Interferenti EndocriniProgetto a cura dell’ Istituto B.Ramazzini

Centro di Ricerca sul Cancro Cesare Maltoni (CRCCM)

Il Nostro Stage

Nel luglio 2013 abbiamo effettuato lo stage all’istituto ramazzini, dove abbiamo osservato i procedimenti relativi alla biofase e all’istopatologia.

•La biofase si occupa di tutto ciò che riguarda la vita dell’animale, come la somministrazione di cibo e acqua, il controllo clinico, la marcatura, l’accoppiamento e, infine, la necropsia alla morte spontanea dell’animale.

•L’istopatologia si occupa della fase di studio a livello microscopico degli organi degli animali. Dopo la fissazione in alcool, i tessuti vengono «inclusi» in paraffina, in seguito vengono tagliate delle sezioni di 3 micron di spessore, colorate e lette al microscopio.

BiofaseSTABULAZIONE

•Alloggiamento in apposite gabbie di makrolon

•Mangime in pellets

•Temperatura(22°± 3°) e umidità costante(40-60 %)

•Ciclo luce-buio di 12 ore

•Controlli clinici e pesatura ogni 2 settimane

•Marcatura

Dopo la morte spontanea viene effettuata la necropsia dell’animale e gli organi vengono rifilati e conservati in alcool 70% o formalina.

IstopatologiaINCLUSIONE

Il processo di inclusione comporta un primo passaggio da alcool a paraffina che viene effettuato da una apposita macchina detta «processatore».

Gli organi vengono successivamente inclusi in paraffina liquida a formare dei blocchetti solidi che renderanno il tessuto conservato per sempre.

TAGLIOIl taglio consiste nella formazione di sezioni che permettono di poter leggere al microscopio gli organi dell’animale e individuare possibili patologie.

Gli organi nei blocchetti di paraffina vengono tagliati in lamine di 3 micron tramite «microtomo», posizionate successivamente su vetrini porta-oggetto e colorate con coloranti Ematossilina-Eosina che evidenziano il nucleo in viola e il citoplasma in rosa rispettivamente

Istopatologia

LETTURA

La lettura è la fase più complicata della fase istopatologica perché richiede esperienza nella conoscenza delle varie patologie nei differenti organiSi tratta di osservare al microscopio gli organi dell’animale e determinare in quali era presente eventualmente una patologia.L’importanza di questa fase è dovuta al fatto che per rilevare la presenza di tumori nell’animale bisogna studiare direttamente i tessuti e individuare eventuali ammassi di cellule anormali.I tumori e le lesioni pre-neoplastiche individuate vengono annotati per effettuare uno studio statistico sull’incidenza. I dati ottenuti vengono riportati in articoli scientifici in modo da condividerli con gli esterni e diffondere così l’informazione sulla pericolosità dei vari agenti studiati.

Sistema Endocrino

L'apparato endocrino è costituito da un insieme di ghiandole le quali secernono delle sostanze proteiche o lipidiche chiamate ormoni.

Il sistema endocrino gestisce il funzionamento dell'organismo in collaborazione con il sistema nervoso.

Gli ormoni sono sostanze chimiche che influenzano le attività metaboliche, la crescita e lo sviluppo dell’organismo.

Il mezzo attraverso il quale gli ormoni giungono alle cellule bersaglio è il sangue.

Gli ormoni vengono riconosciuti dalle cellule bersaglio tramite un meccanismo «chiave- serratura» legandosi a recettori specifici presenti sulla membrana cellulare.

Progetto interferenti endocrini su ghiandole mammarie di ratto

Sprague_dawley

Interferenti EndocriniGli interferenti endocrini sono agenti chimici che interferiscono con l’azione degli ormoni prodotti negli animali, compreso l’uomo.

Possono causare un accelerazione, una diminuzione o addirittura bloccare l’azione degli ormoni prodotti dall’organismo.

Gli interferenti endocrini interferiscono con la salute dell’uomo

L’esposizione agli interferenti endocrini nelle prime fasi della vita può aumentare i livelli di rischio e compromettere la salute fisica e mentale

Di particolare gravità è l’effetto dei composti che mimano gli estrogeni

L’esposizione prolungata a questi agenti chimici può portare a gravi problemi di sviluppo dell’organismo soprattutto se si entra in contatto con essi durante le fasi di sviluppo intenso, come la pubertà.

Questi interferenti li troviamo in prodotti di uso quotidiano e per questo l’esposizione ad essi è sempre più frequente.

Alcune famiglie di interferenti sono le seguenti:

» Phtalati, che si trovano in prodotti plastici come PVC;

» Idrocarburi policiclici, prodotti della combustione che si trovano nei fumi industriali o anche nel fumo della sigaretta;

» Perfluorati, che si possono trovare nei processi di produzione di prodotti tessili come additivo idrorepellente;

» Il roundup, utilizzato molto frequentemente in agricoltura come diserbante;

Effetti sull' organismo Gli interferenti endocrini possono avere molteplici effetti sull’organismo agendo sui diversi organi

di esso:

• Sul sistema riproduttore maschile, alterando i livelli degli ormoni sessuali, possono provocare una diminuzione del movimento degli spermatozoi, mentre in quello femminile possono bloccare l’ovulazione. Inoltre può provocare una femminilizzazione del maschio o viceversa;

• Predisposizione a malattie come diabete o obesità;

• aumenta il rischio di cancerogenesi di tumori associati a squilibri ormonali, come il carcinoma mammario e il cancro alla prostata;

• Tumore polmonare ai non fumatori;

• Alterano lo sviluppo neurologico, lo sviluppo neuro-comportamentale e l’attività tiroidea;

Durante lo stage all’ Istituto Ramazzini del Luglio 2013, era in atto una sperimentazione

in vivo per determinare i possibili effetti di interferenti endocrini sullo sviluppo delle

ghiandole mammarie nelle varie finestre di vita di ratti Sprague-Dawley femmine.

Vista l’importanza, questo studio avviene in collaborazione con Mount Sinai School of

Medicine di New York e l’Università di Chieti.

Questa sperimentazione è fondamentale per la salute pubblica perché noi tutti, anche

involontariamente, entriamo in contatto con questi interferenti quotidianamente,

semplicemente utilizzando ad esempio cosmetici, pesticidi o prodotti derivati plastica.

Il progetto dell’Istituto Ramazzini segue due fasi distinte:

Range Finding: determinare le quantità di agenti chimici da somministrare agli animali

affinchè siano sufficientemente alte per riscontrare una

metabolizzazione e trovare i metaboliti nelle urine e sufficientemente basse da non essere

tossiche per l’animale.

Full Scale: suddividere gli animali in diverse finestre di suscettibilità e verificare, attraverso

una riproduzione in vivo, se la somministrazione di queste sostanze ha provocato

danni sulle ghiandole mammarie degli animali (malformazioni, atrofia, aplasia).

Nome composto Categoria chimica Utilizzi commerciali

Diethylphtalate (DEP)CAS N.:84-66-2

Estere di ftalato(dietil estere dell'acido ftalico)

Solvente adatto per molte molecole organiche. Usato per legare cosmetici e

profumi. Altri usi industriali comprendono plastificanti, detersivi e

spray

Metilparaben (MEP)CAS N.:99-76-3

Paraben(estere metilico dell'acido p-idrossibenzoico)

Agente antimicotico, spesso usato in prodotti cosmetici e per la cura

personale. Utilizzato anche come conservante alimentare e ha il numero

E218

Triclosan (TRI)CAS N.:3380-34-5

policloro fenossi-fenolo Antibatterico presente in saponi, deodoranti, dentifrici, creme da barba,

colluttori

I tre agenti chimici conosciuti come interferenti endocrini che vengono studiati per verificare se hanno possibili effetti dannosi sulla gh. mammaria sono i seguenti:

Finestre di suscettibilità

Per effettuare uno studio più ampio, gli animali sono stati suddivisi in diverse fasi di vita, quali venivano somministrati gi interferenti in modi diversi:

• Prenatal: circa 1 giorno di vita, trattati tramite sangue materno durante la gravidanza;

• Neonatal: circa una settimana di vita, trattati tramite sangue materno durante la gravidanza e tramite allattamento;

• Pre-pubertal: circa 4 settimane di vita, trattati sia durante la gravidanza e l’allattamento che dopo lo svezzamento tramite gavaggio;

• Pubertal:circa 6 settimane di vita, trattati sia durante la gravidanza e l’allattamento che dopo lo svezzamento tramite gavaggio;

• Nulliparous: di circa 46 settimane di vita, femmine vergini, trattati sia durante la gravidanza e l’allattamento che dopo lo svezzamento tramite gavaggio;

• Parous:di circa 46 settimane, femmine che hanno svezzato, trattati sia durante la gravidanza e l’allattamento che dopo lo svezzamento tramite gavaggio;

Ghiandole mammarie

Le ghiandole mammarie sono formate da un sistema ramificato di dotti e alveoli secernenti terminali disposti in lobuli.

Ogni singola ghiandola ha un solo dotto lattifero in cui convergono tutti gli altri, e termina nel capezzolo.

In base all’età, l’istologia dei dotti e gli alveoli differisce per la formazione di strutture che poi saranno responsabili della secrezione lattea.

Mano a mano che il ratto si sviluppa, gli alveoli aumentano di numero e diventano più ramificati e si creano un maggior numero di dotti.

Rappresentazione schematica della ghiandola mammaria di ratto. A: grado di sviluppo ad 1 settimana di età; B: sviluppo a 4 settimane

(svezzamento); C: sviluppo a 6 settimane (pubertà)

Pre-Natal

• MEP100X

Neo-Natal

• OIL25X

Neo-Natal

• OIL200X

Pre-Pubertal

Si nota la formazione di TEB, cioè un ispessimento della parete del dotto.Questo fenomeno inizia intorno alla 4° settimana di vita, ed è un inizio di sviluppo ghiandolare.

Pubertal

Da notare la formazione di una struttura fibrosa che servira da sostegno durante

l’allattamento in modo particolare. Inoltre i TEB si sono ramificati ed espansi in

alveoli

• DEP100X

Pubertal

Struttura fibrosa

Alveoli

•DEP 200X

Nulliparous

• TRI 200X

Dotto lattiferoAlveoli

• TRI 400X

Parous

Giunti a questo stadio il ratto ha già allattato, infatti si nota che all’interno dei dotti si ha una

rimanenza di secreto. Si può notare che i dotto sono molto più espansi e che gli alveoli si sono

ingranditi.

• DEP100X

• MIX100X

Parous

Dams Weaning

Nelle altre finestre di suscettibilità non si erano

riscontrate differenze significative tra le ratte trattati e i

controlli.

In questo gruppo invece, cioè le femmine madri dei

gruppi Pre-Natal, Neo-Natal e Pre-Pubertal, si sono

manifestate con frequente incidenza differenze di

sviluppo delle ghiandole mammaria rispetto al controllo

(OIL).

Dams Weaning

• OIL100X

Si nota come gli alveoli e i dotti siano pieni di secreto e come siano molto vicini fra di loro. Inoltre le cellule adipose sono quasi assenti.

Dams Weaning

• MIX100X

Si nota come il topo trattato ha un maggiore numero di cellule adipose e come gli alveoli siano distanti fra loro. I dotti però contengono lo stesso del secreto.

Negli animali trattati con il Triclosan si nota ancora di più lo scarso sviluppo di alveoli,

e una grande presenza di cellule adipose fra di essi.

Dams Weaning

• TRI100X

Al termine di questo esperimento è emerso un dato di

notevole importanza.

Infatti le femmine del gruppo Dams Weaning hanno

riscontrato in molti casi uno scarso sviluppo dei dotti e

degli alveoli, con conseguente scarsa produzione di

secreto.

Data la grande diffusione nell’ambiente di sostanze

definite Eds si pone sempre più il problema degli effetti

che queste sostanze possano provocare sull’organismo.

Il progetto prosegue attraverso collaborazioni e servirà

per determinare la pericolosità di questi agenti chimici.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

Boresi DavideStracciari Giacomo