2a DIMENSIONE: SDS PAGE

2a DIMENSIONE: SDS PAGE

- Riduzione e alchilazione -denaturazione con SDS

-EQUILIBRATION

2a DIMENSIONE: SDS PAGE

Rf = mobilità relativa delle proteine: rapporto tra la distanza percorsadalla proteina rispetto a quella percorsa dal colorante

2

GEL 2DGEL 1D

METODI DI DETECTION

Caratteristiche-Sensibilità-Range dinamico-Riproducibilità-Variabilità (proteina-proteina)- Compatibilità con le analisi successive

Metodi-Coloranti anionici: Coomassie BB-Silver stain-Isotopi radioattivi-Fluorescenza

.

METODI DI DETECTION

OVERVIEW

Coomassie blue, semplice riproducibile, buon range dinamico, poco sensibile, metodo di Bradford.

Silver staining, step multipli, range dinamico variabile, sensibile (AgNo3 si lega a specifici residui proteici, gli ioni argento vengono ridotti ad argento metallico e quindi nella forma visibile per azione della formaldeide a pH alcalino (MS compatibile)

Sypro ruby (semplice, buon range dinamico, molto sensible ma poco conveniente)

Coloranti specifici per particolari proteine (molto sensibili ) (ProQ Esmerald glycoprotein stain; ProQ Diamond Phoshoprotein stain)

Altri metodi ( immunodetection, coloranti fluorescenti)

IDENTIFICAZIONE DI PROTEINE DA GEL

Excisione della spot da gel

Estrazione della proteina e digestione con tripsina

Analisi dei frammenti triptici tramite spettrometria di massa

Confronto dei frammenti con digeriti teorici presenti nei database

apolipoprotein

Match to: gi|178775Score: 93Expect: 6.6e-05

Nominal mass (Mr): 28944 Calculated pI value: 5.45

Sequence Coverage: 31%

1 RHFWQQDEPP QSPWDRVKDL ATVYVDVLKD SGRDYVSQFE GSALGKQLNL 51 KLLDNWDSVT STFSKLREQL GPVTQEFWDN LEKETEGLRQ EMSKDLEEVK 101 AKVQPYLDDF QKKWQEEMEL YRQKVEPLRA ELQEGARQKL HELQEKLSPL 151 GEEMRDRARA HVDALRTHLA PYSDELRQRL AARLEALKEN GGARLAEYHA 201 KATEHLSTLS EKAKPALEDL RQGLLPVLES FKVSFLSALE EYTKKLNTQ

Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)Variable modifications: Oxidation (M)Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is PNumber of mass values searched: 22Number of mass values matched: 10

Spot SSP 1106

MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI

L’elettroforesi bidimensionale è un ottimo metodo di studio per le modificazioni post- traduzionali