Ereditarietà X-Linked

Madre Padre

Figlia Figlio

X X X Y

Cromosoma X Cromosoma Y

Geni sottopostiad inattivazione

Geni attivi Regionepseudo-autosomica

X InactiveSpecificTranscriptXq13

circa 80 geni- SRY- Geni della spermatogenesicirca 870 geni

Cromosoma Y

Delezioni interstiziali dell’Ynel 5-10% dei soggetti conazoospermia o grave oligospermianon ostruttiva

Delezioni del cromosoma YLe microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa

importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione

• fornisce un corretto inquadramento diagnostico • permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili• ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le

tecniche di riproduzione assistita

almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi

Casi di azoospermia o oligospermia severa :

il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y

il 5-10% è portatore di delezioni sub-microscopiche di Yq NON sono individuabili all’analisi del cariotipo (microdelezioni) ma possono essere identificate mediante STS-PCR

STS “sequence tagged sites” sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR

Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001)

Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletionsM.Simoni et al.

• elenco di STS da non utilizzare• set di STS primers consigliati:

AZFa: sY84,sY86AZFb: sY127,sY134AZFc: sY254,sY255

Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino all’estremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati all’ICSI)

Multiplex a

sY254 (c)

sY 86 (a)

sY127 (b)

Multiplex b

sY255 (c)

sY134 (b)

sY84 (a)

Frequenza delle microdelezioni Y

estema variabilità tra i vari studi (1%-55%)dipende dai criteri di selezione

pazienti azoospermici o gravemente oligospermici(<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’11%(solo le forme idiopatiche : 18%)

se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’1%

Casistica laboratorio Genetica Medica:1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c2/600 AZFa+b+c Tot. 23/600 (3.8%)

AZFaDBY - UTY

USP9Y*

Del

interstizialerara

Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS)

AZFb RBMY1A(multicopia)

Del

interstizialerara

Arresto della spermatogenesi alla pubertà prima o durante la meiosi

AZFc

DAZ(4-7 copie)

BPY2

CDY1(2 copie una nel cluster DAZ una all’estremo 3’)

Del

interstiziale ccomune Presenza di cellule

germinali in vario stadio di maturazione ma pochi spermatozoi (periodo fertile giovanile)

Del

terminale cintermedia

Del

interstiziale bccomune

Fenotipo variabile dalla SCOS alla oligospermia

Del

terminale abcrara

Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS)

Mutazioni puntiformi in USP9Y* in 2 maschi con ipospermatogenesi

Variabilità fenotipica delle delezioni

• non costante correlazione genotipo-fenotipo• in genere:

– azoospermia (84%)

– grave oligospermia (meno di 1 x106ml) (14%)

– moderata oligospermia (1-5 x106ml) (2%)

• alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili

• del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave

• del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY

• del Y molto centromeriche associate a bassa statura

Sex reversal

Inattivazione dell’X solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine

stadio di morula

casualeinnattivazione X pat. / X mat.

propagazione clonale

Zigote femminile

meno di100 cellule

Inattivazione bilanciata dell’X Cosa succede se una donna porta un gene non

funzionante sull’X

Zigotefemminile

il 50% delle cellulenon esprime quel gene

Innattivazione casuale X paterno / X materno

gene mutato

Inattivazione dell’X

• Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e femmine

• Alcuni geni sfuggono all’inattivazione

(regioni pseudo-autosomiche alle estremità del cromosoma X)

• I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per l’inattivazione

• La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione

Inattivazione sbilanciata dell’X

Perchè ?

• Un cromosoma X porta una mutazione LETALE

• C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma

• La regione che controlla l’inattivazione è alterata

• E’ avvenuto “per caso”

Inattivazione Sbilanciata dell’X:effetto della selezione

Zigotefemminile Selezione

nei tessuti in cui la funzione del gene è

indispensabile

Inattivazionecasuale

stadio embrionale

gene mutato

Malattie X-Linked recessive

Femmina Femmina Maschio Maschio SANA PORTATRICE MALATO SANO

Madre( portatrice )

Padre

X X X Y

Ereditarietà X-Linked recessiva

Ereditarietà X-Linked recessiva

Distrofia Musculare di Duchenne DMD

Giorgio Ester Enrico

Giorgio ha 3 anni

• modesto ritardo nell’iniziare a camminare

• cammina con lentezza

• ha difficoltà a stare eretto

• non corre

• all’esame obiettivo– ipertrofia dei gastrocnemi– debolezza dei muscoli prossimali

• Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui

Biopsia Muscolare

ControlloNormale

Giorgio

Colorazione Ab anti-Distrofina

ControlloNormale

Giorgio

Distrofina

proteina associata alla membrana :

- il dominio N-terminale lega l’actina

- lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica- una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio

- il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana

Gene DMD

2,4 Mb (12 cMorgan)8 promotori 79 esoni (0.6%)mRNA 14 kb trascritto in 16 ore

DM Duchenne : mancata espressione di distrofina - delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%)

- mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%)

- delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine)

DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina - delezioni “in-frame” (85%)

- di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”

Ricerca diretta delle delezioni nella DMD

- preparazione del DNA genomico- amplificazione con PCR multiplex

di 9 o più esoni- separazione dei frammenti in gel di agarosio- visualizzazione con EB e raggi UV- fotografia (o immagine digitale)

Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne

• Diagnosi confermata da biopsia muscolare

• Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati )

• Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme

Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300tasso di nuove mutazioni di 10-4 / meiosi (1/3 dei casi)

Albero famigliare allargato dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna

Enrico Ester Giorgio Rosa

GiovannaElena

La cugina Rosa vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato

• Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è =

25%

• Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?

Creatina Kinasi (CPK)

• fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato

• molto elevata nei maschi malati

• livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici

– Giovanna e Rosa hanno CPK normale

Stima “Bayesiana” del rischio

Probabilità “complessiva “ :tiene conto della

probabilita a priori di essere e di non essere portatore

( appartenendo ad dato albero famigliare )

e di altri fattori che

modificano queste due probabilità (prob. condizionali)

Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi

sani

CPK normale

Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale

GiovannaElena

Quale è la probabilitàche Zia Giovanna sia portatrice ?

Che lo sia Che non lo sia

Probabilità “ a priori ” 1 / 2 1 / 2

con CPK Normale ? 1 / 3 1

con 2 figli Maschi Sani ? 1 / 4 1

Prob. condizionale 1/2 .1/3 .1/4 = 1 / 24 1 / 2

Prob. finale 1 : 12 1 / 24

1 / 24 + 1 / 2= 1 / 13

Cugina Rosa : ha 1/2 della probabilità di Giovanna

e CPK normale

CPK normale

Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale

GiovannaElena

Il rischio a priori per Rosaè

la metà di quello di Zia Giovanna

1/13 x 1/2 = 1/26

Quale è la probabilitàche Rosa sia portatrice ?

Che lo sia Che non lo sia

Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / 26 25 / 26

con CPK Normale ? 1 / 3 1

Prob. “ a posteriori ” 1/26 .1/3 = 1 / 78 25 / 26

Prob. finale 1 : 75

1 / 78

1 / 78+25 /26= 1 / 76

Che lo sia Che non lo sia

Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / 26 25 / 26

con CPK Normale ? 1 / 3 1

Prob. “ a posteriori ” 1/26 .1/3 = 1 / 78 25 / 26

Prob. finale 1 : 75

Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto

1/ 76 x 1/4 = 1 / 304

Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione

1/304 è la probabilità che la cugina Rosapossa avere un figlio affetto

CPK normale(1/13)

Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale (1/76)

GiovannaElena

Uso del Linkage nella malattia DMD( mutazione non trovata )

Enrico Ester Giorgio Rosa

GiovannaElena

Analisi di linkage

• Linkage = concatenazione• Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo

stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi

Gene con mutazione

Allele 1 locus polimorfico A (1, 2, 3, 4)

Allele 3 locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)

Allele 2

Gene wt

Allele 1

La frequenza di ricombinazioneè una “misura della distanza”tra loci diversi :

= 0.5 (50%) loci lontani = 0 (0%) loci vicinissimi = 0.02 (2%) loci vicini

unità di misura = centiMorgancM = 1 ricombinazione/100 meiosi

Analisi di linkage

1

Mut

3

2

wt

1

2

Mut

3

1

wt

1

Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD

2,4 Mb (12 cMorgan)

Eson

e 1

Eson

e 79

Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli

Microsatellite C

Microsatellite B

Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli

G E

N E

D

MD

5’

3’

Uso del Linkage: 1 marcatore (A) 5’ UT

( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? )

Enrico Ester Giorgio Rosa

GiovannaElena

1

1

7 73

7 3

1

Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)

( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? )

Enrico Ester Giorgio Rosa

GiovannaElena

1

1

7 73

7

4

4

5 56

5

3

6

1

4

Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)

Enrico Ester Giorgio Rosa

GiovannaElena

1

1

7 73

7

4

4

5 56

5

3

6

1

4

7

4

9

2

9

2

Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ?

1 e 2 ricombinazioni tra marcatori

mut

mut

1mut

mut

1mut

mut

1

2

Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD

2,4 Mb (12 cMorgan)

Eson

e 1

Eson

e 79

Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli

Microsatellite C

Microsatellite B

Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli

G E

N E

D

MD

5’

3’

0.124 = 0.00024 ricombinazioniin 1 su 5000 casi

Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ??

Enrico Ester Giorgio Rosa

GiovannaElena

17 73

7

45 56

5

3

6

1

4

1

4

1

4

1

4 Nuove mutazioni10-4 / meiosi(1/3 dei casi)

Analisi del rischio in famiglie X-linked

• Informazioni dall’albero famigliare

• Calcolo del rischio secondo Bayes

• Ricerca della mutazione (test diretto)

• Uso del linkage (test indiretto)

• Attenzione alle ricombinazioni !

( usare più marcatori… meglio se intragenici )

05/04/2005

Davide 16

2 2 3 1 3 1 1 1 1

Francesco

1 1 1 2 2 3 2 2 1

Martina

1 21 22 32 11 32 12 11 11 1

30

1 11 11 22 22 33 12 12 11 1

14

62

82

18

5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 15’-5N3 introne 15’-7n4 introne 25STR44 13.8 kb a valle dell’esone 44STR45 1.2 kb a valle dell’esone 45STR49 introne 49DMD1-2c introne 56DXS1214 introne 623’DYS MS esone 79

Caso negativo per delezionie duplicazioni DMD

05/04/2005

Davide 16

2 2 3 1 3 1 1 1 1

Francesco

1 1 1 2 2 3 2 2 1

Martina

1 21 22 32 11 32 12 11 11 1

30

1 11 11 22 22 33 12 12 11 1

14

62

82

18

5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 15’-5N3 introne 15’-7n4 introne 25STR44 13.8 kb a valle dell’esone 44STR45 1.2 kb a valle dell’esone 45STR49 introne 49DMD1-2c introne 56DXS1214 introne 623’DYS MS esone 79

In caso di gravidanza:- villocentesi in 11ma set- determinazione del sesso (SRY)- informativa solo la trasmissione Xp

111223221

05/04/2005

Davide 16

2 2 3 1 3 1 1 1 1

Francesco

1 1 1 2 2 3 2 2 1

Martina

1 21 22 32 11 32 12 11 11 1

30

1 11 11 22 22 33 12 12 11 1

14

62

82

18

1 1

introne 1 - 25esone 63 - 79