SENSORI & BIOSENSORI: Analisi dei Prodotti

Gianfranco GreppiLaboratorio di Bionanotecnologie.Porto Conte RicercheUniversità di Sassari

Sommario

Ricerca e Trasferimento Perché i biosensori La tecnolgia Le applicazioni

building block

Università

Enti pubblici e Non-profit

Imprese con i propri laboratori

infrastrutture di base

building block

Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione

RECESSIONE E MANCATA RICERCARECESSIONE E MANCATA RICERCA

Francia 38 miliardi

INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE

PIA, POR, MIUR innovazione

ULTIMO DEI PAESI DEL G7

Unico con oltre 50% finanziamento pubblico

PRODUTTIVITA’ +0,8

Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE

Un percorso per il trasferimento tecnologico nel settore delle Biotecnologie

Relatore: GIANFRANCO GREPPI- LEA BIOTECH SPINOFF UNIMI

Il sistema della ricerca, della sperimentazione e del trasferimento dell’innovazione

building block

Università

Enti pubblici e Non-profit

Imprese con i propri laboratori

infrastrutture di base

Le Università costituiscono da sempre uno Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi sistemi della ricerca e dell'innovazionedella ricerca e dell'innovazione

building block

Le Università costituiscono da sempre uno Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi sistemi della ricerca e dell'innovazionedella ricerca e dell'innovazione

Ogni istituzione può giocare molteplici ruoli: formazione, ricerca fondamentale e applicata, sviluppo tecnologico

- i legami tra gli attori del sistema si sono intensificati: le collaborazioni tra imprese, Enti e Università, non sono più eventi sporadici ma prassi comune; esse coinvolgono crescenti flussi di risorse finanziarie, di uomini e di conoscenze

- la comparsa e l'affermazione del sistema finanziario come nuovo attore nei SI, con un ruolo del Venture Capital

-Start-up nei settori di punta tecnologica, originate nelle Università e nei Centri di Eccellenza scientifica.

RECESSIONE E MANCATA RICERCARECESSIONE E MANCATA RICERCA

Francia 38 miliardi

INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE

PIA, POR, MIUR innovazione

ULTIMO DEI PAESI DEL G7

Unico con oltre 50% finanziamento pubblico

PRODUTTIVITA’ +0,8

Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE

DIDATTICA

RICERCA DI BASE

APPLICATA

TRASFERIMENTO

SPIN-OFF

DIDATTICA

RICERCA DI BASE

APPLICATA

SPIN-OFF

DIDATTICA

RICERCA DI BASE

APPLICATA

SPIN-OFF

RECESSIONE E MANCATA RICERCARECESSIONE E MANCATA RICERCA

I mpr es e bi otec nol ogi c he per s ettor e mer c eol ogi c o

12

11

22

58

0 10 20 30 40 50 60 70

Cura del la salute

Agroal imentare

Chimico

Ambiente

BIOTECH & PMI (2003)BIOTECH & PMI (2003)

Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro.Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro.

Tecnologie applicate nelle imprese biotecnologiche in Italia

42

28

14

24

23

22

22

10

5

13

12

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

P CR

Fermentazione, separazione dei prodotti

Biotrasformazioni, enzimologia e biocatalisi

Acidi nucleici e sonde

Clonaggio in microrganismi piante ed animali, DNA ricombinante

Anticorpi monoclonali

Genomica e proteomica

Chimica combinatoria

Cellule staminali

Bioremediation

Bioinformatica

n° imprese

BIOTECH & PMI (2003)BIOTECH & PMI (2003)

BASSI COSTIHIGH THROUGHPUT

QUALITA’ DEI DATIINTEGRAZIONESTANDARDIZZAZIONEDECENTRALIZZAZIONEINFORMAZIONE

Vecchi valori Nuovi valori

CURVA APPRENDIMENTO ACCELERATA

BIOTECH & PMI 1990 vs 2010BIOTECH & PMI 1990 vs 2010

MICRO DIMENSIONI INFORMAZIONE DIGITALE NUOVE PIATTAFORME BASSI CONSUMI REAGENTI MISURE DIRETTE

SCREENING

NUOVI LEAD

PROTEOMICA

GENOMICA

ARRAY

BIOTECH & PMI 2006-2010BIOTECH & PMI 2006-2010

BIOTECH & PMI TRENDBIOTECH & PMI TREND

BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E PER LA BIOSICUREZZA DEI PER LA BIOSICUREZZA DEI PRODOTTIPRODOTTI

BIOTECH & PMI TRENDBIOTECH & PMI TREND

BIOTECH & PMI PRODOTTIBIOTECH & PMI PRODOTTI

GENOMICA

SVILUPPORICERCA

ANALISI CHIMICAANALISI CHIMICAANALISI BIOLOGICA

IDENTIFICA IL TARGET

VALIDAIL TARGET

IDENTIFICA IL LEAD

OTTIMIZZA LEAD

TEST PRE-CLINICI

TEST CLINICI

PROTEOMICA FARMACOGENOMICA DRUG DELIVERY

Bioinformatica

PIATTAFORMA BIOTECH

Bioinformatica

Biotech & Fusion Technologies

Genomics, Proteomics and Bioinformatics: Combinatorial –chemistry Peptide libraries- tea bags, beadsCombinatorial –biology Directed evolution DNA Shuffling, Molecular Breeding High throughput analysis:

Nucleic Acid based SequencingMicroarrays Protein based.2-D, electrospray/nanospray MS: MALDI-TOF, LC/MS/MS, SELDI

Imaging/optical biology.Biosensors, Bioelectronics Bionetworks (Nanotechnology).

MICROARRAY

PROTEOMICA

La conoscenza deve scorrere daquelli che sannole cose a quelli che fannocose

Joel Mokyr “Historical Origins of Knowledge Economy”Princeton University 2002

Joel Mokyr “Historical Origins of Knowledge Economy”Princeton University 2002

Perchè i biosensori?

I biosensori sono degli strumenti analitici con potenzialità enormi, sia in termini di interesse scientifico, sia in termini di applicazioni commerciali:

– Capo medico diagnostico. – Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque– Analisi in remoto per contaminazioni batteriche nelle attività

bioterrorismo. – Analisi dei patogeni negli alimenti – Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e

acido pantotenico – Analisi di antibiotici negli alimenti

I biosensori

I BIOSENSORI sono degli strumenti analitici costituiti da un componente biologico e un trasduttore.

trasduttorecomp. biologico

film protettivo

PC

Schema logico di un sensore

Bioreceptor

Biological sensing element

Bioreceptor

Biological sensing elementTransducer Signal

Analite

Interfaccia elettronica

Unità di memorizzazione

Unità di elaborazione

Perchè i biosensori?

Analisi degli alimenti – Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque– Analisi dei patogeni– Analisi diossine– Analisi di routine dell’acido flico, biotina,

vitamina B12 e acido pantotenico – Analisi di antibiotici

Cosa misura il biosensore?

L’attività dell’enzima:

I trasduttori

Trasduttori usati per la costruzione di biosensori:

Trasduttori

Elettrochimici

Ottici

Acustici

Termici

Amperometrici

Potenziometrici

Conduttimetrici

I generazione

II generazione

III generazione

Elettrodi a vetro

ISE

ISFET

Trasduttori ottici

Un biosensore a trasduttore ottico misura i cambio di assorbanza di uno strato di reagente biologico che interagisce con l’analita.

CI

IA t

0

log CI

IA t

0

log

Risonanza di superficie a plasmon

SPR

Trasduttori acustici

Sauebrey) di (eq.

mkf Sauebrey) di (eq.

mkf

Trasduttori potenziometrici

pHmetro:– Glucosio ossidasi

glucose + O2 gluconolactone + H2O2 gluconate + H+

– Lipasi lipide neutro + H2O glicerolo + acidi grassi + H+

Nernst) di (eq.

ln0ianF

RTEE

Nernst) di (eq.

ln0ianF

RTEE

Trasduttori potenziometrici

ISE al NH4+:

– L-amino ossidasi L-amino acido + O2 + H2O keto acido + NH4

+ + H2O2

– asparaginasi L-asparagine + H2O L-aspartate + NH4

+

Nernst) di (eq.

ln0ianF

RTEE

Nernst) di (eq.

ln0ianF

RTEE

Trasduttori potenziometrici

ISE al I-:– perossidasi

H2O2 + 2H+ + 2I- I2 + 2H2O

ISE al CN-:– glucosidasi

amigdalina + 2H2O 2glucose + benzaldeide + H+ + CN-

Nernst) di (eq.

ln0ianF

RTEE

Nernst) di (eq.

ln0ianF

RTEE

Trasduttori conduttimetrici

Il prodotto di una reazione enzimatica cambia la conducibilità della soluzione in prossimità degli elettrodi.

120.0

substrato prodotto

120.0

substrato prodotto

Lamina d’oro o di platino

Enzima

Trasduttori amperometrici

L’amperometria misura una corrente ad un potenziale applicato costante.

Cur

rent

Time

background

Add 10M

Add 10M

steady-state

steady-state

Plank)Nernst di (eq.x

CnFADi

Plank)Nernst di (eq.x

CnFADi

Amperometria

Corrente e potenziale

Su un metallo inerte, applico un potenziale anodico, o catodico, relativamente ad un elettrodo di riferimento.

Il metallo misura una corrente anodica o catodica, in base al numero delle specie in soluzione che si possono ossidare o ridurre.

Potenziale anodico e catodico

+++++Potenziale anodico:

La superficie è povera di elettroni.

Una specie chimica capace di donare elettroni verrà ossidata

Potenziale catodico:

La superficie è ricca di elettroni.

Una specie chimica capace di ricevere elettroni verrà ridotta

---------

e-e-

Biosensori amperometrici

Working

electrode

Substrato

red

H2O2Substrato

ox

O2

elettroni

Biosensori amperometrici

Si classificano in I, II e III generazione

Biosensori della I generazione

La prima classe di biosensori amperometrici riguarda la misura diretta del prodotto della reazione enzimatica:

– Perossido di idrogeno– NADH– Consumo del cofattore (ossigeno)

Working

electrode

Substrato

red

H2O2Substrato

ox

O2

elettroni

Working

electrode

Substrato

red

H2O2Substrato

ox

O2

elettroni

Biosensori della I generazione

Il primo biosensore fu ideato da Clark nel 1962. Esso si basava sulla misura dell’ossigeno consumato durante la reazione enzimatica di un ossidasi, tramite un elettrodo di platino polarizzato a -700 mV, seguendo la reazione:

OHeHO 22 244

Il range dinamico di questo dispositivo è circa tra 50 M e 1 mM.

Biosensori della I generazione

Un’alternativa al primo biosensore si basa:– sulla imobilizzazione dell’enzima direttamente sulla

superficie dell’elettrodo – sulla misura del perossido di idrogeno prodotto durante la

reazione enzimatica, tramite un elettrodo di platino polarizzato a +700 mV, seguendo la reazione:

eOHOH 22 222

Biosensori della I generazione

Il perossido di idrogeno può anche venire ridotto all’elettrodo di platino, secondo la seguente equazione:

OHeHOH 222 222

Biosensori della I generazione

Alternativamente, è possibile misurare la produzione di NADH da NAD+ quando si usano enzimi tipo deidrogenasi:

eHNADNADH 2

Il NADH è ossidato all’elettrodo, ma sono richiesti potenziali molto alti.

Biosensori II generazione

I biosensori si sono evoluti, sostituendo il cofattore naturale dell’enzima con una molecola capace di traghettare gli elettroni dal centro attivo dell’enzima alla superficie del trasduttore amperometrico.

Working

electrode

Substrato

red

Mediatore redSubstrato

ox

Mediatore ox

elettroni

Cos’è un mediatore?

I mediatori si possono classificare in:– Molecole organiche– Complessi organici di metalli di transizione– Molecole inorganiche– Polimeri conduttori

Idealmente, il mediatore dovrebbe essere piccolo da entrare facilmente nel sito attivo dell’enzima, essere riciclabile, scambiare elettroni velocemente con l’elettrodo.

Cos’è un mediatore?

Cos’è un mediatore?

Per un processo reversibile:2/12/12/351069.2 CvADnip

nEE pcpa /059.0

2'0 pcpa EE

E

1pc

pa

i

i

Biosensori II generazione

Ulteriori sviluppi nell’utilizzo dei biosensori della II generazione riguardano l’impiego di polimeri conduttori:– Polipirrolo– Polianilina– Politiofene

Questi polimeri hanno la capicità di formare film conduttivi, che possono essere impiegati per immobilizzare enzimi e mediatori di vario tipo.

Biosensori II generazione

Il premio nobel per la Chimica nel 2000 fu attribuito a Alan J. Heeger, Alan G MacDiarmid, e Hideki Shirakawa per il loro lavoro sui polimeri conduttori.

politiofenepolipirrolo

polianilina

Biosensori III generazione

Componenti bioattivi

COMP. BIOATTIVI Enzimi

Anticorpi

Cellule

Acidi Nucleici

microrganismi

tessuti

biocatalitici

biorecettori

Biotecnologia Applicata: Analisi dei Prodotti Vegetali

AA 2007 - 2008

Lezione 7

reactant 1 +

reactant 2

products

energy

Intermediate :

enzyme/reactant 1

+ reactant 2

no enzyme present

enzyme present

+ enzyme

+ enzyme

Course of reaction Replay Close window

Fattori che influenzano l’attività

Tecniche di immobilizzazione

Chimica Legame covalente

sull’elettrodo

su membrana

Fisica

assorbimento fisico

ritenzione

incorporazione

polimerizzazione

pasta di carbone

inchiostri

su gel

su membrane

polimeri conduttori