Metabolismo energetico

Ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA)

o ciclo dell’acido citrico o ciclo di Krebs

Reazioni chimiche e regolazione,

funzioni anaboliche e reazioni anaplerotiche

Metabolismo energetico e respirazione cellulare

Il trasferimento dell’energia è un bisogno cruciale per la vita nei sistemi biologici.

L’energia acquisita dalle sostanze nutrienti deve essere usata per guidare negli organismi i processi “endoergonici”.

1. Sintesi di Acetil-CoA

(ossidazione di glucosio, acidi grassi e scheletro carbonioso

degli aminoacidi)

(Carboidrati)

(Lipidi)

(Proteine)

2. Ossidazione dell’Acetil-CoA

nel ciclo degli acidi tricarbossilici

(ciclo TCA)

3. Fosforilazione ossidativa (riossidazione del NADH e

FADH2 prodotti dal ciclo TCA accoppiata alla sintesi di ATP)

β-alanina acido pantoico

Struttura chimica del Coenzima A (CoASH o CoA)

Centro reattivo, forma legami

tioesterei con gli acidi carbossilici

β-mercapto etilammina

(deriva dalla decarbossilazion

e della Cys)

β-mercapto etilammina +

acido pantotenico +

gruppo fosfato

4’-fosfopanteteina

E’ formato dalla 4’-fosfopanteteina legata all’adenosina 3’-5’-bisfosfato

Adenosin- 3’,5’-bisfosfato

L’acetil-CoA è una molecola polifunzionale ed è un composto ad alto contenuto energetico

Acetil-Coenzima A

stabilizzazione per risonanza

idrolisi

ionizzazione

acetil-CoA

acido acetico

acetato

Idrolisi dell’acetil-CoA

L-malato

Ossalacetato

Acetil-CoA

Citrato

Isocitrato

α-chetoglutarato

Succinato

Fumarato

Succinil-CoA

Citrato sintasi

Aconitasi

Isocitrato deidrogenasi

Succinil-CoA sintetasi

α-chetoglutarato deidrogenasi

Succinato deidrogenasi

Fumarasi

Malato deidrogenasi

Ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA)

(o Ciclo dell’acido citrico o Ciclo di Krebs)

- è un processo mitocondriale possibile solo in condizioni aerobiche

- l’ossidazione di 1 mole di Acetil-CoA è accoppiata alla liberazione di 2 moli di CO2 e alla formazione di

3 moli di NADH 1 mole di FADH2

1 mole di GTP ( 1 ATP)

- consiste di 8 tappe di cui 3 irreversibili

2

1

3

…

- richiede diversi coenzimi vitaminici e cofattori: - NAD+ (Niacina o vit. B3) - FAD (Riboflavina o vit. B2) - TPP (Tiamina o vit. B1)

- Coenzima A (acido pantotenico) - acido lipoico

- ioni metallici quali Mg2+, Ca2+, Fe2+, Mn2+

- ioni fosfato

ADP ATP

GTP/ATP fosfotransferasi

GTP GDP

citrato sintasi

Citrato

Ossalacetato

Acetil-CoA

ΔG’° = -32,2 kJ/mol

1 – Formazione del citrato

Deriva dall’ossidazione del glucosio, degli acidi grassi e dello scheletro carbonioso di alcuni aminoacidi

Per avviare le reazioni del ciclo TCA, l’OAA si forma, in quantità catalitiche, per carbossilazione del piruvato. Quindi, l’OAA viene continuamente ripristinato come prodotto terminale del ciclo stesso Biotina

Piruvato carbossilasi

- - -

2 – Formazione dell’isocitrato attraverso il cis-aconitato

Citrato ~ 90%

cis-aconitato ~ 4%

Isocitrato ~ 6%

aconitasi aconitasi

ΔG’° = +13,3 kJ/mol

Citrato

Sito attivo dell’aconitasi

citrato sintasi

Fluorocitrato inibitore

competitivo dell’aconitasi

Ossalacetato

Acetil-CoA

F

Citrato ~ 90%

cis-aconitato ~ 4%

Isocitrato ~ 6%

aconitasi aconitasi

La reazione catalizzata dall’aconitasi è “drasticamente inibita” dal fluoroacetato (CH2F-COO-)

CH2F-COO- Acetil-CoA sintetasi

CoA-SH ATP

AMP + PPi

CH2F-CO~SCoA

Fluoroacetil-CoA

3 – Decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato ad α-chetoglutarato (“tappa limitante” del ciclo)

Isocitrato deidrogenasi

Isocitrato deidrogenasi

Isocitrato Ossalsuccinato (intermedio che resta

legato all’enzima)

α-Chetoglutarato

ΔG’° = -22,2 kJ/mol

4 – Decarbossilazione ossidativa dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA

Complesso dell’ α-chetoglutarato

deidrogenasi (E1, E2, E3) Succinil-CoA α-Chetoglutarato

Coenzimi “vitaminici” del complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi

- tiamina pirofosfato (TPP) ( tiamina o vitamina B1)

- flavin adenin dinucleotide (FAD) ( riboflavina o vitamina B2)

- nicotinammide adenin dinucleotide (NAD) ( niacina o vitamina B3)

- coenzima A ( acido pantotenico o vitamina B5)

- acido lipoico

ΔG’° = -33,5 kJ/mol

NAD+ (forma ossidata)

NADH (forma ridotta)

2H+

+ H+ 2e- H H nicotinammide

4 4 4

Struttura chimica dei coenzimi piridin-nucleotidici NAD+ e NADP+

Struttura chimica dei coenzimi flavinici FAD e FMN

Tiamina o Vitamina B1

E’ formata da un anello pirimidinico (2,5-dimetil-6-ammino pirimidina) e da un anello tiazolico (4-metil-5-idrossietil tiazolo), legati tra loro da un ponte metilenico

La tiamina è fondamentale per la biosintesi del coenzima tiamina pirofosfato (TPP)

che svolge un ruolo cruciale nelle reazioni del metabolismo dei carboidrati

Struttura chimica e biosintesi del coenzima

tiamina pirofosfato (TPP)

Tiamina

Tiamina pirofosfato

Carbonio reattivo

Il centro attivo della TPP è il C2 dell’anello tiazolico che tende a perdere il

protone per formare un carbanione.

Struttura chimica del Coenzima A (CoASH o CoA)

Centro reattivo, forma legami

tioesterei con il gruppo carbossilico

di un acido

E’ formato dalla 4’-fosfopanteteina legata all’adenosina 3’-5’-bisfosfato

Forma ossidata

Forma ridotta

Catena polipeptidica dell’enzima E2

(diidrolipoil transacetilasi)

residuo di Lisina

dell’enzima E2

(Lipoillisina)

Acido lipoico

Acido lipoico (o lipoato) (acido 6,8-ditioottanoico)

PSEUDOVITAMINA perché gli animali superiori lo sintetizzano in quantità adeguate a partire da acido ottanoico o acido caprilico

Reagisce con elevata affinità con ioni arsenito e ioni Hg2+ che lo inattivano

R-As

Acido lipoico

O-As-R arsenito

H2O

Complesso inattivo

Forma acilata

R

Legame tioestere

Meccanismo di decarbossilazione ossidativa dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA

Lipoillisina ossidata

Lipoillisina ridotta

α-Chetoglutarato

deidrogenasi Diidrolipoil transacilasi

Diidrolipoil deidrogenasi

Lipoillisina ridotta

Lipoillisina ossidata

Succinil-CoA

Idrossibutirril-TPP

α-chetoglutarato

Succinil-CoA sintetasi (o succinato tiochinasi)

Succinil-CoA Succinato

ADP ATP GTP/ATP fosfotransferasi

Fosforilazione a livello del substrato

5 – Conversione del succinil-CoA a succinato

ΔG’° = -2,9 kJ/mol

Meccanismo d’azione della succinil-CoA sintetasi

Succinil-CoA

Succinil fosfato legato all’enzima

Fosfoistidil enzima

Succinil-CoA sintetasi

Succinato

Succinato deidrogenasi

Succinato Fumarato

6 – Ossidazione del succinato a fumarato

La succinato deidrogenasi è una flavoproteina che, a differenza di tutti gli altri enzimi del ciclo TCA, è inserita nella membrana mitocondriale interna (complesso II della catena respiratoria).

Malonato

Ossalacetato

L’enzima è inibito competitivamente dal malonato, mentre fisiologicamente è inibito a feed-back dall’ossalacetato.

ΔG’° = 0 kJ/mol

Fumarasi

Fumarato L-malato

Fumarasi

Carbanione stato di transizione

7 – Idratazione del fumarato a L-malato

La reazione è altamente stereospecifica.

Fumarato Maleato L-malato D-malato

La struttura del sito catalitico dell’enzima è tale da non poter utilizzare come substrato il maleato, isomero geometrico del fumarato,

e da produrre esclusivamente come prodotto di idratazione il malato in configurazione L.

ΔG’° = 0 kJ/mol

Ossalacetato L-malato

malato deidrogenasi

citrato sintasi

L’ossalacetato riprende quindi il ciclo di reazioni con la condensazione con un’altra molecola di Acetil-CoA e formazione di citrato, etc ……………

Citrato

Ossalacetato

Acetil-CoA

8 – ossidazione dell’L-malato a ossalacetato

Anche la malato deidrogenasi ha un sito catalitico altamente stereospecifico: può deidrogenare solo malato in configurazione L.

ΔG’° = +29.7 kJ/mol

Bilancio e resa energetica del ciclo TCA

ΔG’° = -32,2 kJ/mol

ΔG’° = +13,3 kJ/mol

ΔG’° = -22,2 kJ/mol

ΔG’° = -33,5 kJ/mol

ΔG’° = -2,9 kJ/mol

ΔG’° = 0 kJ/mol

ΔG’° = 0 kJ/mol

ΔG’° = +29,7 kJ/mol

3 NADH 3 x 2,5 mol ATP

1 FADH2 1 x 1,5 mol ATP

1 GTP 1 mol ATP

Totale 10 mol ATP

x ~ 50 kJ/mol

= ~ 500 kJ

In una bomba calorimetrica l’energia misurabile per ossidazione completa di 1 mole di Acetil-CoA a CO2 e

H2O è pari a ~ 950 kJoule. Quindi la

resa = 500 kJ/950 kJ x 100 =

~ 53%

ΔG’°complessivo del ciclo = -47,8 kJ/mol

NADH + H+ + ½ O2 ---> NAD+ + H2O ΔG’° = - 220 kJ/mole

FADH2 + ½ O2 ---> FAD + H2O ΔG’° = - 150 kJ/mole

Fosforilazione ossidativa

NADH deidrogenasi

succinato deidrogenasi

matrice mitocondriale

spazio intermembrana

membrana mitocondriale esterna

membrana mitocondriale

esterna

Citocromo b-c1

(Fe)

(Fe) (Fe)

Potenziale elettrico

Δ

(interno negativo)

e-

e-

e- e-

e-

e-

FAD

Citocromo ossidasi (Fe-Cu)

FADH2

FADH2

e-

e-

Potenziale chimico ΔpH

(interno basico)

Potenziale elettrico

Δ

(interno negativo)

Forza proton motrice guida la sintesi di

ATP

Fumarato Succinato

Citocromo c Citocromo c

FAD

Regolazione del ciclo degli acidi tricarbossilici

Citrato sintasi

ATP, NADH, citrato, succinil-CoA

_

ADP +

α-chetoglutarato deidrogenasi

NADH, succinil-CoA

_ Ca++ +

Isocitrato deidrogenasi ATP, NADH

_ ADP, Ca++ +

Malato deidrogenasi

NADH _

La regolazione del ciclo, che avviene solo in condizioni di aerobiosi (disponibilità di O2), si regola principalmente a livello delle tre

tappe irreversibili.

Regolazione del ciclo degli acidi tricarbossilici

La regolazione del ciclo, che avviene solo in condizioni di aerobiosi (disponibilità di O2), si attua attraverso tre meccanismi e deve contribuire a commisurare oculatamente la produzione di ATP alla effettiva richiesta da parte della cellula:

- potenziale energetico Il flusso metabolico nel ciclo dipende fondamentalmente dai rapporti NADH/NAD+, ATP/ADP, acetil-CoA/CoASH, succinil-CoA/CoASH. Valori elevati di questi rapporti, espressione di disponibilità energetica, rallentano il ciclo; valori bassi, indice di richiesta energetica, accelerano il ciclo.

- accesso dei metaboliti nella matrice mitocondriale Il flusso metabolico nel ciclo che si svolge nel compartimento mitocondriale è innanzitutto

regolato dall’accesso dei metaboliti precursori dell’acetil-CoA (piruvato, acidi grassi, alcuni aminoacidi). L’accesso è mediato da sistemi di trasporto più o meno specifici localizzati nella membrana mitocondriale interna modulati in modo tale da non avere accumulo di questi precursori nella matrice.

- disponibilità degli intermedi Alcuni intermedi possono essere distolti dal ciclo per essere utilizzati in reazioni collaterali

(“ruolo anabolico del ciclo”).

Precursori dell’acetil-CoA

Lipidi (grassi)

Corpi chetonici

Carboidrati Proteine

Aminoacidi

Acidi grassi Acetoacetato Glucosio

Piruvato

Etanolo Glucosio

R

n

Acetil-CoA

Piruvato carbossilasi

Aminotransferasi

Enzima malico

NADPH + H+

NADP+

Fosfoenolpiruvato CO2

GDP

GTP

HCO3-

PEP carbossichinasi

Amino transferasi

Glutamato deidrogenasi

7

5

3

2 1

4

6

Principali reazioni “anaplerotiche” (o “di riempimento”) del ciclo TCA

La reazione 3 catalizzata dall’enzima malico ha sede citoplasmatica ed il malato prodotto deve poi essere trasferito nel mitocondrio

Intermedi metabolici prodotti dalla degradazione degli L-α-aminoacidi proteici

Leucina Lisina Fenilalanina Triptofano Tirosina

Arginina Glutammina Istidina Prolina

Isoleucina Metionina Treonina Valina

Fenilalanina Tirosina

Alanina Cisteina Glicina Serina Treonina Triptofano

Asparagina Aspartato

Glutammato

Acetoacetil-CoA

Acetil-CoA

Ossalacetato Fumarato

Succinil-CoA

α-chetoglutarato

Piruvato

Isocitrato

Citrato

Malato

Succinato

Glucosio

Ciclo TCA

Corpi chetonici

Leucina Isoleusina Triptofano Treonina

Glucogenici

Chetogenici

Ruolo del ciclo dell’acido citrico nell’anabolismo Il ciclo TCA è fondamentalmente un “processo catabolico produttore di energia”.

Tuttavia, alcuni intermedi possono essere dirottati per assolvere “funzioni anaboliche”. Pertanto,

il ciclo TCA è un “ciclo anfibolico” ossia capace di produrre energia ma anche di formare intermedi che possono essere utilizzati

per la sintesi di glucidi, lipidi, proteine e altri composti azotati.

Sintesi aminoacidi (aspartato, asparagina)

Sintesi basi azotate

pirimidiniche

Glucosio

Porfirine, eme

Fosfoenolpiruvato

Sintesi acidi grassi e colesterolo

Sintesi alcuni neurotrasmettitori

(nel cervello)

Sintesi aminoacidi (serina, glicina,

cisteina)

Glucosio

Sintesi basi azotate puriniche

Gluconeo genesi

Sintesi aminoacidi (glutammato, prolina,

glutammina, arginina)

Gluconeo genesi