Le tecniche molecolari nella Le tecniche molecolari nella diagnosi delle epatitidiagnosi delle epatiti

dott. Danila BassettiMicrobiologia e VirologiaStruttura Semplice Sierologia AutoimmunitàOspedale S.Chiara di Trento

Biologia Molecolare ed EpatitiBiologia Molecolare ed Epatiti

Integrazione nella loro gestione clinica con finalità di:

� Diagnosi delle forme acute e croniche� Prognosi e predittività dell’efficacia

terapeutica� Monitoraggio clinico e terapeutico

AA““FecFec--oraleorale””

““ParenteraliParenterali””

Epatiti viraliEpatiti virali

Trasmissione Trasmissione

entericaenterica

TrasmissioneTrasmissione

parenteraleparenterale

F, ? altreF, ? altre

EE

NANBNANB

BB

DD

CC

Epatiti virali Epatiti virali -- Vie di trasmissioneVie di trasmissione

FF

Clinica epatiti Clinica epatiti BB e e CC: : variabili influentivariabili influenti

Virus:Virus:• Attività replicativa

• “Viral load”• Genotipo• Mutazioni da ceppo

“wild type”• Resistenza a farmaci

anti-virali

Paziente:Paziente:• Età (sesso)• Immunodepressione• Gravidanza

• Trasmissione verticale

• Comorbidità• Genetica (IL28R, IFN λ)

• Insulinoresistenza

Biologia Molecolare ed epatiti B / CBiologia Molecolare ed epatiti B / C

QUANDO

?

PERCHE’

?

COME

?

Forme CRONICHE

Forme ACUTE

HBV e Biologia MolecolareHBV e Biologia Molecolare

� (HBV-DNA qualitativo)� HBV-DNA quantitativo (“viral load”)� Ricerca mutanti o varianti “escape”� Genotipizzazione� Ricerca resistenze ad antivirali

4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 52

Epatite acuta B: marcatori sierologici

ItteroItteroSintomiSintomi

⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑ ALTALTHBeAgHBeAg AntiAnti --HBeHBe

AntiAnti --HBcHBc

AntiAnti --HBsHBs

IgM antiIgM anti --HBcHBc

HBsAgHBsAg

Settimane dopo lSettimane dopo l ’’esposizioneesposizione

Tito

loT

itolo

HBVHBV--DNADNA

Biologia Molecolare Biologia Molecolare ed Epatite B acutaed Epatite B acuta

� Generalmente non necessaria� Utile nella identificazione di:

� varianti HBV “escape”� forme c.d. Occulte

Settimane dopo l’esposizioneSettimane dopo l’esposizione

Tito

loT

itolo

IgM antiIgM anti --HBcHBc

Total antiTotal anti --HBcHBc

HBsAgHBsAg

AcutaAcuta(6 mesi)(6 mesi)

HBeAg

CronicaCronica(anni)(anni)

anti-HBe

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 annianni

Cronicizzazione: decorso sierologico tipicoHBV DNAHBV DNA

HBVHBV--DNA: indicatore prognosticoDNA: indicatore prognostico

Incidenza Cumulativa di HCC(%) (n=3653)

Chen CJ et al. JAMA. 2006;295:65-73.Iloeje UH et al. Gastroenterology. 2006;130:678-686.

<300 (Undetectable) 300-9999 10,000-99,999 100,000-999,999 ≥1 million

REVEAL Studio: Livelli HBV DNA ed evoluzione

1.37%

3.57%

14.89%

1.30%

12.17%

0

5

10

15

20

3.6

9.7

2.0

1.0

10.6

0

2

4

6

8

10

12

Multivariata-rischio relativo di cirrosi (n=3482)

Viral Load at Baseline

Distribuzione genotipi HBVDistribuzione genotipi HBV

F

CD

E

A

DD

D

C

Ba

F

A,B,C,D

BjA,B,C,D

F

AD

H

H

G

Cronicizza A>D Rischio fibrosi C>BPre core mutazione B,C,D>A Rischio mortalità F>A o DHBeAg sieroconv B versus C Risposta a IFN A>D, B>C

Genotipizzazione HBVGenotipizzazione HBV�Genotipo C

� Più spesso associato con malattia epatica severa e HCC rispetto al genotipo B

�Genotipo B� Associato con sieroconversione da HBeAg

ad anti-HBe in età più giovane rispetto al genotipo C

�Genotipi A e B� Più alto tasso di risposta antivirale e

perdita HBeAg in seguito a terapia con pegIFN alfa rispetto al genotipo D e C

Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2006;4:936-962.

HBV Genotyping Line Probe Assay

Marker line Conj. control Amp. control

Genotype A

Genotype B

Genotype C

Genotype D

Genotype E

Genotype F

Genotype G

123456789

10111213141516

Infezione cronica da HBV: evoluzione

Infezione cronica

7-10%

Epatitecronica

Portatoreasintomatico

60-65%

35-40%

CirrosiOLT/decesso

HCC

25-30%

5%

Nucleoside/Nucleoside/nucleotidenucleotideanaloghianaloghi

InterferoneInterferoneαα

Terapie per Epatite B Cronica

Azione Antivirale

Azione Antivirale

Immunomodulazione

T helper cell

Natural killer cell

Cytotoxic T cell

Antigen Presenting Cell

B cell

Terapia epatite B: Terapia epatite B: due approcci diversidue approcci diversi

Interferone (PEG-IFN)� Meccanismo immunostimolante-antivirale� Terapia “finita” (48 settimane)

Analoghi nucleosid(t)ici (NUCs)� Meccanismo antivirale puro� Terapia “long term”

Scopo monitoraggio terapia Scopo monitoraggio terapia Epatiti B e CEpatiti B e C

� Misura efficacia antivirale:HBV,HCV

� Predizione dell’outcome: HBV,HCV

� Modifica precoce della terapia• sospensione per inefficacia: HCV

• adattamento: HBV

� Diagnosi di resistenza: HBV

Risposta virologica HBVRisposta virologica HBV

Risposta ad IFN

Risposta a NUCs

HBV-DNA <2000 UI/mL alla 24 sett. terapia

HBV-DNA <15 UI/mL entro 48 sett. terapia

Terapia Epatite B cronicaTerapia Epatite B cronica

LAM FTCADV

LdTETV TDF

Barriera genetica

Pot

enza

Nucleotidi analoghiNucleosidi analoghi

IFN

Farmaci antiFarmaci anti --HBVHBV

ATTIVITA’ ANTIVIRALE : potenza e barriera genetica

Resistenza ad analoghi nucleos(t)idici

0

10

20

30

40

50

60

70

80

LAM

ADV

ETV

ETV in LAM-RLDT

LDT in EUTDF

Year 1

Year 3

Year 5

Year 1Year 2Year 3Year 4Year 5

Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36:687-96; Lok et al Gastroenterology 2003; 125 : 1714-1722; Zoulim et al J Viral Hepatitis 2006;13:278-288; Hadzyiannis et al NEJM 2005; 352 : 2673-2681; Chang et al. NEJM 2006; 351: 1001-1010; Lai et al NEJM 2006; 354: 1011-1020; Lai et al Abstract # 91, AASLD 2006. Colonno R et al. Abstract #110, AASLD 2006. Globe study. Data on file. Keefee et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2008; 6:268-274.

Terminal protein Spacer Reverse transcriptase RNase H

F G A C D EB

1 344YMDD

M204V or I

M204I

A181V or T N236T K241E

K318Q

V173L

L180M

M250

S202T184

I169Lamivudine-resistant mutationsAdefovir-resistant mutations

Entecavir-resistant mutations (requires pre-existing M204I/V mutation)

Telbivudine-resistant mutations

Mutazioni nel genoma HBV causa di Mutazioni nel genoma HBV causa di resistenza ad antiviraliresistenza ad antivirali

K. Kowdley.

Resistenza HBV ad antivirali: Resistenza HBV ad antivirali: ibridazione inversa

Profili di Resistenza indotti da mutazioni viraliProfili di Resistenza indotti da mutazioni virali

HBV e gravidanzaHBV e gravidanza

Kits HBVKits HBV--DNADNA

Kits HBVKits HBV --DNA: DNA: sensibilitsensibilit àà e ranges dinamicie ranges dinamici

Virus Epatite C

Prevalenza HCV nel mondo

1, 2, 31, 2, 3 1, 2, 31, 2, 31, 31, 3

1,31,3

11

33

44

4444

4,54,5

Asia: 6Asia: 633

Europe8.9 million(1.03%)

The Americas13.1 million(1.7%)

Africa31.9 million(5.3%)

Southeast Asia32.3 million(2.15%)

Western Pacific62.2 million(3.9%)

Eastern Mediterranean21.3 million(4.6%)

World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence: update. 2003. Farci P, et al. Semin Liver Dis. 2000;20:103-126. Wasley A, et al. Semin Liver Dis. 2000;20:1-16.

Stimati 170-180 milioni di portatori (3,1%) globale

HCV e Biologia MolecolareHCV e Biologia Molecolare

� (HCV-RNA qualitativo)� HCV-RNA quantitativo (“viral load”)� Genotipizzazione

Marcatori di Infezione da HCVMarcatori di Infezione da HCV

Epatite acuta che guarisce

Sintomi +/-

Tempo dopo esposizione

Titolo

anti-HCV

ALT

Normale

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4annimesi

HCV RNA

Ag

Epatite acuta che cronicizza

SintomiSintomiSintomiSintomi+/+/+/+/----

Tempo dopo esposizione

Titolo

Anti-HCV

ALT

Normale

0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4annimesi

HCV RNA

Ag

Kit HCVKit HCV--RNA: RNA: sensibilitsensibilitàà e ranges dinamicie ranges dinamici

Biologia Molecolare ed Epatite C acutaBiologia Molecolare ed Epatite C acuta

� Generalmente non necessaria� Utile nella identificazione di:

� fasi pre-sierologiche

� trasmissione verticale (monitoraggio neonato 0,3,12 mesi)

HCV genotipiHCV genotipi

Prevalenza genotipi HCV nel mondo

Genotipo e risposta alla terapiaGenotipo e risposta alla terapia

� I genotipi 1 (a,b) e 4 presentano una minore risposta alla terapia

� “Viral load baseline” e genotipo sono i due principali predittori indipendenti di risposta sostenuta alla terapia (SVR)

� Sono previsti schemi posologici differenziati tra genotipi (dose e durata terapia)

� Tuttavia pazienti con lo stesso genotipo e con gli stessi livelli di viremia basale hanno differenti risposte alla terapia → anche altri fattori condizionano la risposta alla terapia (insulinoresistenza, mutazione IL28R per IFN λ)

Timing del monitoraggio virologicoTiming del monitoraggio virologico

Risposta virologica alla terapia: Risposta virologica alla terapia: HCVHCV--RNARNA

� RVR: negativo a 4 settimane di terapia

� EVR: completa negativo a 12 sett.

parziale calo > 2 log10 a 12 sett.

� NR: < 2 log10 da valori base a 12 sett.

� non-vRVR : calo <0.8 log10 a 48 ore predittività negativa per SVR

�SVR: negatività a 6 mesi da fine terapia

DeDefinizione della risposta virologica finizione della risposta virologica alla 4 e 12 settimana di terapiaalla 4 e 12 settimana di terapia

Monitoraggio terapia epatite C genotipo 1

Monitoraggio terapia epatite C genotipo 2/3

HBV DNA HBV DNA –– HCV RNA HCV RNA

Il rilevamentodel genoma virale è il parametro

più attendibileper la diagnosi e per il

monitoraggio dell’infezione

Sonde specifiche per il target

Tecniche di biologia molecolare

Take-home MessagesNella gestione delle epatiti B e C la Nella gestione delle epatiti B e C la Biologia Molecolare Biologia Molecolare èè in grado di:in grado di:

�� Confermare la diagnosi Confermare la diagnosi (f. acute e croniche)(f. acute e croniche)

�� Definire indici prognosticiDefinire indici prognostici�� Orientare la scelta di opzioni terapeutiche Orientare la scelta di opzioni terapeutiche

(farmaco, posologia, durata, sospensione)(farmaco, posologia, durata, sospensione)

�� Monitorare outcome clinico e terapeuticoMonitorare outcome clinico e terapeutico�� Confermare trasmissione maternoConfermare trasmissione materno --fetalefetale

GRAZIE dellGRAZIE dell’’Attenzione!Attenzione!

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