catene κ e λ, ecinque isotipi di CH, le catene µ, γ, α, δ, ε. I diversi isotipi di CHdefiniscono le classi degli anticorpi che sono IgM, IgG, IgA, IgD eIgE.

Ogni isotipo deriva da un gene diverso codificante per la regioneC (Figura a). Le differenze nelle regioni costanti dovute all’uso diun allele rispetto all’altro vengono invece definite come allelotipi-che, quindi il termine “allelotipo” o “allotipo” definisce un anticorpoderivato dal gene (allele) presente in uno dei due cromosomi omo-loghi e non nell’altro (Figura b). Il concetto di idiotipo è invecerelativo a differenze dovute a particolari associazioni VH e VL e ri-guarda quindi solo la parte variabile dell’anticorpo, compreso il sitodi legame (Figura c). Quando si parla di anticorpo anti–idiotipo siintende un anticorpo (per chiarezza chiamiamolo Ig) che riconosceun altro anticorpo (Ig) nella sua parte variabile, e, nel caso in cuil’epitopo idiotipico di Ig sia formato proprio dal sito di legame e nondal resto della parte variabile, si dice che l’anticorpo anti–idiotipo

. Gli anticorpi. Struttura, funzione e genetica

Tabella . Principali caratteristiche e funzioni effettrici delle immunoglobuline (Ig).IgG IgA IgM IgD IgE

Principalicaratteristiche

Ig più abbondantinei fluidi corporei

interni dovecombattono i

microorganismi ele loro tossine

Ig presenti nellemucose doveproteggono le

superfici esternecorporee

Agglutinantimolto efficaci,sono prodottinella rispostaimmunitaria

primaria, sono laprima linea

difensiva controla batteriemia

Praticamentepresenti solo

sulla superficedei linfociti B

Mediano lasecrezione di

citochine. Sonoprodotte nelleinfezioni da

parassiti. Sonoresponsabili deisintomi allergici

Fissazione delcomplementoVia classica + + - + + + - -

Via alternativa - + - - -

Attraversamentoplacenta

++ - - - -

Legame amastociti e

basofili

- - - - + +

Legame amacrofagi e

polimorfonucleati

+ + + + - - +

Legenda: + + + eccellente attività. + + buona attività. + attività percepibile. – nessuna attività.

Figura . Differenze tra isotipi (a). Differenze tra allelotipi (b). Differenze traidiotipi (c)