hakim biochimica.pdf

Le cellule

Caratteristiche degli organismi viventi

• Complessi e organizzati

• Capaci di estrarre/trasformare energia

• Capaci di rispondere a cambiamenti

ambientali

• Capaci di autoreplicarsi

• Sono compartimentati

• Seguono le leggi della Fisica e della

Chimica!

Sistemi biologici e biomolecole• Pochi elementi naturali, leggeri (fondamentalmente,

C, N, O, H)

• Sistemi lontani dall’equilibrio, spesso allo stato stazionario

• Reazioni chimiche catalizzate

• Macromolecole costituite di unità semplici (struttura gerarchica)

– Proteine

– Acidi nucleici

– Polisaccaridi

• Importanza delle strutture tridimensionali

• Chimica “acquosa”

Elementi nel corpo umano

PRINCIPALI CLASSI DI

BIOMOLECOLE

Termodinamica e funzioni di stato

• Funzioni di stato: dipendono solo dagli stati iniziale e finale del sistema

• Entalpia: quantità di energia che un sistema può scambiare con l’ambiente

∆∆∆∆H = ∆∆∆∆ U + P ∆∆∆∆ V

Nei sistemi biologici,

∆∆∆∆H ≅≅≅≅ q (calore a pressione costante)

Energia libera (di Gibbs)

• Funzione di stato che consente di valutare

se un processo è spontaneo

G = H – TS

H = entalpia

S = entropia

La variazione in energia liberadetermina la direzione di un

processo

∆∆∆∆G = Gprodotti - Greagenti

∆∆∆∆G = ∆∆∆∆ H - T ∆∆∆∆ S

∆G < 0 reazione esoergonica, spontanea

∆G > 0 reazione endoergonica; richiede energia dall’esterno

∆G = 0 reazione all’equilibrio

Entropia∆G = ∆H - T ∆∆∆∆ S

• L’entropia è una misura del grado di disordine di un sistema

• L’entropia aumenta quando il sistema diventa piùdisordinato e diminuisce quando il sistema è piùstrutturato

• Molte reazioni biologiche tendono ad aumentare l’ordine e a diminuire in entropia (∆∆∆∆S < 0)

• Reazioni esotermiche (∆∆∆∆H < 0) che aumentano in entropia (∆∆∆∆S > 0) avvengono spontaneamente (∆∆∆∆G< 0)

• Reazioni endotermiche (∆∆∆∆H > 0) possono avvenire spontaneamente se T ∆S > ∆H

Esempi di differenze di entropia

• BASSA ENTROPIA

• Acqua - ghiaccio

• Poesia

• Scrivania di un bancario

• ALTA ENTROPIA

• Acqua - vapore

• Serie casuale di lettere

• Scrivania di uno

scienziato

Da: Lehninger

Un processo esoergonico: la diffusione attraverso una

membrana

Effetto idrofobico

Molecole d’acqua ordinate

∆G e costante di equilibrio

La variazione di energia libera di una reazione dipende

dalle concentrazioni di reagenti e prodotti

∆G = ∆G°’ + RT ln [prodotti]/[reagenti]

dove: ∆G°’ = variazione di energia libera standard

All’equilibrio:

0 = ∆G°’ + RT ln [prodotti]/[reagenti]

da cui

∆∆∆∆G°’ = - RT ln K’eq

Costanti di equilibrio e variazioni di energia libera standard

K’eq

1000,0

∆∆∆∆G°’ (kJ/mole)

Variazioni di energia libera standard ∆∆∆∆G°’

• Pressione atmosferica; t = 25 °C

• Attività chimica (concentrazione) = 1

• In Biochimica, lo stato standard è a pH = 7

• All’acqua è attribuito comunque un valore

pari ad 1

I legami fosfoanidridici dell’ATP

Trasferimento di

un gruppo fosfato

Trasferimento di un

gruppo adenilico

Una reazione energeticamente sfavorita può procedere se accoppiata ad una

favorita• Molte reazioni biochimiche sono energeticamente sfavorite (∆G > 0) e non procedono spontaneamente

• Le cellule possono condurre tali reazioni accoppiandole ad una reazione (processo) con un ∆G maggiormente negativo

• Reazioni energeticamente sfavorite sono spesso accoppiate all’idrolisi dell’ATP che ha un ∆G º′ = -7.3 kcal/mol

• L’energia utilizzabile in una molecola di ATP è“contenuta” nei legami fosfoanidridici

Reazioni accoppiate

Importanza di intermedi fosforilati

Composti in genere stabili cineticamente

L’ATP è usato per alimentare numerosi processi

The ATP cycle

Luce (fotosintesi) o composti ad alta energia potenziale (respirazione)

Sintesi di macro-molecole (proteine, DNA…)

Sintesi di altri componenti cellulari)

Movimenti cellulari

Trasporti di molecole/ ioni contro gradiente

Generazione di potenziali elettrici

Calore

GLI α-AMMINOACIDI

� Sono caratterizzati da un

gruppo carbossilico e da un

gruppo amminico legato al

carbonio adiacente (α)

� Si differenziano per il

gruppo sostituente -R

Gli amminoacidi costituenti le proteine:

� Sono venti (standard), α-ammino-acidi, apparte-

nenti alla serie L

� Sono anfoteri

� Caratterizzati da un punto isoelettrico (pI) dovuto

ai gruppi ionizzabili

� Esistono numerosi altri amminoacidi con ruoli

diversi

�La sequenza degli amminoacidi (struttura

primaria) determina la struttura spaziale

�La struttura determina la funzione

Stereoisomeria degli amminoacidi

Carbonio

asimmetrico

Tutti gli amminoacidi standard, tranne la glicina, possiedono

almeno un carbonio asimmetrico

La convenzione secondo Fischer per la configurazione fa riferimento alla

gliceraldeide:

Importanza della stereoisomeria: solamente un enantiomero possiede

attività anti-infiammatoria

Proprietà acido-base

� Gli amminoacidi sono acidi poli-protici deboli

� pH basso: gruppo amminico e carbossilico protonati

� pH neutro: si dissocia il carbossile

� pH alto: si dissocia il gruppo ammonio

� A pH fisiologico (pH ~7.0) è stabile la forma zwitterionica: i gruppi amminici sono protonati, il carbossile è completamente dissociato.

– Gruppo carbossilico : pKa ~ 2

– Gruppo amminico α: pKa ~ 9

Proprietà acido-base� Punto isoelettrico (pI): valore di pH al quale

l’amminoacido ha carica netta nulla.

� Nel caso di un amminoacido con catena laterale neutra è

dato da:

)pKpK(2

)NH(a2COOH)(a1

−−+=

pKa1 pKa2

Amminoacidi con catene

laterali apolari

gruppi R non polari, alifatici

gruppi R aromatici

Amminoacidi con catene laterali polari

La prolina è un imminoacido(contiene un gruppo amminico secondario)

Amminoacidi carichi

gruppi R carichi positivamente (basici)

gruppi R carichi negativamente (acidi)

Alcune proprietà degli amminoacidi standard

Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli

La cisteina può formare ponti disolfuro (ossidazione)

Gli spettri UV di amminoacidi aromatici

Curva di titolazione della

glicina

)pKpK(2

)NH(a2COOH)(a1

−−+=

Curva di titolazione del glutammato

Curva di titolazione dell’istidina

Alcuni amminoacidi modificati (dopo la traduzione)

Importanti molecole derivate da amminoacidi

La selenocisteina (Sec), il ventunesimo amminoacido

� Analogo alla Cys, contiene Selenio al posto di Zolfo

� Deriva da una modificazione della Serina; èinserita come tale nelle proteine. E’ codificata in modo particolare

� Importante in numerosi enzimi ossido-riduttivi

� Negli Archaea esiste un 22° amminoacido, la pirrolisina (Pyl).

Il legame peptidico

Il legame peptidico si genera (formalmente) per eliminazione

di una molecola di acqua tra gruppo carbossilico ed amminico

Le proteine

� Sono polimeri lineari costituiti di

amminoacidi

� Contengono diversi gruppi funzionali

� Possono formare strutture complesse

� Possono essere rigide (strutturali) o

flessibili

Alcuni ruoli delle proteine� Enzimi (biocatalizzatori)

� Proteine strutturali - collagene

� Proteine regolatrici - ormoni (ad esempio: insulina, glucagone)

� Proteine di trasporto – emoglobina (O2)

� Proteine di trasporto di membrana

� Recettori

� Proteine contrattili - actina, miosina

� Proteine “di difesa” – anticorpi

� Proteine che decodificano l’informazione

Le proteine sono polimeri lineari costituiti da amminoacidi

� Le proteine sono polimeri lineari, non ramificati, degli amminoacidi

� Il legame peptidico o carboammidico si genera (formalmente) per eliminazione di una molecola di acqua tra gruppo carbossilico di un amminoacido ed amminico dell’amminoacido adiacente

� L’equilibrio sarebbe spostato verso l’idrolisi

� I legami peptidici sono cineticamente stabili

� Per convenzione il polimero viene “letto” partendo dall’ammino-acido N-terminale

Il legame peptidico� ha un parziale carattere di doppio legame: non ruota

liberamente

� Si trova quasi sempre nella configurazione trans (Cα

da lati opposti) a minore ingombro sterico

Il legame peptidico è un sistema planare

Sei atomi giacciono sullo stesso piano

Il legame peptidico

� A causa della distribuzione degli

elettroni il legame peptidico ha

specifiche proprietà elettriche:

– è dipolare.

+ 0.42

- 0.42

- 0.20

+ 0.20

Il grafico di Ramachandran

αααα elica

Foglietti ββββ

La struttura delle proteine può essere suddivisa in quattro livelli

� STRUTTURA PRIMARIA: sequenza degli amminoacidi uniti da legami peptidici. Legami covalenti

� STRUTTURA SECONDARIA: organizzazioni regolari e ricorrenti nello spazio dei residui amminoacidici adiacenti (come, ad es. α-elica e struttura β). Legami a idrogeno

� STRUTTURA TERZIARIA: ripiegamento della catena polipeptidica dovuto ad interazioni deboli. In tale ripiegamento sono presenti diversi tipi di struttura secondaria. Proteine globulari

� STRUTTURA QUATERNARIA: interazioni esistenti fra varie subunità, nel caso in cui le proteine siano costituite da più catene polipeptidiche.

Struttura primaria

� Struttura primaria di un peptide o di una proteina:

sequenza degli amminoacidi uniti da legami peptidici

descritta per convenzione a partire dall’AA ammino-

terminale (il primo) all’AA carbossi-terminale (l’ultimo).

+3HN-G-A-S-T-A-A-K-W-K-COO-

+3HN-Gly-Ala-Ser-Thr-Ala-Ala-Lys-Trp-Lys-COO-

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Livelli di organizzazione delle proteine

Alcuni tipi di interazioni deboli

Importanza delle forze deboli

Legami covalenti singoli: 300-400 kJ/mol

van der Waals: 0.4 - 4 kJ/mol

legami a idrogeno: 12-30 kJ/mol

legami ionici: 20 kJ/mol

interazioni idrofobiche : < 40 kJ/mol

Struttura secondaria� Organizzazione spaziale regolare e ricorrente

“locale” (a breve distanza)

� Caratterizzata da interazioni deboli, soprattutto legami a idrogeno

L’α-elica(L. Pauling, 1951)

Legami a

idrogeno

Premio Nobel per la

Chimica, 1954

L’α-elica

� È stabilizzata da legami a idrogeno intra-catena

� L’ossigeno di un C=O lega l’idrogeno di un NH di

un amminoacido 4 residui più avanti

� L’elica è destrogira

� Le catene laterali sporgono verso l’esterno dell’elica

� L’elica è un dipolo

L’α-elica è un dipolo

Che cosa destabilizza l’α-elica

� La prolina destabilizza l’elica: è un

anello piuttosto rigido e non può

formare ponti ad idrogeno

� Residui -R ingombranti

� Residui –R prossimi nello spazio e

dotati della stessa carica

Struttura ββββfoglietto pieghettato

Legami a idrogeno

tra catene

Gruppi –R che

sporgono sopra e

sotto il piano

Foglietti β paralleli ed anti-paralleli

Ripiegamento (turn) β� Ripiegamento a 180°

� Quattro amminoacidi: legame a idrogeno tra il 1° e il 4° amminoacido

� Spesso Pro, Gly

� Spesso alla superficie della proteina

Frequenza relativa di amminoacidi nella struttura secondaria

Quantità di α-elica e β-foglietto in alcune proteine

1738Carbossipeptidasi (307)

4514Chimotripsina (247)

3526Ribonucleasi (124)

1240Lisozima (129)

039Citocromo c (104)

078Mioglobina (153)

ββββ fogliettoαααα elicaProteina (residui)

Residui (%)

Proteine fibrose� Gran parte della catena polipeptidica è

organizzata parallelamente ad un singolo asse, con una sola struttura secondaria (nella cheratina, α-elica)

� Nella fibroina della seta la struttura prevalente è il foglietto β; “soffice” perché le interazioni tra foglietti sono deboli

� Le proteine fibrose:

– hanno alta resistenza meccanica e scarsa reattività chimica

– sono insolubili

– hanno un ruolo strutturale

Le α-cheratine dei mammiferi� Presenti in peli, unghie, corna…

� “Avvolgimenti avvolti”

� Ricche in Cys (che possono formare ponti

conferendo rigidità)

� In uccelli e rettili si trovano β-cheratine

18 % Cys

Ponte disolfuro

Tratto da: A.L. Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli

Ossidazione e riduzione della cisteina

Due catene avvolte insieme

fibrille

Struttura delle α-cheratine

La Biochimica dal parrucchiere: la “permanente”

αααα - cheratina dei capelli

Il collagene: una tripla elica� Principale componente dei tessuti connettivi (ossa,

tendini, denti, cartilagini)

� Tre catene avvolte tra loro (tropocollagene): elica

più estesa dell’α-elica

� Composizione amminoacidica particolare

– Un residuo ogni tre è Gly (Gly-X-Y)

– Ricco in prolina

– Amminoacidi insoliti (idrossilisina, idrossiprolina:

formano ponti a idrogeno) “post-traduzionali”;

l’idrossilazione dipende dall’acido ascorbico

� Sono presenti anche legami covalenti inter-catena

Dr. Jekyll and Mr. Hyde:le malattie prioniche dipendono dalla

strutturaIl prione “buono” (PrPc)…. e quello “cattivo” (PrPsc)

resistente a tutto e “contagioso”

La conversione PrPc →→→→

PrPsc è autocatalitica

S. Prusiner, Premio Nobel per la

Medicina 1997

Esempi di motivi(struttura supersecondaria)

barile ββββmotivo αααα- αααα

Motivi: raggruppamenti di elementi strutturali secondari

Struttura terziaria� Ripiegamenti nello spazio dei diversi segmenti

� Eliche e “nastri“ si impaccano assieme

� Le proteine si ripiegano per “cercare” la struttura più stabile

� Nelle proteine globulari sono importanti gli effetti idrofobici

� Strutture in genere flessibili

� Stabilizzate da legami deboli

� Talvolta, ponti disolfuro

Struttura di proteine globulari

Alcune proteine sono “modulari”

� A volte un modulo può essere ripetuto nella stessa proteina

� L’uso di moduli ha una base genetica

� Alcune proteine sono composte di due o piùmoduli (o dominii)

� Dominii: unità strutturalmente indipendenti che possiedono caratteristiche di piccole proteine globulari

� Ogni dominio si può ritrovare in altre proteine

Esempi di dominii:l’enzima gliceraldeide 3-fosfato

deidrogenasiDominio per il legame con il substrato

Dominio per il legame con il coenzima NAD

Un coenzima che partecipa ad ossidoriduzioni: il NAD

Nicotinammide Adenina Dinucleotide

Struttura quaternaria:associazione di più subunità

� Costituite in modo modulare

� Minori informazioni geniche (minori errori)

� Possibilità di più siti

� Possibilità di regolazione (interazione tra siti)

� Proteine diverse possono condividere le stesse subunità

� Perdita di entropia dovuta alla associazione: sfavorevole

� Guadagno di entropia dovuta al “seppellimento” di residui idrofobici: molto favorevole

� Oltre alla struttura quaternaria, esistono complessi multi-enzimatici

La struttura quaternaria della emoglobina

Proteine complesse o coniugate

Classe� Lipoproteine

� Glicoproteine

� Emoproteine

� Flavoproteine

� Metalloproteine– Ferro– Calcio– Zinco– Manganese– Rame

Gruppo prostetico - Esempio� Lipidi β1-lipoproteina

� Glucidi Proteine di membrana

� Eme (ferroporfirina) Emoglobina

� FAD succinato deidrogenasi

– Transferrina– Calmodulina– Superossido dismutasi– Catalasi– Ceruloplasmina; emocianina

Il gruppo prostetico può essere legato alla proteina in diversi modi

Denaturazione delle proteine� Perdita della conformazione spaziale nativa

� Le proteine sono”marginalmente” stabili; basta

la rottura di pochi legami deboli per innescare

la denaturazione

� Molte proteine si denaturano a 50-60°C; alcune

sono stabili a temperature più alte

� La denaturazione oltre che dalla temperatura

può essere provocata da agenti chimici

(caotropici)

� In alcuni casi proteine possono “rinaturarsi”

Proteine degli “estremofili”

� Negli “estremofili” (Archaea) ci sono proteine

particolarmente stabili

� Tali proteine sono utili in campi applicativi

� Le loro caratteristiche sono legate alla struttura

(ripiegamento)

“Folding” e denaturazione delle proteine: l’esperimento di

Anfinsen(Nobel per la Chimica

Denaturazione e “refolding”

della RNAasi (124 aa)

Ripiegamento delle proteine

� In E. Coli, una proteina attiva di 100 amminoacidi è prodotta in circa 5 secondi a 37 °C

� Un processo casuale per tentativi richiederebbe venti miliardi di anni (paradosso di Levinthal)

� Probabilmente si formano nuclei di strutture secondarie; il ripiegamento avviene in modo gerarchico

� Ci può essere un “collasso idrofobico”

� Alcune proteine si ripiegano spontaneamente

Ripiegamento delle proteine

• Alcune proteine (chaperone) “guidano”l’avvolgimento (ad esempio, heat shock proteins -hsp)

Chaperon: persona di età matura che un tempo accompagnava una

ragazza di buona famiglia per salvaguardarne la rispettabilità

• Le hsp (come hsp70) ostacolano il ripiegamento

“sbagliato” (“misfolding”) o la denaturazione; sono

proteine molto conservate

Il corretto ripiegamento è “aiutato” da specifiche proteine (hsp e chaperonine);

il processo richiede energia

Enzimi� Gli enzimi sono catalizzatori di natura proteica (esistono ancora RNA catalitici o ribozimi)

� influenzano la velocità, ma non l’equilibrio� non si consumano: si trovano immutati alla fine della reazione

� consentono alle reazioni di procedere a velocitàcompatibili con la vita, in condizioni blande

� presenti in piccole quantità (importanza della concentrazione)

� formano complessi reversibili con il substrato� sono specifici

Enzimi� Alcuni enzimi richiedono cofattori (coenzimi)� Ogni enzima mostra condizioni ottimali (pH, T..)� In ogni cellula 2000-3000 enzimi diversi� Alcuni enzimi esistono in forme molecolari diverse (isoenzimi)

� Possono essere “ingannati” da inibitori (la inibizione è alla base dell’azione di molti farmaci)

� Spesso sono coinvolti in vie metaboliche a piùpassaggi

� Talvolta soggetti a regolazione

Gli enzimi sono catalizzatori di natura proteica: accelerano le reazioni

biologiche di diversi ordini di grandezzaIncrementi di velocità prodotti da enzimi

SpecificitàGli enzimi:1. catalizzano specifiche reazioni2. Possono riconoscere selettivamente i

propri substrati (specificità geometrica)3. Possono riconoscere la stereoisomeria

� La specificità è controllata dalla struttura

Classificazione degli enzimi

La classificazione contiene 4 numeri: ad es., la Lattato Deidrogenasi èLattato:NAD ossidoreduttasi EC 1.1.1.27

Il sito attivo� È una entità spaziale costituita da gruppi anche lontani nella sequenza amminoacidica

� Occupa una parte relativamente piccola della molecola enzimatica

� È una cavità o fenditura (spesso inaccessibile all’acqua)

� I substrati si legano di solito con interazioni deboli

� La specificità dipende dagli atomi/gruppi nel sito attivo

Cofattori e Coenzimi� “Cofattori” che partecipano a reazioni enzimatiche (ad esempio, nelle ossido-riduzioni)

� Possono essere legati all’enzima o fungere da co-substrati (co-enzimi)

� Alcuni derivano da vitamine idrosolubili

Vitamina PP(pellagra-preventing)

Un coenzima che partecipa ad ossidoriduzioni: il NAD

Le reazioni enzimatiche:

� Sono spesso in cascata (vie metaboliche)

� Possono essere controllate

PUNTO DI

CONTROLLO

Velocità di reazione ed attivitàenzimatica

� Velocità di reazione: quantità di substrato

trasformato nel tempo

v = - d [S] / dT = d [P] / dT

� Attività enzimatica: è espressa in base alla

velocità della reazione promossa dall’enzima:

� katal (SI): quantità di enzima che converte

1 mol substrato in 1 sec

� Unità internaz. (IU) quantità di enzima che

converte 1 µ mol substrato in 1 min

Velocità di reazione ed equilibrio

� L’equilibrio della reazione dipende da ∆G

� La velocità di reazione dipende dalla barriera energetica ∆G ≠

� Ci sono reazioni spontanee (∆G < 0) e sfavorite dal punto di vista cinetico

Secondo l’equazione di Arrhenius:

k = A e - ∆G*/RT

dove: k = costante di velocità

∆G* = energia di attivazione

T = temperatura assoluta

Il catalizzatore (enzima) abbassa la energia di attivazione

Come funzionano gli enzimiIl modello chiave-serratura (Fischer, 1894)

Sitoattivo

Emil Fischer, 1894

Il complesso ES non può essere troppo stabile

da: Garrett & Grisham

Il complesso ES non può essere troppo stabile

Come funzionano gli enzimiIl modello dell’adattamento indotto

(“induced-fit” – Koshland 1958)

Sitoattivo

Meccanismi della catalisi

� Catalisi acido-base

� Catalisi covalente

� Metalloenzimi

� Prossimità ed orientamento

Prossimità e orientamento

substrati

enzima

Stato di transizione

prodotto

Catalisi acido-base

Effetto del pH: la papaina

Fosforil-enzima

Acil-enzima

Glucosil-enzima

Catalisi covalente

Un centro nucleofilo sull’enzima attacca un gruppo elettrofilo del substrato

Catalisi favorita da ioni metallici� Metalloenzimi (un terzo

degli enzimi):

– contengono metalli come

cofattori

– enzimi attivati da metalli

� I metalli possono:

– legarsi al substrato per

orientarlo

– partecipare a reazioni redox

– stabilizzare cariche negative

– rendere molecole d’acqua

più acide (Zn2+ e anidrasi

carbonica)

anidrasi carbonica

Meccanismi d’azione: le proteasi a serina

� Tra di esse chimotripsina, tripsina, elastasi: sequenza, struttura e dimensioni (PM = 25.000) simili (evolute da un unico progenitore)

� Stessa specificità di reazione, diversa specificità di substrato

� Partecipano diversi residui amminoacidici (la triade catalitica Ser, His, Asp)

� La serina forma intermedi covalenti (acil-enzima)

� L’istidina agisce come catalizzatore acido-base

� L’aspartato stabilizza e orienta l’istidina

� Meccanismo comune ad altri enzimi (acetilcolinesterasi); evoluzione convergente

Sito di riconoscimento per il substrato

Lys; Arg

Aa. aromatici

La triade catalitica triade catalitica Ser, His, Asp

Fluorofosfati organici legano una serina molto reattiva

L’istidina rende l’ossigeno della serina

più nucleofilo

Asp102

Ser195

Gly193

Meccanismi di azione: la prima reazione della chimotripsina

Acil-enzima

Da: Lehninger

triade catalitica

complesso

tetraedrico

La scissione del

complesso

tetraedrico

libera il lato

amminico della

proteina da

idrolizzare

Da: Lehninger

Stabilizzazione dello stato di transizione:la cavità ossianionica

Lo stato di transizione tetraedrico è stabilizzato da due legami a idrogeno

Da: Lehninger

L’esistenza dell’acil-enzima

fase esplosiva

(“burst”)

La cinetica enzimatica:� Studia la velocità delle reazioni enzimatiche

� Può fornire informazioni sul meccanismo di azionedi un enzima

� Fornisce informazioni sul ruolo di un enzima in condizioni cellulari e sulle risposte a variazioni di concentrazioni di metaboliti

� Fornisce informazioni su come un enzima è regolato

E’ utile:

� nella caratterizzazione di enzimi ad impiego industriale

� nel dosaggio di attività enzimatiche quali indici diagnostici

� nel discriminare diverse forme enzimatiche sia fisiologiche (isoenzimi) sia anomale

Velocità di reazione ed attivitàenzimatica

� Velocità di reazione: quantità di substrato

trasformato nel tempo

v = - d [S] / dT = d [P] / dT

� Attività enzimatica: è espressa in base alla

velocità della reazione promossa dall’enzima:

� katal (SI): quantità di enzima che converte

1 mol substrato in 1 sec

� Unità internaz. (IU) quantità di enzima che

converte 1 µ mol substrato in 1 min

Velocità iniziale� La velocità dipende dal substrato, ma [S]

cambia nel tempo (si consuma)

� Per semplicità, la cinetica viene studiata in condizioni iniziali (tempo = 0)

� In queste condizioni,

� [S] >> [E]

� [P] ≈ 0 (la reazione inversa da P a S ètrascurabile)

Cinetica enzimatica

E + S ES

L’enzima si combina con S formando il complesso ES in una

tappa veloce e reversibile.

ES E + P

Nella seconda tappa, spesso più lenta, il complesso ES si

decompone per dare il prodotto più l’enzima libero.

La velocità della reazione dipende dalla concentrazione di ES (I

ordine):

v0 = k3 [ES]

Cinetica enzimatica

Michaelis e

Menten

Cinetica enzimatica:assunzione dell’equilibrio

� Il complesso ES è in rapido equilibrio con

l’enzima libero E

se k3 << k2 Ks = k2/ k1

assunzione dello stato stazionario:

� d [ES]/dt = 0

Cinetica di Michaelis-Menten

Reazioni catalizzate da enzimi

Un grafico di velocità iniziale contro [S] mostra tre zone:

Km ha le dimensioni di una concentrazione

Parametri cinetici

� Km

� kcat costante catalitica (numero di turn-over)

� Vmax (dipende da [E0])

� kcat/Km (costante di specificità o efficienza

catalitica)

� Inibizione (Ki)

Significato della KM� È una costante di dissociazione apparente:

misura il grado in cui l’enzima è legato al substrato

� Dipende dalle costanti cinetiche:

KM = (k2 + k3)/ k1

� Se ha valori bassi, l’enzima si satura con poco

substrato (affinità elevata)

� Corrisponde alla concentrazione di S per la quale:

v0 = VM/2

� È caratteristica di un enzima per un certo substrato

Significato della KM

Spesso la KM ha valori

simili alle concentrazioni

cellulari fisiologiche dei

substrati (in rosa)

Numero di turn-over o costante catalitica (kcat)

VM = kcat [E0]

� Massimo numero di molecole di substrato

convertite nella unità di tempo da una

molecola (sito) di enzima

� È correlata alla velocità di decomposizione

del complesso ES

Grafico degli inversi

Consente di linearizzare i dati

Significato di kcat/Km (costante di efficienza o di specificità)

� Dà una idea della efficienza relativa con cui

vengono trasformati substrati diversi (specificità)

� Dà una idea dell’efficienza catalitica dell’enzima

� Enzimi “perfettamente” evoluti hanno costanti

cinetiche che si approssimano alla diffusione

4. 1082,5 . 10-21. 107H2O2Catalasi

8,3. 1070,0121. 106CO2Anidrasi carbonica

1,6. 1089. 10-51,4. 104AcetilcolinaAcetilcolin-esterasi

(s-1M-1)

Km (M)kcat

(s-1)SubstratoEnzima

1 . 1082. 10-52. 103Benzilpenicil-lina

β-lattamasi

1,6. 1085. 10-6800FumaratoFumarasi

Enzimi per cui kcat

/Km è vicino alla velocità di associazione controllata per diffusione

Effetto della temperatura

denaturazione

Tratto da: Champe, Harvey, Ferrier “Le basi della Biochimica”, Zanichelli

Relazione tra temperatura e velocità (Arrhenius)

ln v = cost. - Eatt/RT

Inibizione enzimatica

� Reversibile

– competitiva

– non competitiva e mista

– (acompetitiva)

� Irreversibile (inattivazione)

Inibizione competitiva

L’inibitore competitivo riduce la concentrazione di enzima libero disponibile per legare il substrato

Inibizione competitiva

Il grado di inibizione dipende da [I] e da KI (affinità dell’inibitore)

E’ possibile ricavare KI

Inibizione non competitiva

(KI = KI’)

Inibizione non competitiva

Inibizione mista

(KI ≠≠≠≠ KI’)

Inibitori irreversibili� Si legano all’enzima con legami stabili (covalenti)

� Non possono essere rimossi con mezzi semplici

� Cinetica analoga all’inibizione non competitiva

� Sono utilizzati

– nello studio dei siti catalitici

– come farmaci (anti-metaboliti)

– come anti-parassitari

Un reattivo per le

cisteine

Inibitori a serina (acetilcolinesterasi)

DIFP, esteri fosforici (Parathion), gas nervini

Inibitori come farmaci: i sulfamidici

Un inibitore competitivo del metabolismo dei folati (diidrofolato reduttasi)

La parete batterica e il peptidoglicano

� Vasto polimero di

glucidi e piccoli peptidi

tenuti assieme da

legami crociati

� Struttura rigida

resistente alla lisi

osmotica

Azione della penicillina

Inibisce la formazione di legami crociati nel peptidoglicano della parete batterica

Non esiste analoga reazione nel metabolismo animale

Inibitori come farmaci:le “statine”

Abbassano i livelli di

colesterolo inibendo l’HMG-

CoA reduttasi, enzima-

chiave nella sintesi endogena

del colesterolo

Inibitori come farmaci: inibitori delle HIV proteasi

� Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine

� Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro)

� occorrono inibitori ad alta specificità

Inibitori come farmaci:gli inibitori suicidi

� Di norma poco reattivi

� vengono riconosciuti dal sito catalitico

� reagiscono covalentemente col sito catalitico,

inattivandolo

� Ottimi candidati come farmaci per i minimi

effetti collaterali

Regolazione enzimatica

♦ Quantità di enzima (sintesi /degradazione)

♦ Cofattori

♦ Modificazioni allosteriche

− cooperatività (effetti omotropici)

− effettori (effetti eterotropici)

♦ Modificazioni covalenti

− reversibili: fosforilazione/defosforilazione

− irreversibili: attivazioni proteolitiche

Possono coesistere più meccanismi di regolazione

� ha cinetica sigmoide

� è quasi sempre polimerico

� mostra cooperatività

� Esiste in due forme, T ed R, a diversa affinità

(T a bassa affinità)

� Può essere descritto con gli stessi modelli

usati per l’emoglobina

Un enzima regolato (allosterico):

T ⇔⇔⇔⇔ R

Cinetica di un enzima regolato

Un caso di cooperativitàestrema

Concentrazione critica di substrato

Effettori allosterici

Inibizione retroattiva (a feed-back)

La reazione catalizzata dalla aspartato transcarbamilasi (ATCasi)

una pirimidina

L’aspartato carbamiltransferasi

Modificazioni covalenti

CoagulazioneTrombinaBicarbonatoγ-carbossilazione

TrascrizioneRNA

polimerasi

NADADP-

ribosilazione

Impaccamento

IstoniAcetil CoAAcetilazione

Metabolismo

glucosio;

segnalazione

Glicogeno

fosforilasi

ATPFosforilazione

FunzioneEsempioDonatoreModificazione

Regolazione covalente:fosforilazione/defosforilazione

(Ser, Thr; Tyr)

Regolazione covalente:fosforilazione/defosforilazione

� La regolazione per fosforilazione è un processo

comune

� 30-50 % delle proteine negli eucarioti possono

essere fosforilate

� Nell’uomo esistono più di 500 chinasi

� Esistono numerose chinasi che riconoscono

sequenze consenso di amminoacidi

� Possono esserci fosforilazioni multiple

Amplificazione in cascata

Quando enzimi attivano altri enzimi, il numero di molecole influenzate in una cascata aumenta geometricamente

Numerose chinasi sono coinvolte nella trasduzione di

segnali

Attivazioni proteolitiche:

gli enzimi digestivi

zimogeni

Vengono prodotti anche inibitori delle proteasi

Attivazioni proteolitiche:la cascata della coagulazione

Trasporto dell’ossigeno�Bassa solubilità di O2 in soluzioni acquose come il

sangue (1 x 10-4 M)

� In singole cellule o piccoli organismi è sufficiente la diffusione

�Esistono numerose proteine che legano ossigeno

– Emoglobina (ferro)

� vertebrati

– Emocianine (rame)

� molluschi

– Clorocruorine (ferro)

� Anellidi

ββββ 2

Mioglobina ed EmoglobinaProteine globulari complesse (contengono un

gruppo prostetico)

Emoglobina

Mioglobina

αααα 1αααα 2

ββββ 2 ββββ 1

Max Perutz, Premio Nobel per la Chimica 1962

Il gruppo prostetico è detto eme� È costituito da ferroprotoporfirina IX e Fe (II)

� Nell’emoglobina funzionale il Ferro rimane Fe2+ e non si ossida

� Esiste una emoglobina non funzionale contenente Fe3+ (metaemoglobina)

gruppi

propionici

pirrolo

globina

Nell’eme il Ferro (II) può avere sei legami di coordinazione:

� Quattro con gli N degli anelli

pirrolici

� Uno con una ISTIDINA

(prossimale) della globina

� Uno disponibile per l’ossigeno

� Il ferro deve essere “protetto”dalla ossidazione

sito per l’ossigeno

Vista di lato

Residuo di His

prossimale

Piano dell’anello

porfirinico

proteina

Istidina prossimale e distale

Ruolo dell’istidina distale

monossido di carbonio

Localizzazione dell’eme

His prossimale

His distale

tasca idrofobica

La ferro-protoporfirina è responsabile del colore del sangue

Mioglobina ed Emoglobina

� La struttura delle due proteine è diversa:

– Mioglobina: monomero con un gruppo prostetico (eme) che

complessa uno ione Fe2+.

– Emoglobina: tetramero (nei mammiferi) fatto di subunità (α2β2)

simili alla mioglobina; ognuna contiene un gruppo prostetico (eme)

che complessa uno ione Fe2+.

� Le funzioni biologiche delle due proteine sono diverse:

– Mioglobina: lega con lata affinità l’O2 e lo rende disponibile

SOLO quando la pO2 è molto bassa (muscolo, cetacei in

immersione).

– Emoglobina: lega l’O2 quando la pO2 è alta (polmoni, branchie) e

lo rilascia quando la pO2 è più bassa (tessuti, cellule).

La Mioglobina:

� È una proteina monomerica globulare compatta

� Contiene otto segmenti (A, B, C...) ad α-elica

(circa 75%)

� Possiede una cavità idrofobica che contiene

l’eme

� 153 amminoacidi

� PM ≈ 17.000

Il legame con l’ossigeno

� Nella mioglobina:

� Si definisce la saturazione frazionale (ΥO2 ) la

frazione di siti che hanno ossigeno legato:

Mb + O2 MbO2

KD =[Mb] [O2]

[MbO2]

γO2 =[Mb] + [O2]

[MbO2]γO2 =

KD + [O2]

La MIOGLOBINA mostra una caratteristica

curva di saturazione iperbolica

Y = [O2] /(K D + [O2]) = pO2 /(p50 + pO2)

Ruolo della mioglobina

� Mb ha un’alta affinità per

l’ossigeno: p50 bassa (2.8 Torr)

� Riesce ad “estrarre” l’ossigeno

dai capillari

� Quando le cellule sono

metabolicamente attive, Mb

rilascia l’ossigeno ai muscoli

L’emoglobina:� È costituita da 4 subunità (tetramero α2β2)

� è una proteina regolata (allosterica)

� mostra una curva di saturazione sigmoide

(cooperatività positiva)

Confronto tra Mb e Hb

L’emoglobina: una proteina regolata

� Effetti omotropici (dovuti al legando):

– cooperatività positiva

� Effetti eterotropici (dovuti ad altre molecole,

che si legano in un sito diverso da quello

attivo)

– allosterismo

Come si spiega la regolazione ?

� L’emoglobina esiste in due conformazioni (Perutz):

- Conformazione T (tesa), a bassa affinità per l’O2 (forma

deossigenata)

- Conformazione R (rilassata), ad elevata affinità per l’O2

T ⇔⇔⇔⇔ R

� Il legame della prima molecola di O2 causa la rottura di

alcune interazioni tra le subunità, rendendo più facile il

legame con le successive molecole di O2: cooperatività

positiva. Il cambiamento di affinità è dovuto ad una

modificazione conformazionale.

� Nella emoglobina, la forma T è stabilizzata da ponti salini

Effetto del legame con O2

Cooperatività positiva

STATO T

STATO R

Modello concertato (MWC)

� La proteina è un oligomero

� Esiste in due stati conformazionali, T ed R in equilibrio

� La forma non legata è T, a bassa affinità

� Tutti i siti di legame sono equivalenti

Stato T Stato R

L’emoglobina è finemente modulata: effetto del pH e della CO2

� In acqua, la CO2 libera H+ (reazione favorita dalla

anidrasi carbonica)

CO2 + H2O ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ H+ + HCO3-

gli ioni idrogeno stabilizzano la forma deossi:

H+Hb + O2 ⇔⇔⇔⇔ HbO2 + H+

L’emoglobina è finemente modulata: effetto del pH (effetto Bohr)

A pH più bassi la

curva di saturazione si

sposta a destra:

minore affinità

L’emoglobina è finemente modulata: effetto della CO2

� La CO2 si lega a gruppi amminici terminali con

formazione di carbammati:

R-NH2 + CO2 ⇔⇔⇔⇔ R-NH-COO- + H+

� Anche questa reazione stabilizza la forma T

(deossi);

� inoltre consente il trasporto della anidride carbonica

(15-20%), che viene rilasciata quando in presenza di

alte concentrazioni di O2 la forma ossi prevale

Il sistema tamponante del sangue

� Il principale sistema tampone è il bicarbonato:

� La reazione è catalizzata dall’enzima anidrasi carbonica

CO2 + H2O ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ H+ + HCO3-

da: Berg et al. Biochimica 6E - Zanichelli

L’emoglobina è finemente modulata: ruolo del BPG

BPG stabilizza la forma deossi legandosi ad

una cavità con gruppi positivi

Concentrazione alta nel sangue

Ruolo del BPG

Emoglobina fetale Hb F

Emoglobina fetale: BPG si lega

debolmente

His 143 assente in HbF

Varianti dell’emoglobina

� Ci sono almeno 800 varianti della emoglobina:

circa 95% riguardano un solo amminoacido

� Il 5 % della popolazione mondiale ha una

emoglobina diversa da quella “normale”

� Numerose mutazioni sono “silenti” (non

“patologiche”) - mutazioni conservative

� Consentono di studiare relazioni

struttura/attività

Anemia falciforme ed HbS� In Hb S, una Val sostituisce Glu in una posizione

superficiale;

� Val può dare legami idrofobici con un’altra Hb, particolarmente nella forma deossi;

� Le molecole Hb si aggregano in fasci e possono precipitare (eritrociti falciformi)

� Distribuzione geografica caratteristica

In Hb S, una Valina sostituisce un Acido glutammico

Hb S è meno acida di HbA

Distribuzione geografica

da: Berg et al. Biochimica 6E - Zanichelli

Il “tratto” falciforme (eterozigoti) conferisce protezione dalla malaria.

Nella talassemia sono coinvolte intere catene.

Lipidi� Composti eterogenei, idrofobici (poco solubili

in acqua, solubili in solventi apolari)

� Funzioni principali:

– riserve energetiche (grassi e olii)

– costituenti delle membrane

– in alcuni casi, “messaggeri” (ad esempio, ormoni)

– agenti emulsionanti

Acidi grassi

� Acidi carbossilici a lunga catena, spesso a numero pari di carbonii (i più comuni hanno 12-24 carbonii)

� Possono essere saturi o insaturi:– gli insaturi sono di solito cis

– le insaturazioni spesso cominciano dal C-9 (∆9)

– le insaturazioni sono ogni tre carbonii (non sono coniugate)

� I punti di fusione:– aumentano con la lunghezza

– diminuiscono con il grado di insaturazione

� La “fluidità” aumenta con il grado di insaturazione

Alcuni acidi grassi naturali

Acidi grassi saturi e insaturi

Acido stearico 18:0 Acido oleico 18:1 (∆9)

“Impaccamento” degli acidi grassi

Triacilgliceroli (trigliceridi)� Esteri del glicerolo con acidi grassi� Riserva energetica depositata in forma anidra� Possono produrre acqua metabolica� Sono isolanti termici

glicerolo

� Esteri di acidi grassi a lunga catena con

alcoli a lunga catena

� Funzioni energetiche e protettive

� Di largo impiego nell’industria farmaceutica

e cosmetica

Classi principali di lipidi

Lipidi di deposito (neutri)

Lipidi di membrana (polari)

Triacilgliceroli

fosfolipidi glicolipidi

glicerofosfolipidi sfingolipidi sfingolipidi

Glicerofosfolipidi� Lipidi polari (anfipatici)

� Il glicerolo è esterificato:

– con due acidi grassi (code non polari)

– con un gruppo fosfato (testa polare)

� Il gruppo fosfato a sua volta può essere

esterificato con un altro alcool

Glicerofosfolipidi

Glicerofosfolipidi e fosfolipasi� I fosfolipidi possono essere “tagliati”

da fosfolipasi specifiche

� La fosfolipasi C libera diacilglicerolo,

una molecola segnale

SfingolipidiDerivano dalla sfingosina, un amminoalcool insaturo a 18 carbonii: i

C-1, 2, 3 “somigliano” al glicerolo

Un esempio: la sfingomielina:

Ossidrile in posizione 1

esterificato con fosforilcolina

Legame ammidico con un

acido grasso (cerammidi)

Sfingolipidi� Cerammide: unità comune

– Sfingomieline (testa polare di fosfocolina o

fosfoetanolammina)

– Glicosfingolipidi

� Cerebrosidi: singola unità saccaridica

� Gangliosidi: teste polari con oligosaccaridi complessi

(abbondanti sulla superficie esterna delle cellule)

Gli zuccheri di glicosfingolipidi sono i determinanti dei

gruppi sanguigni umani

Sfingolipidi

Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli

� Quattro anelli condensati (ciclopentano-peridrofenantrene); nucleo planare e rigido

� Precursore di ormoni steroidi, sali biliari, vitamina D…

Steroidi e colesterolo

Testa polare

I sali biliari emulsionano i lipidi

Fosfolipidi in acqua

Ad esempio,

acidi grassi

lisofosfolipidi

Membrane� Strutture laminari che delimitano diversi compar-

timenti cellulari

� Costituite da lipidi anfipatici e proteine (conten-gono anche carboidrati)

� Proteine specifiche svolgono ruoli funzionali

� Semi-permeabili

� Asimmetriche

� Fluide

� Resistenti e flessibili: si auto-assemblano e si sigillano

Schema di una membrana: il “mosaico fluido”

esterno

interno

proteina periferica

Mobilità dei lipidi e fluidità

� Movimento delle catene acilichee diffusione laterale

� La fluidità dipende dalla temperatura

� La fluidità dipende dalla composizione (presenza di insaturi, lunghezza delle catene)

� Il colesterolo modula la fluidità

� Il movimento trasversale (“flip-flop”) è lento; richiede enzimi (flippasi e floppasi) e spesso ATP

Temperatura di transizione

(stato paracristallino ⇒ fluido)

Composizione in acidi grassi di cellule di E. coli coltivate a temperature diverse

Percentuale rispetto agli acidi

grassi totali

10 °C 20 °C 30 °C 40 °C

Acido miristico (14:0) 4 4 4 8

Acido palmitico (16:0) 18 25 29 48

Acido palmitoleico (16:1) 26 24 23 9

Acido oleico (18:1) 38 34 30 12

Rapporto insaturi/saturi 2.9 2.0 1.6 0.38

Movimento “flip-flop”

� Le flippasi possono

richiedere energia

� In genere, determinano asimmetria nella membrana

Composizione e asimmetria

FRAP: una misura della mobilità

Proteine di membrana� Proteine integrali

– strettamente legate alla membrana con interazioni

idrofobiche

– si possono rimuovere solo disgregando la

membrana (con detergenti)

– Possono contenere più segmenti transmembrana

� Proteine periferiche o estrinseche

– legate blandamente ad una faccia della membrana

– una volta rimosse sono solubili

� Proteine ancorate covalentemente a lipidi (ad

esempio, GPI – glicosil-fosfatidilinositolo)

Un esempio di proteina integrale, la

batteriorodopsina (7-S)

1: porzione non raft della membrana2: lipid raft (ricco di colesterolo e sfingolipidi)3: proteina transmembrana associata a lipid raft 4: proteina nella porzione non raft della membrana5: proteina glicosilata6: proteina ancorata al GPI (glicosil-fosfatidilinositolo)7: colesterolo8: glicolipidi

spazio intracellulare

spazio extracellulare

Zattere o “lipid rafts”

Lipidi biologicamente attivi

� Ormoni steroidei

� Fosfatidilinositolo e suoi derivati fosforilati:

– segnalazione

� Cerammide e suoi derivati

– Segnalazione

� Eicosanoidi (derivati dell’acido arachidonico)

– Prostaglandine

– Trombossani

– Leucotrieni

Eicosanoidi

Derivano principalmente dall’acido arachidonico

EicosanoidiEsplicano il loro ruolo a livello locale: vita breve

� Prostaglandine

– Numerosi tipi

– Stimolano la contrazione uterina, regolano il flusso sanguigno, sono legate all’infiammazione

� Trombossani

– Prodotti nelle piastrine, coinvolti nella coagulazione

� Leucotrieni

– segnali biologici: ad esempio, inducono la contrazione della muscolatura liscia nei polmoni

La cicloossigenasi (COX) che partecipa alla sintesi di prostaglandine e trombossani è inibita da FANS

Sistemi di trasporto di membrana

� Diffusione semplice (processo spontaneo non mediato)

� Trasportatori

– Diffusione facilitata o trasporto passivo

– Trasporto attivo

� primario

� secondario

�Canali e pori

Diffusione semplice

Processo spontaneo non

mediato.

La velocità dipende dal

gradiente ∆[C], dalla

superficie di contatto e

da un coefficiente di

diffusione (legge di Fick)

Il flusso segue il gradiente di concentrazione…

… oppure un gradiente elettrico (o entrambi)

Diffusione semplice

� Non sono richieste proteine particolari

� Le specie si muovono seguendo il gradiente di

concentrazione; da [C] più alta a [C] minore

� Spesso, bassi coefficienti di permeabilità: velocità

� Poche specie diffondono efficacemente per questa via

(gas come l’ossigeno, molecole non polari come gli

steroidi...)

Trasportatori di membrana

Soggetti a modificazioni

conformazionali

I trasportatori (come gli

enzimi) diminuiscono

l’energia di attivazione

del processo di trasporto

Trasporto passivo (diffusione facilitata)

� Come per le reazioni che richiedono enzimi, la diffusione può essere possibile dal punto di vista termodinamico, poco probabile dal punto di vista cinetico.

� I soluti si muovono secondo gradiente (direzione favorita termodinamicamente)

� Proteine aumentano la velocità di trasporto(confronta con gli enzimi)

� Il trasporto mostra cinetiche di saturazione

Trasporti mediati e non mediati:differenze

� Velocità

� Specificità

� Saturazione

� Competizione

� Inibizione/inatti-

vazione

Il trasporto passivo del glucosio (Glut1; glucosio permeasi)

� Dodici eliche trans-membrana

� Due siti di legame (interno ed esterno)

� Cambiamento conformazio-nale in seguito al legame con il glucosio

� Glucosio nel plasma: ~ 5 mM

� Famiglia di trasportatori Glut: Glut4 è sotto il controllo dell’insulina

Ad es., Glut

pompa del

Trasporto attivo� I soluti si muovono contro gradiente (chimico,

elettrico o entrambi)

� Il processo sarebbe sfavorito termodinamicamente

– Trasporti attivi primari: l’energia deriva direttamente

da ATP

– Trasporti attivi secondari: l’energia deriva da un altro

processo accoppiato e favorevole (ad esempio,

gradienti ionici)

Un trasportatore attivo primario:la Na+-K+ ATPasi

� Escono 3 Na+

� Entrano 2 K+

� contro gradiente

chimico ed elettrico

Un trasportatore attivo primario:la Na+-K+ ATPasi

Dapprima ATP fosforila il

trasportatore e ne cambia la

specificità

Il cambiamento conforma-

zionale è dovuto alla

fosforilazione di un Asp

(ATPasi di tipo P)

La proteina fosforilata lega K+

Il fosfato si libera e K+ viene

rilasciato

La pompa del sodio è inibita dalla ouabaina e da glicosidi

cardioattivi come la digitossina

La concentrazione di calcio intracellulare è controllata

� [Ca2+] in è circa 0.1 µM, circa 4 ordini di grandezza più bassa che all’esterno

� Esistono almeno due Ca-ATPasi di tipo P, una di membrana citoplasmatica che espelle il calcio e una del reticolo endoplasmico/sarcoplasmico(SERCA) che lo sequestra

� Nella contrazione muscolare, il calcio èrilasciato dal reticolo

� Esiste anche uno scambiatore Na+/Ca2+

Un trasportatore attivo secondario:il trasportatore intestinale di glucosio

� Il trasportatore porta all’interno (sinporto)

– il glucosio contro gradiente (∆G positivo)

– il sodio secondo gradiente (∆G negativo)

� L’energia (sotto forma di ATP) è consumata

per espellere di nuovo il sodio (pompa del

sodio)

Trasportatori attivi primari e secondari

La resistenza ai farmaci anti-tumorali (MDR)

Dipende da una

pompa proteica che

espelle sostanze

estranee (in genere

idrofobiche) come

alcuni farmaci

Glicoproteina P

Sistemi di trasporto in cellule di mammifero

� Glucosio

� Amminoacidi

� H+ (ATPasi di tipo F)

� Na+, K+

� Ca++ (SR)

� Ca++, Na+

� Lattosio, H+ (E. coli)

� Passivo

� Co-trasporto attivo con Na+

� Attivo (mitocondri)

� Attivo primario (antiporto)

� Attivo primario

� Scambio attivo (secondario)

� Attivo secondario (sinporto)

Canali

� “Buco acquoso” nella membrana

� Velocità molto elevate (anche 1000 volte superiori ai trasportatori

� “Gating” (possono essere aperti o chiusi)

� Non saturabili

� Seguono il gradiente

La famiglia delle acquaporine� Nei mammiferi esistono almeno 11 proteine-

canale integrali per l’acqua

� Diversa localizzazione e ruolo

� Flusso molto veloce

� Peter Agre, Premio Nobel per la Chimica, 2003

Il canale per il sodio dipendente dal voltaggio è

bloccato dalla tetrodotossina

Il recettore dell’acetilcolina

Il canale del recettore dell’acetilcolina

Residui idrofobici ingombranti Leu tengono chiuso il canale

Il legame di due acetilcoline provoca una rotazione

Con i recettori occupati, le eliche espongono residui polari verso il canale

Ionofori mobili e che formano canali� Molecole organiche (spesso di origine

batterica) che aumentano la permeabilità di

membrana

– formanti canali

– trasportatori mobili

Valinomicina

Ionoforo specifico per K+

Struttura ciclica; contiene D- ed L-amminoacidi

Affinità per il potassio 1000 volte superiore rispetto al sodio

Gramicidina

Il metabolismo;sistemi enzimatici coordinati per:

�ottenere energia dall’ambiente (luce solare o sostanze

nutrienti)

�convertire molecole nutrienti nelle molecole caratteristiche

della cellula

�polimerizzare precursori (per produrre proteine,

polisaccaridi, acidi nucleici…)

�sintetizzare/degradare molecole specializzate

In E. coli, più di 1000 reazioni chimiche

Alto livello di coordinazione

Relazioni metaboliche

Da: Lehninger

OSSIDAZIONI

RIDUZIONI

Le vie metaboliche� Sono spesso “irreversibili” (∆G << 0)

� Molte tappe sono prossime all’equilibrio (∆G°’ ≅ 0) e dipendono dalle concentrazioni di reagenti

� Una (o più di una) tappa iniziale è di controllo(irreversibile); qui spesso il reagente si accumula (“diga”)

� Vie cataboliche e anaboliche sono spesso diverse

� Le vie cataboliche sono convergenti; quelle anabolichedivergenti

� Negli eucarioti esiste compartimentazione: questo consente di separare alcune vie e di mantenere concentrazioni diverse di metaboliti ed enzimi

I flussi sono controllati dalle reazioni “irreversibili”

Reazione limitata

dall’enzima (lontano

dall’equilibrio)

Reazioni limitate

dal substrato

(prossime

all’equilibrio)

Controllo del metabolismo

• Attività enzimatica (regolazione allosterica e covalente)

• Quantità di enzimi (induzione e repressione)

• Disponibilità di substrati

• Stato energetico

AMPADPATP

ADPATP

+ 2/1Carica energetica =

Le vie cataboliche sono convergenti

Da: Champe

Esempi di reazioni biochimiche

• Trasferimenti di gruppo (sostituzione nucleofila)

• Ossido-riduzioni

• Eliminazioni, isomerizzazioni, riarrangiamenti

• Reazioni che formano/rompono legami C-C

Composti “ad alta energia”• La completa ossidazione di “combustibili”

libererebbe notevoli quantità di energia:

– Glucosio: 2850 kJ/mole

– Palmitato 9780 kJ/mole

• Il metabolismo procede a tappe: l’energia è

immagazzinata a “pacchetti” in intermedi

“ad alta energia”

ATP, un composto con elevata energia di idrolisi

Adenina

ATP, un composto con elevata energia di idrolisi

Trasferimento di

un gruppo fosfato

Trasferimento di un

gruppo adenilico

Composti in genere stabili cineticamente

L’ATP è usato per alimentare numerosi processi

The ATP cycle

Luce (fotosintesi) o composti ad alta energia potenziale (respirazione)

Sintesi di macro-molecole (proteine, DNA…)

Sintesi di altri componenti cellulari

Movimenti cellulari e lavoro meccanico

Trasporti di molecole/ ioni contro gradiente

Generazione di potenziali elettrici

Calore

Nell’uomo ci sono circa 100 g di ATP: a riposo si “consumano”

circa 40 kg ATP/giorno

Reazioni accoppiate

Coenzimi ossido-riduttivi

NAD+ e FAD

• Piridinici (NAD e NADP)

– Derivano dalla niacina (Vitamina PP o B3)

– Cosubstrati di più di 200 enzimi

– Ruoli metabolici specializzati

– Accettano due elettroni (ione idruro H:-)

– NADPH è coinvolto nelle biosintesi riduttive

• Flavinici (FMN e FAD)

– Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)

– Possono trasferire un elettrone alla volta

– In genere, legati saldamente agli enzimi (flavoproteine)

Un coenzima che partecipa ad ossidoriduzioni: il NAD(P)

Ossidoriduzioni ed energia

• L’ossidazione di coenzimi ridotti è un processo

esoergonico

• L’energia liberata può essere utilizzata per la

sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa)

• ATP può essere generato anche dall’accoppia-

mento con processi più esoergonici

(fosforilazione a livello del substrato)

- CH2- CH2- - CH ==== CH -

FAD FADH2

Il substrato si è ossidato (ha perso elettroni), il FAD si è ridotto a FADH2 (ha acquistato elettroni)

- CH - CH2-

- C - CH2-

ONAD+ NADH

Il substrato si è ossidato (ha perso elettroni), il NAD+

si è ridotto a NADH (ha acquistato elettroni)

I coenzimi flavinici e piridinici sono accettori di elettroni che provengono dalle

ossidazioni

Gli elettroni possono trasferirsi da prodotti ridotti a reagenti

ossidati di una reazione sovrastante

OSSIDANTI

RIDUCENTI

Da: Lehninger

Il glucosio svolge un ruolo centrale

Glicogeno, amido,

saccarosio...

deposito

glicolisi (10 reazioni)

Acidi grassi

Alcuni aspetti della glicolisi• Via “antica” e conservata

• Formazione di ATP nella glicolisi

• Destino del piruvato

• Energia rimasta nel piruvato

• Ruolo degli intermedi fosforilati

• Altri zuccheri come fruttosio e galattosio sono trasformati in intermedi della glicolisi

• Il NAD+ come reattivo limitante

• Fermentazioni: reazioni anaerobiche che rigenerano NAD+

Glicolisi: fase preparatoria

Fosforilazione del glucosio e

formazione della

gliceraldeide-3-P

Glicolisi: fase di recupero

conversione della gliceraldeide-3-P

Formazione di ATP

Glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi→ 2 piruvato + 2 NADH +

2 ATP + 2 H2O + 4 H+

Il glucosio è

trasportato

all’interno

della cellula

1. Attivazione del glucosio:

la prima tappa è “irreversibile” e regolata

∆G = - 33.9 kJ/mol

Reazioni accoppiate

Isoenzimi della esochinasi:ruolo metabolico

Vmax/2

epatica (non è inibita da G-6-P)

inibita da G-6-P

Il glucosio è trattenuto nella cellula dalla fosforilazione a G6P

La fosforilazione

sposta l’equilibrio a

destra

2. Isomerizzazione a fruttosio

È più facile fosforilare un -OH primario

3. La seconda fosforilazione è catalizzata dalla fosfofruttochinasi (PFK-1)

La fosfofruttochinasi è un enzima regolato

4. L’aldolasi catalizza una condensazione aldolica

∆∆∆∆G = - 0.23 kJ/mol

5. I prodotti dell’aldolasi possono

interconvertire per isomerizzazione

La glicolisi prosegue dalla GA3P

TPI è un enzima “perfetto”

6. L’ossidazione dell’aldeide “guida” la

formazione dell’acilfosfato, composto

ad alta energia

Meccanismo d’azione della

gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi

tioemiacetale tioestere

7. La fosfoglicerato chinasi forma ATP

(fosforilazione a livello del substrato)

Le reazioni 6) e 7) sono energeticamente accoppiate:

∆∆∆∆G°’ = 6.3 – 18.5 = - 12.2 kJ/mol

6, 7 - riassumendo:

• Un’aldeide (gliceraldeide-3-P) è ossidata a

1,3 bis-fosfoglicerato (che poi si trasforma

in 3-P-glicerato)

• Il NAD+ si riduce a NADH

• Si forma ATP, a spese dell’energia di

ossidazione del carbonio

• La reazione 7) “spinge” in avanti la

reazione 6) con cui è accoppiata

Una deviazione nella glicolisi

• Nei globuli rossi, da 1,3 BPG per azione di

una mutasi si forma 2,3 BPG, effettore

negativo dell’emoglobina

8. La fosfoglicerato mutasi riposiziona il

fosfato per la reazione successiva

9. La deidratazione catalizzata da enolasi

forma un composto ad alta energia

10. L’energia del PEP è usata per formare un

secondo ATP (piruvato chinasi)

Reazione fortemente esoergonica

Bilancio energetico

della glicolisi

Le reazioni della

glicolisi sono

utilizzate in parte

nella via sintetica

(gluconeogenesi)

Destino del piruvato e del NADH

• In condizione aerobiche,

– il piruvato è ossidato completamente a CO2 e

acqua (ciclo dell’acido citrico)

– Il NADH partecipa al trasferimento di elettroni

fino all’accettore finale ossigeno: in questo

processo si rigenera NAD+

• In condizioni anaerobiche,

– Il piruvato è trasformato per rigenerare NAD+

(fermentazioni)

Fermentazione lattica• Serve per rigenerare NAD +

• Il lattato è trasportato dal

sangue al fegato dove si può

riformare glucosio (ciclo di

Fermentazione alcolica (lieviti)

È necessario un cofattore, la

tiamina pirofosfato

La tiamina pirofosfato

• Deriva dalla tiamina, vitamina B1, anti beri-beri

• Partecipa a reazioni di decarbossilazione,

trasportando un’”aldeide attiva”

• Forma un carbanione sull’anello tiazolico (che

contiene un H acido)

Vitamina B1

Si forma un carbanioneH acido

Meccanismo

d’azione della

Da: Lehninger

La gluconeogenesi• Alcuni tessuti (globuli rossi, cervello..)

dipendono dal glucosio

• Sintesi di glucosio da precursori non glucidici:

– Lattato, piruvato, ossalacetato, glicerolo…

– Amminoacidi (scheletro carbonioso)

• Usa le reazioni glicolitiche in direzione inversa tranne quelle esoergoniche:

– piruvato chinasi

– fosfofruttochinasi

– esochinasi

• Principalmente nel fegato

• Glicolisi e gluconeogenesi strettamente coordinate

La piruvato carbossilasi produce ossalacetato

• La reazione richiede ATP, HCO3- e biotina (un coenzima

che trasporta CO2 )

• La biotina è legata covalentemente a una lisina dell’enzima

• Regolazione: quando ATP o acetil-CoA sono alti, il

piruvato entra nella gluconeogenesi

• Esiste un "problema di conversione " nei mitocondri

(passaggio di metaboliti tra citosol e mitocondri)

La biotina

• Vitamina (H) sintetizzata da batteri intestinali

• Trasporta CO2

• Legata covalentemente a enzimi (braccio mobile)

• La carbossilazione richiede ATP

Biotina Carbossi-biotinil-

enzima

L’ossalacetato è

un intermedio del

ciclo di Krebs

(mitocondri)

La piruvato carbossilasi

è attivata da acetil-CoA

Acidi grassi

deviazionepiruvato

chinasi

Il trasporto del malato produce NADH citosolici

citosolica

La piruvato carbossilasi è nel mitocondrio

Meccanismo di azione della piruvato carbossilasi

La fosfoenolpiruvato

carbossichinasi

• L’ossalacetato è un

piruvato “attivato”

• Occorre molta energia

proveniente:

– dalla decarbossilazione

– dal GTP

Le altre due deviazioni

Seconda

deviazione

Nella sintesi di un glucosio si

“consumano” 6 ATP

Dato che nella glicolisi si

formano 2 ATP, un ciclo

futile “costerebbe” 4 ATP

Glicolisi e gluconeogenesi� La glicolisi e la gluconeogenesi sono vie metaboliche

spontanee (esoergoniche)

� Se fossero attive simultaneamente si avrebbe un “ciclo

futile” con consumo di energia: è necessaria una regolazione

reciproca

� Glicolisi: � glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi � 2 piruvato + 2 NADH

+ 2 ATP

� Gluconeogenesi: � 2 piruvato + 2 NADH + 4 ATP + 2 GTP � glucosio + 2 NAD+

+ 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi

� Glicolisi + gluconeogenesi:

� 2 ATP + 2 GTP �� 2 ADP + 2 GDP + 4 Pi

Il fruttosio 2,6-bisfosfato è un potente

modulatore

La glicolisi è attivata La gluconeogenesi è rallentata

Enzima tandem

• Il fruttosio 2,6-bisfosfato è sintetizzato e scisso

da due attività sullo stesso enzima (PFK-2 e

Fruttosio BisFosfatasi -2, (FBP-2))

• L’enzima è sotto controllo allosterico, covalente,

ormonale

Ruolo del fruttosio 2,6-bisfosfato

Via del pentosio fosfato

(“shunt” dell’esosio monofosfato)

� Alternativa ossidativa alla glicolisi

�Tessuto adiposo

�fegato (30% del glucosio ossidato)

� Ha origine dal glucosio 6-fosfato

�Esochinasi, Glicogeno

� Serve a produrre (fase ossidativa)

�Pentosio fosfato (ribosio)

�NADPH

• NADPH: “potere riducente” per

le biosintesi (come quella degli

acidi grassi)

– Distinto da NADH

– [NAD+]/[NADH] ≅ 1000

– [NADP+]/[NADPH] ≅ 0.01

1. Glucosio 6-fosfato deidrogenasi

Si forma un δ-lattone (estere

ciclico intramolecolare)

2. La lattonasi (esterasi)

accelera l’apertura dell’anello

3. Fosfogluconato deidrogenasi

• La fosfogluconato deidrogenasi catalizza la de-

carbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato:

il NADP+ serve da ossidante

Un chetosio:

ribulosio-5-P

4. Formazione del ribosio 5-fosfato

� Si forma il chetone ribulosio-5-

fosfato che una isomerasi

converte in ribosio-5-fosfato

� Nella fase ossidativa si formano

un Ribosio-1-P e due NADPH

� NADPH serve per le vie

sintetiche e previene danni

ossidativi

Isomerizzazione del ribulosio 5-P

Via del pentosio fosfato:fase non ossidativa

• Ricicla pentosi in composti a diverso numero di

carbonii

• Da tre pentosi (C5) si può arrivare a due molecole di

fruttosio-6-P (C6) e una gliceraldeide-3-P (C3)

• Può essere percorsa in entrambe le direzioni

(reazioni facilmente reversibili)

• Consente di arrivare a pentosi senza la fase

ossidativa

• Transchetolasi: trasferisce un frammento a due C da

un chetosio donatore a un aldosio accettore

• Transaldolasi: trasferisce un frammento a tre C

La fase non ossidativa ricicla i pentosi a glucosio-6-fosfato

Da: Voet et al. Fondamenti di Biochimica - Zanichelli

OSSIDATIVA

FASE NON

OSSIDATIVA

Reazioni

reversibili:

la fase non

ossidativa

può essere

percorsa al

contrario

Versatilità della via dei pentosi

1. Richiesta di “potere riducente” e ribosio

(ad esempio, duplicazione cellulare)

– Fase ossidativa

2. Elevata richiesta di NADPH

– La via prosegue con le reazioni transchetolasiche

e transaldolasiche

3. Bassa richiesta di NADPH

– La fase non ossidativa è percorsa a ritroso

partendo da fruttosio-6-fosfato

Carenza di G6PDH e favismo

� NADPH contribuisce a mantenere l’ambiente

riducente nei globuli rossi

� La carenza dell’enzima porta a crisi emolitiche

� Numerosi farmaci e sostanze ossidanti possono

scatenare crisi emolitiche

� Distribuzione geografica simile a quella della

malaria

Glicogeno• Il glicogeno (come l’amido) è un polimero del D-glucosio

• I monomeri sono legati con legami glicosidici αααα 1→→→→4

nelle catene principali e αααα 1 →→→→ 6 nelle ramificazioni.

• È un sistema di accumulo del glucosio sotto forma di

granuli (soprattutto nel fegato): struttura molto ramificata

Demolizione del glicogeno (glicogenolisi)

• Alimenta il glucosio del sangue (~ 5mM) dal

fegato e la glicolisi nel muscolo

• Riserva di breve durata

• Richiede tre enzimi

La glicogeno fosforilasi• Stacca un glucosio -1-fosfato (G1P) da una estremità

non riducente (C-4 libero) (reazione di fosforolisi)

Glicogeno• La struttura dei granuli di glicogeno permette una

rapida mobilizzazione (scissione) del glucosio 1-P

poiché vi sono molte estremità diverse attaccabili

2, 3 Glicogenolisi

• Date le dimensioni del sito, la fosforilasi riesce a tagliare il legame α 1→ 4 fino a quattro residui dalla ramificazione

• 2. Un enzima deramificante“sposta” tre unità di glucosio (transferasi) e “taglia” l’ultimo glucosio (attività glucosidasi) formando glucosio libero

• 3. La fosfoglucomutasi (una isomerasi) converte G1P in G6P

• Nel fegato, il G6P produce glucosio (G6P fosfatasi)

Nel fegato è

presente la G6P

fosfatasi

La glicogeno fosforilasi è un enzima

polimerico controllato

• Regolazione covalente: esiste una forma fosfo-

rilata in Serina (fosforilasi a) più attiva e una

defosforilata (fosforilasi b) meno attiva

• Regolazione allosterica: conformazione attiva R

e meno attiva T. Un effettore positivo come

AMP sposta l’equilibrio verso R.

Sintesi del glicogeno

• Sintesi e demolizione devono seguire vie diverse

• Occorrono tre enzimi

• La sintesi è coordinata con la demolizione

• La sintesi ha inizio con una reazione esoergonica

(di attivazione)

• Si utilizza UTP come trasportatore di glucidi

1. La UDP-glucosio pirofosforilasi

• G1P è trasferito su UTP

• L’idrolisi del pirofosfato PPi

rende la reazione esoergonica

(strategia comune)

2. La glicogeno sintasi

• Il glucosio è trasferito dall’UDPG sul C-4 di un

estremità non riducente di glicogeno (αααα 1→→→→4 )

La glicogeno sintasi è un enzima

controllato

• La glicogeno sintasi è un tetramero in cui la forma

fosforilata (su Ser) è meno attiva (al contrario della

fosforilasi)

• La forma fosforilata è regolata allostericamente

• Il controllo glicogeno fosforilasi/sintasi è ormonale

3. L’enzima ramificante

• La sintasi allunga catene con legami αααα 1→→→→ 4 (come

nell’amilosio)

• Le ramificazioni sono dovute ad un enzima che

trasferisce segmenti di residui di glucosio su di un C6

• Dato che la sintasi può solo allungare segmenti pre-

esistenti, la sintesi comincia da una proteina

glicogenina su cui si forma un “innesco” (su di un

residuo di Tyr)

Fasi della demolizione aerobica del glucosio

� Produzione di acetil-CoA (complesso della

piruvato deidrogenasi)

� Ossidazione dell’acetil-CoA (ciclo di Krebs)

� Trasferimento di elettroni e fosforilazione

ossidativa

Gli acetil-CoA possono provenire anche dalla

demolizione (ossidazione) degli acidi grassi

Il Ciclo dell’acido citrico (di Krebs; 1937)

“cristae”

(acetilCoA)

Il Ciclo dell’acido citrico: una panoramica

� Via circolare (ciclo) con otto reazioni

� Le reazioni avvengono nella matrice

mitocondriale (un enzima è nella membrana

mitocondriale interna)

� Nei mitocondri vi sono anche gli enzimi per

l’ossidazione degli acidi grassi e la fosforilazione

ossidativa

Il Ciclo dell’acido citrico: una panoramica

� Reazione netta totale:

� Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi →

CoA + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2 CO2

� L’energia di ossidazione è conservata nei

coenzimi ridotti e nel GTP

� Il ciclo agisce come un catalizzatore che ossida

gruppi acetilici

� Gli intermedi della via possono essere precursori

di altri composti (funzione anfibolica)

Una tappa di collegamento:la piruvato deidrogenasi

� Trasforma il piruvato in acetil-CoA

� È un complesso (in E. coli, 60 subunità!) formato da tre enzimi:– piruvato deidrogenasi

– diidrolipoiltransacetilasi

– diidrolipoildeidrogenasi

� Utilizza cinque coenzimi:– CoA-SH

– tiamina pirofosfato (TPP)

– Lipoato

– NAD+

– FAD

Il complesso piruvato deidrogenasi

consente l’ingresso del piruvato nel

ciclo di Krebs

Il coenzima A (CoA-SH)

ββββ-mercaptoetilammina Acido pantotenico

I tioesteri sono composti “ad alta energia”

L’acido pantotenico è una vitamina del

gruppo B

La tiamina pirofosfato

La Tiamina è una vitamina (B1) – anti beri-beri

Il lipoato (fattore vitaminico)

è un braccio mobile legato

covalentemente all’enzima E2

Catena polipeptidica di E2

(diidrolipoiltransacetilasi)

Decarbossilazione

ossidativa del

piruvato

�Piridinici (NAD e NADP)

– Derivano dalla niacina (Vitamina PP o B3)

– Cosubstrati di più di 200 enzimi

– Ruoli metabolici specializzati

– Accettano due elettroni (ione idruro H:-)

– NADPH è coinvolto nelle biosintesi riduttive

�Flavinici (FMN e FAD)

– Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)

– Possono trasferire un elettrone alla volta

– In genere, legati saldamente agli enzimi (flavoproteine)

Controllo della piruvato deidrogenasi� Inibizione retroattiva da prodotto

– NADH

– Acetil CoA

� Regolazione covalente

– la fosforilazione tramite una chinasi rende il

complesso meno attivo

– L’insulina attiva la piruvato deidrogenasi tramite una

fosfatasi

� Regolazione allosterica

– ATP inibisce

– AMP attiva

1. La citrato sintasi: l’acetil-CoA condensa con l’ossalacetato

legame tioestere

2. L’aconitasi: il citrato isomerizza

La reazione sarebbe spostata a sx, ma si consuma isocitrato

L’isocitrato si ossida più facilmente

3. Prima decarbossilazione ossidativa: l’isocitrato deidrogenasi

Si forma il primo NADH

4. Seconda decarbossilazione ossidativa:

l’α-chetoglutarato deidrogenasi

Il meccanismo è analogo alla piruvato deidrogenasi:

il prodotto è un tioestere ad alta energia

5. Parte dell’energia è recuperata in

una fosforilazione a livello del substrato

6. Ossidazione del succinato

SDH: nella membrana interna

7. Idratazione del fumarato

8. L’ossalacetato viene recuperato: la malato deidrogenasi

La reazione sarebbe endoergonica, ma la

citrato sintasi rimuove l’ossalacetato

I prodotti del ciclo di Krebs

Bilancio del ciclo� Nella glicolisi dal glucosio si formano 2 ATP e due

� Nel ciclo di Krebs da due molecole di piruvato si ottengono:

– 8 NADH (di cui due 2 dalla piruvato deidrogenasi)

– 2 FADH2

– 2 GTP

� Dalla ossidazione dei coenzimi nella fosforilazione ossidativa si ottengono:

– Dal NADH: 2.5 - 3 ATP

– Dal FADH2: 1.5 - 2 ATP

� Dalla ossidazione completa del glucosio si ottengono 32-38 ATP, con una resa attorno al 65%

Controllo del ciclo di Krebs

� Tre fattori:

– Disponibilità di substato

– Inibizione da prodotto

– Inibizione allosterica retroattiva

(da ATP)

� Il ciclo è regolato a livello

delle tre tappe esoergoniche:

– Citrato sintasi

– Isocitrato deidrogenasi

– α-chetoglutarato deidrogenasi

Acidi grassi

Reazioni cataplerotiche/anaplerotiche

� Ossalacetato per la gluconeogenesi

� Acetil-CoA per la sintesi degli acidi grassi (via citrato)

� Ossalacetato/chetoglutarato verso il metabolismo degli amminoacidi

� Ossalacetato dalla piruvato carbossilasi (gluconeogenesi); un aumento di acetil-CoA attiva l’enzima

� Ossalacetato/ chetoglutarato dal metabolismo degli amminoacidi

Trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa

• Le ossidazioni di nutrienti producono coenzimi ridotti

(NADH, FADH2)

• Nel processo di riossidazione dei coenzimi ridotti è

coinvolto un flusso di elettroni attraverso intermedi redox

• L’energia resa disponibile dal flusso esoergonico di

elettroni è accoppiata al trasporto endoergonico di protoni

attraverso la membrana mitocondriale

• il flusso di protoni in senso inverso (gradiente protonico)

fornisce l’energia libera per la sintesi di ATP

Trasporto di elettroni e

fosforilazione ossidativa: schema

Creste

Membrana interna

Membrana esterna

Spazio intermembrana

Matrice

STRUTTURA DEL MITOCONDRIO

Probabilmente “antichi” batteri aerobici; possiedono un loro DNA

Sistemi navetta: i coenzimi ridotti devono

essere trasportati nei mitocondri

La navetta

malato-aspartato

Da: J. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer “Biochimica”, Zanichelli

La navetta del

glicerofosfato

I valori positivi indicano una maggiore tendenza ad acquistare elettroni

(ridursi).

Il flusso di elettroni va da specie con potenziale più negativo a specie con

potenziale più positivo

Potenziali redox nella catena respiratoria

I potenziali redox consentono di valutare la variazione di energia libera

E = E°’ +RT/nℑ . ln [accettore e-]/ [donatore di e-]

∆E = Eaccettore - E donatore

∆G°’ = - nℑ ∆E°’

Ad esempio,

NAD+ + H+ + 2e- ⇔ NADH E°’ = - 0.315 V

1/2 O2 + 2H+ + 2e- ⇔ H2O E°’ = 0.815 V

L’ossigeno ha maggior tendenza a ridursi:

1/2 O2 + NADH + H+ ⇔ H2O + NAD+

∆E°’ = 1.130 V ∆G°’ = - 218 kJ/mole

Alla catena respiratoria partecipano:

• Coenzimi (NADH, FADH2, FMN)

• Proteine integrali di membrana come

– citocromi (contenenti gruppi eme)

– proteine ferro-zolfo

• Ubichinone o Coenzima Q, molecola idrofobica

diffusibile nel doppio strato

• Citocromo c, una piccola proteina periferica

(solubile )

Schema del trasferimento elettronico

matrice

Complesso INADH DEIDROGENASI trasferisce elettroni dal NADH al Q

Complesso IISUCCINATO DEIDROGENASI trasferisce elettroni dal FADH2 al Q

Complesso IIIUBICHINONE-CITOCROMO C REDUTTASI trasferisce elettroni dal Q al citocromo c

Complesso IVCITOCROMO OSSIDASI trasferisce elettroni dal citocromo c all’O2

All’interno di ogni complesso, gli elettroni passano sequenzialmente

attraverso una serie di trasportatori di elettroni.

Complesso I : NADH DEIDROGENASI (NADH-ubichinone ossidoreduttasi)

• Trasferimento di elettroni da NADH al Coenzima Q (CoQ ) NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2

• Quattro H+ transportati fuori per 2 e-

Forma a L

Complesso I : NADH DEIDROGENASI (NADH-ubichinone ossidoreduttasi)

• Complesso di grandi dimensioni: più di 40

subunità proteiche tra cui

– Una FMN-flavoproteina

– Almeno sei centri FeS

• L’ubichinolo (Coenzima Q ridotto - QH2)

diffonde nella membrana verso il Complesso III

• Inibito da amital (un barbiturico) e rotenone

Per il loro “trasporto interno” di elettroni le proteine che

fanno parte del I e II complesso utilizzano:

� molecole di FMN e FAD

� centri Fe-S, nei quali il Fe passa dallo stato di

ossidazione +2 a +3 e viceversa, trasportando elettroni

COMPLESSI I E II

L’ubichinone o

coenzima Q è

liberamente diffusibile

nella membrana

Ubichinone (Q)

ossidato

Radicale

semichinone (QH ••••)

Ubichinolo (QH2)

ridotto

Benzochinone, con una catena

laterale isoprenoide

(comunemente 10 unità: Q10)

Complesso II SUCCINATO DEIDROGENASI

(succinato-CoQ reduttasi)

• E’ lo stesso enzima che partecipa al ciclo di Krebs

• Trasferisce elettronidirettamente al CoQ

• NON trasporta H+ nello spazio intermembrana

• Altri substrati trasferiscono elettroni dal FADH2 direttamente al CoQ

da: Lehninger

Complesso III (complesso bc1)UBICHINONE-CITOCROMO C REDUTTASI

• CoQ passa elettroni al citocromo c (e pompa 4 H+)

• Le principali proteine trans-membrana nel complesso III

sono citocromi b e c1

• I citocromi sono agenti che trasferiscono un elettrone

• UQH2 è un trasportatore di elettroni liposolubile

• Il citocromo c è un trasportatore di elettroni idrosolubile

(è una piccola proteina periferica di membrana)

I citocromi contengono gruppi prostetici a Ferro

Per il loro “trasporto interno” di elettroni, i complessi III e IV

utilizzano proteine dette citocromi, contenenti gruppi porfirinici

(eme) a cui è legato il Fe, che può passare dallo stato + 2 a quello + 3

e viceversa

I citocromi hanno spettri UV-vis

caratteristici

Complesso IVCITOCROMO OSSIDASI

� Grandi dimensioni: 13 subunità

� Trasferisce elettroni dal citocromo c all’O2; si ha una riduzione a 4 elettroni dell’O2 per produrre 2 H2O

� L’ossigeno è dunque l’accettore terminale di elettroni nella catena di trasporto

� La citocromo c ossidasi utilizza 2 gruppi eme di tipo a e 2 siti a rame

� Il complesso IV trasporta anche 2 H+ nello spazio intermembrana

Potenziali

nel trasporto

di elettroni

Fosforilazione ossidativa e teoria chemiosmotica

• La sintesi dell’ATP è catalizzata dalla ATP sintasi

• l’energia liberata dal trasporto di elettroni serve per

pompare H+ nello spazio intermembrana creando un

gradiente elettrochimico (pH e carica) (forza motrice

protonica);

• Il potenziale del gradiente è sfruttato per la sintesi di

ATP, grazie al rientro “guidato” di protoni nella matrice

La sintesi di ATP è “guidata” dal gradiente protonico

Il gradiente di H+ contribuisce al trasporto di

ATP e Pi

Inibitori della fosforilazione ossidativa

• Il rotenone inibisce il complesso I

• Il cianuro e CO inibiscono il complesso IV, legandosi al ferro dell’eme

• L’oligomicina inibisce l’ATP sintasi

Inibitori selettivi

Da: Garrett & Grisham - Biochemistry

Disaccoppianti• L’accoppiamento dipende dall’integrità della

membrana: composti che dissipano il gradiente

protonico (disaccoppianti) impediscono la sintesi

di ATP (ma non la “respirazione”)

• Il grasso bruno contiene un disaccoppiante

proteico naturale (termogenina o UCP-1):

l’energia del gradiente è dissipata come calore

Studi su mitocondri:inibitori e disaccoppianti

da: Lehninger

succinato

ADP + Pi

La struttura dell’ATP sintasi

• Composta da due dominii funzionali: Fo e F1

– Fo: (oligomicina-sensibile) proteina integrale di membrana; crea un canale per gli H+;

– F1 : proteina periferica che protrude nella matrice ed è il sito di sintesi dell’ATP; 9 subunità (α3β 3 γδε)

• Il meccanismo di funzionamento dell’ATP sintasi sfrutta il gradiente protonico per sintetizzare ATP; la catalisi è assicurata a turno dalle subunità β, grazie ad una rotazione accompagnata da modificazioni conformazionali.

• La proteina può funzionare come pompa per gli H+, consumando ATP

La struttura dell’ATP sintasi

matrice

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS)

• Durante il trasferimento elettronico, si

possono formare radicali liberi molto reattivi:

O2 + e- O2-. ione superossido

ANIONE SUPEROSSIDO

PEROSSIDO DI IDROGENO

RADICALE IDROSSILE

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS)

• Vita breve

• Alcune sono radicaliche (elettroni spaiati);

H2O2 è reattiva, ma non è un radicale

• A basse concentrazioni: segnalazione

• A concentrazioni medio-alte: danni

• a proteine, lipidi, acidi nucleici

• L’invecchiamento e numerose patologie

degenerative sono correlati alle ROS

Meccanismi antiossidanti• Composti a basso peso molecolare

– Acido ascorbico (vitamina C), tocoferolo

(vitamina E), glutatione…

• Enzimi

– Superossido dismutasi

– Catalasi, glutatione perossidasi (rimuovono

l’acqua ossigenata)

Stress ossidativo

Demolizione dei triacilgliceroli

� Dalla dieta: lipasi digestive (la principale è

pancreatica)

� Dalle riserve: lipasi sotto controllo ormonale

Si formano mono- e diacilgliceroli, acidi grassi e

glicerolo

� I lipidi sono trasportati da lipoproteine (i

trigliceridi principalmente da chilomicroni)

Gli acidi biliari emulsionano i lipidi

Mobilizzazione dei lipidi di deposito

� I triacilgliceroli sono idrolizzati

da lipasi sotto controllo

ormonale

� Gli acidi grassi sono trasportati

legati all’albumina

Da: Lehninger - Zanichelli

Lipoproteine plasmatiche: densità e composizione

4629208Fosfolipidi

71172Colesterolo

4050183Esteri col.

6105585Trigliceridi

44809199Lipidi %

1.063-

1.006-

< 0.94Densità

(g/ml)

HDLLDLVLDLchilomicroni

Catabolismo dei lipidi: utilizzazione

del glicerolo

verso la glicolisi

Attivazione degli acidi grassi

acil CoA

sintetasi

acil CoA

sintetasi

acil CoA

acil-adenilato

legato all’enzima

Gli acili sono trasferiti nel mitocondrio dalla carnitina

L’esperimento di Knoop

(1904)

Acidi grassi con numero di

carbonii pari…

e dispari

Dimostra che la degradazione procede

staccando unità bicarboniose

La chimica del catabolismo degli acidi grassi

La β-ossidazione degli acidi grassi

� Il legame Cα-C

βsi rompe con difficoltà

� Il carbonio β è ossidato (tre reazioni analoghe a

quelle da succinato ad ossalacetato nel ciclo di

Krebs)

� il β-chetoacil-CoA è scisso da una tiolasi

(reazione inversa rispetto ad una condensazione)

� L’acil-CoA accorciato di due atomi di carbonio

ripete il ciclo

Quattro reazioni ripetute

1. Acil CoA deidrogenasi (flavoproteine)

Analogo alla succinato deidrogenasi

L’acil CoA deidrogenasi è un enzima

della membrana mitocondriale:

gli elettroni del FADH2 sono trasferiti

all’ubichinone

2. Enoil-CoA idratasi (crotonasi)

� Addiziona acqua al doppio legame: analogo alla fumarasi

� La reazione trasforma il trans enoil- CoA in L-β-idrossiacil-CoA

3. Idrossiacil-CoA deidrogenasi� Ossida il gruppo alcolico secondario in β

� È assolutamente specifico per gli isomeri L

4. β-chetotiolasi

Un gruppo Cys-SH

dell’enzima attacca il

ββββ-carbonile

Il gruppo -SH di un nuovo CoA

attacca l’acile accorciato, formando

un nuovo acil-CoA∆∆∆∆G°’ < 0

Il ciclo si ripete

� Per l’acido palmitico (C16),

il ciclo si ripete sette volte,

formando

– 8 acetil-CoA

– 7 NADH e FADH2

Destino dei prodotti della β-ossidazione

� Acetil-CoA: ciclo di

� Coenzimi ridotti: catena

respiratoria

Acidi grassi dispari

� La β-ossidazione porta a propionil-CoA

� Tre ulteriori reazioni lo convertono in succinil-CoA

� Gli acidi grassi dispari sono precursori per la

gluconeogenesi

Acidi grassi insaturi� Opportuni enzimi (isomerasi) convertono doppi legami da

∆3-cis a ∆2-trans

� Nei poliinsaturi, tali legami vanno “spostati” in modo da

trovarsi in posizione trans ∆2: intervengono una isomerasi

e una reduttasi

Demolizione dell’acido oleico (monoinsaturo)

Corpi chetonici� L’acetoacetato si forma per

condensazione di acetil-CoA

� Acetoacetato e idrossibutirrato inter-convertono grazie ad una deidrogenasi

� L’acetone è prodotto per decarbossi-lazione

� I CORPI CHETONICI sono normali composti usati da tessuti extra-epatici

� L’acetoacetato è convertito ad aceto-acetil-CoA grazie al succinil-CoA

� Un eccesso di corpi chetonici (chetosi) si osserva nel digiuno prolungato e nel diabete; può portare ad acidosi

Formazione dei corpi chetonici

Biosintesi degli acidi grassi• Sintesi e catabolismo usano vie differenti

– la biosintesi avviene nel citosol

– Nella sintesi gli intermedi sono legati a -SH di una

proteina trasportatrice di acili (ACP) invece che a CoA-

– Nella sintesi c’è un solo complesso enzimatico

– La biosintesi utilizza come coenzima NADPH (che

proviene principalmente dalla via dei pentosi)

• L’acetil-CoA è “esportato” dai mitocondri sotto

forma di citrato (sistema citrato-malato-piruvato)

• Oltre a equivalenti riducenti, è richiesto ATP

Le fonti di Acetil-CoA

citosolmatrice mitocondriale

membrana mitocondriale

grassi

Le fonti di Acetil-CoA

• In condizioni di ATP elevato, il citrato si accumula

ed è trasportato fuori dal mitocondrio

• La reazione catalizzata da citrato liasi è formalmente

l’inverso della sintesi: la formazione dell’intermedio

citril-CoA richiede energia:

• citrato + ATP + CoA ⇔ ossalacetato + acetil-CoA + ADP

• L’ossalacetato si trasforma in malato (MDH)

• Il malato può:

– rientrare nel mitocondrio (grazie ad un trasportatore)

– formare piruvato e NADPH (enzima malico)

Le sorgenti di NADPH:

L’enzima malico

La via del pentosio-fosfato

In abbondanza di

ATP, il citrato può

uscire dal

mitocondrio

Ciclo di Krebs

Biosintesi degli acidi grassi

• La sintesi impiega unità bicarboniose: acetil-CoA

• La condensazione di due acetil-CoA sarebbe

endoergonica (la reazione catalizzata dalla tiolasi è

esoergonica)

• Un acetil-CoA viene “allungato” a malonil-CoA

per carbossilazione

La proteina

trasportatrice di acili

(ACP)serina

gruppi malonile

sono esterificati

al -SH

L’acetil CoA carbossilasi• La carbossilazione dell’acetil-CoA per formare

malonil-CoA è una tappa irreversibile e regolata

• ACC usa bicarbonato, ATP e biotina

NAD e NADP non sono

intercambiabili

NAD+/NADH ≅ 1000

NADP+/NADPH ≅ 0.01

L’acido grasso sintasi• In E. Coli è un complesso multienzimatico

costituito da ACP e sei enzimi

• Negli animali, è costituita da due subunità

ciascuna multifunzione

1,2 e 3. I gruppi acetile e malonile,

trasferiti sul complesso, condensano

β-chetoacil-ACP

sintasi (KS)

Acido grasso

sintasi

condensazione di

Claisen La decarbossilazione

rende il processo

esoergonico

4. Riduzione del β-

carbonile

β-chetoacil-ACP

reduttasi (KR)

si forma un D- β-

idrossiacil-ACP

5. Deidratazione

β-idrossiacil-

ACP deidratasi

si forma un trans-

∆2-butenoil (enoil)-

6. Riduzione del doppio legame

enoil-ACP

reduttasi (ER)

si forma il butirril-ACP o un acido

grasso saturo allungato di 2 carbonii

Sintesi degli acidi grassi: il seguito• Il butirrile è trasferito sull’-SH del primo enzima

• L’ACP resta libero per “accogliere” un malonile

• Si ha una condensazione e le reazioni su ripetono

allungando di due carbonii l’acido grasso

• Di solito, si arriva al massimo a palmitato C16 ; una

attività idrolitica del complesso lo libera dall’ACP

7 acetil CoA + 7 CO2 + 7 ATP ⇔ 7 malonil-CoA + 7 ADP + 7 Pi

acetil CoA + 7 malonil CoA + 14 NADPH + 14 H+ ⇔ palmitato +

14 NADP + + 8 CoA + 7 CO2 + 6 H2O

8 acetil CoA + 7 ATP + 14 NADPH + 14 H+ ⇔ palmitato + 7 ADP

+ 7 Pi + 14 NADP +

Regolazione della biosintesi degli

acidi grassi

• L’acetil-CoA carbossilasi (ACC) è

– attivata allostericamente dal citrato

– inibita retroattivamente dal palmitato

– inibita covalentemente per fosforilazione

(controllata da glucagone/adrenalina)

• La citrato liasi è sotto il controllo dell’insulina

defosfo-ACC attiva

a basso [citrato]

fosfo-ACC attiva solo ad alto [citrato]

Regolazione ormonale

Modificazioni degli acidi grassi

• Allungamento da palmitato (reazioni non

citosoliche: reticolo endoplasmico, mitocondri)

• Introduzione di doppi legami (desaturazione)

• Nei mammiferi alcuni poli-insaturi devono

essere assunti con la dieta (essenziali)

Destino degli acidi grassi

• In gran parte sono incorporati

– nei triacilgliceroli (di deposito)

– nei glicerofosfolipidi (delle membrane)

• Intermedio della sintesi è il glicerolo-3-fosfato

Il fosfatidato, un

intermedio comune

Al glicerolo-3-fosfato

si esterificano due acili

TRIACIL-

GLICEROLI

FOSFOLIPIDI

DEGRADAZIONE DEGLI

AMMINOACIDI� Gli amminoacidi derivano:

– dalla demolizione enzimatica delle proteine della dieta (digestione)

– dal turn-over fisiologico delle proteine cellulari (attraverso sistemi complessi - proteasoma)

– In caso di digiuno, proteine cellulari sono usate come “combustibile”

� non vengono immagazzinati

� nella degradazione:

– lo scheletro carbonioso viene recuperato

– il gruppo amminico

� può essere recuperato per altre sintesi

� viene eliminato

glucosio

proteine intracellulari

proteine della dieta

urea (prodotto di

eliminazione dell’azoto)

Destino dell’ammoniaca nei vertebrati

Animali ammoniotelici:

vertebrati acquaticiAnimali ureotelici:

molti vertebrati

terrestri; squali

Animali uricotelici:

rettili, uccelli.

L’acido urico è il

catabolita delle purineNegli animali terrestri, forma non tossica e che

limiti il dispendio di acqua

proteine della dieta

Reazioni di transaminazione

Il gruppo amminico viene trasferito da un amminoacido ad un chetoacido (di solito l’α-chetoglutarato)

Ad esempio,

chetoglutarato + alanina ⇔ glutammato + piruvato

Il meccanismo di reazione a ping-pong coinvolge come coenzima il piridossal-fosfato

Vitamina B6 (piridossina) e

piridossal-fosfato (aldeide)

� Partecipa a numerosi tipi di reazioni

� Di solito, legato covalentemente a un gruppo ε-NH2 di una lisina dell’enzima tramite una base di Schiff

� Va incontro a trasformazioni reversibili

L’anello del PLP, una

“trappola per elettroni”

PLP è normalmente

legato all’enzima

tramite ε-NH2 di una

lisina

Il meccanismo della transamminazione

La glutammato deidrogenasirilascia ammoniaca nel fegato

Enzima mitocondriale

Basso livello energetico (ADP): vengono

demoliti amminoacidi

L’ammoniaca è trasportata nel sangue come glutammina...

glutammato + NH3 + ATP glutammina + ADP + Pi

La reazione è catalizzata da una glutammina sintetasi

(richiede ATP) mentre la reazione inversa, che “restituisce”

la ammoniaca, è catalizzata dalla glutamminasi

La glutammina è utilizzata per la sintesi di composti azotati

quali i nucleotidi purinici

La glutammina è presente nel sangue a concentrazioni elevate

(rispetto ad altri amminoacidi)

Ciclo dell’alanina

� Nel muscolo, gruppi amminici sono trasferiti

prima al glutammato e poi per

transamminazione al piruvato (dalla glicolisi)

che si trasforma in alanina

� l’alanina è trasportata al fegato

� per transamminazione si riforma piruvato

(che nella gluconeogenesi ritorna a glucosio)

e glutammato

Il destino dell’ammoniaca

Il ciclo dell’urea� Avviene nel fegato

� Cinque reazione enzimatiche (1 + 4 nel ciclo)– le prime due nei mitocondri, le altre nel citosol

� Si “consuma” ATP

� Un gruppo amminico deriva dal glutammato

mediante GDH

� Il secondo gruppo amminico deriva da un aspartato

� Stretto collegamento tra i cicli dell’urea e di Krebs

� Il ciclo è regolato

0. “Attivazione”dell’ammoniaca

(reazione preliminare)

carbamil-fosfato

sintetasi I

Esiste una carbamil-fosfato

sintetasi II citosolica coinvolta

nella sintesi dei nucleotidi

pirimidinici

carbossi-fosfato

Il ciclo dell’urea (Krebs, 1932)

1. Ornitina transcarbamilasi(mitocondriale)

L’ornitina funge da accettore di un gruppo carbammilico

La citrullina formata nei mitocondri passa nel citosol

2. Argininosuccinato sintetasiIl secondo gruppo amminico è portato dall’aspartato, il cui

gruppo amminico condensa con il carbonile della citrullina

citrullil-AMP

3. Argininasuccinato liasi

La via può essere utilizzata per la sintesi di arginina

4. Arginasi

L’ultima reazione rigenera l’ornitina.

L’arginina tramite la NO sintasi è il precursore dell’ossido nitrico

NO, un importante mediatore che agisce sul messaggero GMP ciclico

Collegamenti tra ciclo dell’urea e ciclo di

La sintesi dell’urea è

regolata dall’ N-

acetil-glutammato

A lungo termine, viene

regolata anche la sintesi

degli enzimi coinvolti

La sintesi dell’urea

aumenta in caso di dieta

iper-proteica o di

digiuno prolungato

Gli amminoacidi sono

degradati, attraverso reazioni

“dedicate”, a intermedi meta-

bolici comuni

Biosegnalazione• Nei sistemi multicellulari, segnali chimici inducono/

coordinano risposte fisiologiche interagendo con

recettori

– Specificità: complementarietà tra segnale e recettore

– Affinità

– Sensibilità

– Integrazione: più segnali coordinati

– Amplificazione in cascataSEGNALE

Segnalazione e recettori di membrana

• Rilascio del segnale (primo messaggero: ad

esempio, un ormone)

• Interazione con il recettore specifico

• Trasferimento del messaggio (trasduzione)

tramite secondo messaggero

• Attivazione di effettori come risposta (spesso

enzimi intracellulari)

• Spegnimento/desensibilizzazione

Desensibilizzazione

L’attivazione del recettore può

scatenare un meccanismo

retroattivo che “spegne” il

recettore o lo rimuove dalla

superficie cellulare

SEGNALE

RISPOSTA

L’adrenalina (epinefrina)

Deriva dalla tirosina

Sintetizzata nelle ghiandole surrenali

Recettori a proteina G e Adrenalina

Da: Stryer

Recettori a proteina G (GPCR)

� Recettore con 7 eliche trans-membrana

� L’interazione recettore attivato-proteina G (trimero

αβγ) provoca il legame del GTP

� La subunità α si stacca da βγ e stimola la

produzione di AMP 3’-5’ciclico da parte della

adenilato ciclasi rivolta verso l’interno;

� Lo stimolo è limitato nel tempo: GSαidrolizza GTP

(attività GTPasica) e si riassocia con βγ

� AMPc ha vita breve (è idrolizzato da fosfodiesterasi

dei nucleotidi ciclici)

Adrenalina e recettori a proteina G1. Adrenalina si

lega al suo

recettore

2. Il recettore occupato

provoca lo scambio tra

GTP e GDP, attivando Gs

3. Gs αααα si sposta verso

l’adenilato ciclasi

attivandola

4. Adenilato ciclasi

catalizza la formazione di

5. PKA è

attivata da

6. La fosforilazione

di proteine cellulari

da parte di PKA

causa la risposta

7. AMPc è degradato,

invertendo l’attivazione

di PKA

L’adenilato ciclasi

AMP ciclico attiva la proteina chinasi A (PKA)

• PKA regola numerosi enzimi a valle

(sequenze consenso)

• I numerosi passaggi amplificano il

segnale

• L’effetto è contrastato da fosfoproteine

fosfatasi

• Molte molecole regolatrici variano i

livelli di AMPc

• In alcuni casi l’azione di PKA arriva al

nucleo (effetti sulla trascrizione)

PKA inattiva:

Le subunitàregolatrici hanno i siti per AMPc vuoti

Le subunità catalitichehanno i siti di legame bloccati dalle subunitàregolatrici

Le subunitàregolatricilegano AMPc

PKA attiva:

Le subunitàcatalitiche hanno i siti di legame liberi

La via del fosfatidilinositolo

Recettori accoppiati alla fosfolipasi C:

la via del fosfatidilinositolo

La via del fosfatidilinositolo

• La fosfolipasi C è attivata dal complesso ormone-recettore tramite una proteina G;

• Agisce sul fosfatidilinositolo 4,5 bis-fosfato (PIP2) liberando due secondi messaggeri:

– diacilglicerolo (DAG) (in membrana)

– Inositolo 1,4,5 trisfosfato (IP3) (nel citosol)

• IP3 favorisce il rilascio di calcio da depositi intra-cellulari

• Il diacilglicerolo attiva proteine chinasi (PKC)

• Anche il calcio funziona da secondo messaggero

Recettori con attività tirosina chinasica

(RTK): il recettore dell’insulina

• Recettore (INS-R)

– Due subunità α recettoriali,

verso l’esterno

– Due subunità β transmembrana

con attività Tyr proteina

chinasica

• In seguito al segnale le

subunità β si autofosforilano e

si attivano, fosforilando altre

proteine bersaglio e attivando

una cascata.

Ormoni e regolazione metabolica

• Derivati da un amminoacido

• Peptidici

• Steroidi (recettori nucleari)

Regolazione ormonale del

metabolismo energetico

• Controllo della glicemia: azione coordinata di

insulina, glucagone, adrenalina…

– Adrenalina: derivata da un amminoacido

– Glucagone: piccolo peptide

– Insulina: piccolo peptide

• Controllo della lipolisi

“Fight or run”

Glicogenolisi: cascata di segnali

forma “a” attiva

ed indipendente da

effettori allosterici

forma “b” meno

attiva e dipendente

da fattori allosterici

Insulina

• Ormone peptidico (PM = 5800 Da, due catene) rilasciato

dal pancreas

• Aumenta la velocità di trasporto del glucosio

• Abbassa [AMPc]

• Attiva fosfoproteina fosfatasi-1 (defosforilazioni)

– si attiva la glicogeno sintasi

– si inattiva la glicogeno fosforilasi

• Attiva la fosfofruttochinasi-1 (PFK-1) (glicolisi)

• Attiva la sintesi di acidi grassi (favorisce la

defosforilazione di ACC)

• Favorisce la sintesi dei triacilgliceroli

Iperglicemia: secrezione di insulinaIngresso di glucosio nelle cellule per

aumentato numero di trasportatori sulla membrana

Attivazione della GLICOGENO SINTASI

DIMINUZIONE DELLA GLICEMIA

Aumento della sintesi degli acidi grassi e dei trigliceridi

Bassa [glucosio] nel sangue

Glucagone

[AMPc]

Proteina chinasi A, fosforilazioni di enzimi

Attivazione di FBPasi-2, disattivazione di PFK-2

[F2,6P]

Attivazione di FBPasi, disattivazione di PFK-1

Aumento della gluconeogenesi

Regolazione della

glicemia: glucagone

Aumento glicogenolisi

Il fruttosio 2,6-bisfosfato è un potente

modulatore

La glicolisi è attivata La gluconeogenesi è rallentata

Ruolo del fruttosio 2,6-bisfosfato

Enzima tandem e regolazione

• Il fruttosio 2,6-bisfosfato è sintetizzato e scisso da

due attività sullo stesso enzima: PFK-2 e Fruttosio

BisFosfatasi-2, (FBP-2)

• L’enzima è sotto controllo covalente e ormonale:

la fosforilazione PKA-dipendente inattiva PFK-2 e

attiva la fosfatasi FBPasi-2

Regolazione

ormonale della

lipolisi

adrenalina

Glucagone/adrenalina

stimolano la lipolisi

attraverso la

fosforilazione AMPc-

dipendente della lipasi.

L’insulina si oppone

alla attività

dell’adrenalina,

inattivando la lipasi.

defosfo-ACC attiva

a basso [citrato]

fosfo-ACC inattiva (attiva solo ad alto [citrato])

Regolazione

ormonale

della sintesi di

acidi grassi

Come si ricava l’equazione di Michaelis-Menten

E + S ↔ ES → E + P

Essendo in condizioni di v0 , la reazione inversa da P verso ES si può trascurare.

Lo stadio lento è la dissociazione del complesso (reazione di I ordine):

V0 = k3 [ES]

Assunzione dello stato stazionario:

d [ES]/dt = 0

In questo caso, le velocità di formazione e dissociazione del complesso sono uguali:

k1 [E][S] = (k2 + k3) [ES]

Esprimiamo [E] (enzima libero) rispetto all’enzima totale [Et] (libero e complessato):

[E] = [Et] - [ES]

Sostituendo:

k1 {[Et] – [ES] }[S] = (k2 +k3) [ES]

Sviluppando:

[Et] [S] – [ES] [S] = (k2 + k3) [ES]

Definiamo:

Km = (k2 + k3)

[Et] [S] – [ES] [S] = Km [ES]

Raccogliamo e ricaviamo [ES]:

[ES] {Km + [S] } = [Et] [S]

[ES] = [Et] [S]

Km + [S]

Dato che abbiamo definito la velocità iniziale:

V0 = k3 [ES]

Sostituendo il valore ricavato per [ES]:

V0 = k3 [Et] [S]

Km + [S]

Dal grafico si osserva che la velocità massima si ottiene quando l’enzima è saturo,

cioè tutto in forma di complesso: [ES] = [Et]:

per [S] grande,

VM = k3 [Et]

Da cui, sostituendo:

V0 = VM [S]

Km + [S]

Si può definire Km come la [S] alla quale la velocità è pari a metà di quella massima:

V0 = VM/2 (confronta con la p50 per la mioglobina)

hakim biochimica.pdf

Documents

Transcript of hakim biochimica.pdf

polteksahid.ac.id · ALIFIN VENDRO SURYA KUMARA AUDRIC JONATHAN CALLISTA WAHYU SABATYA CHAIRUL ALFARIZKI CONY ROES NOVITA MONIZ DAI-JD HAKIM BAIHAQI DAVID DESEMBERINO DHANDE HENDRICO

DRAFT SKRIPSI PENYELESAIAN SENGKETA KEWARISAN … · 2019. 11. 4. · draft skripsi penyelesaian sengketa kewarisan dengan cara mediasi oleh hakim di pengadilan agama kelas i a padang

Hakim Caden, da Samuele e Luna Sardas · 2009. 9. 29. · Militò nella brg Stella rossa Lupo con funzione di comandante di compagnia e operò sull'Appennino tosco-emiliano. Nell'eccidio

AL- HASSANEIN FATIH. AL-HAKIM (ayatollah), SCIRI. H08492€¦ · (attribuita al Mossad) avvenuta in una villa di Cartagena presso Tunisi; assieme a lui uccisi anche Ābu Iyad e Abdel

Hakim Bey - Millennium: dalle t.a.z. alla rivoluzione (1997)

29.07-03Naji Hakim (F), organo Marco Zambelli, direttore Ore 20,30 Concerto di campane a cura dell’Associazione Campanari Liguri Mercoledì 17 agosto 2016 - ore 21,15 Pontedassio

IMPLEMENTASI METODE TABARAK TAHFIDZ AL-QUR’AN ...etheses.uin-malang.ac.id/18016/7/16110176.pdfKakak dan Adik-adikku tercinta “Firda Zulfatudhucha, Muhammad Zain Abdul Hakim, Muhammad

Dakwah Bil Hal: Implementasi Nilai Amanah dalam ...eprints.umm.ac.id/58038/7/Hakim - Da’wah Bil Hal Zakah...Dakwah Bil Hal: Implementasi Nilai Amanah dalam Organisasi Pengelola Zakat