Dalla sequenza alla struttura

Dalla sequenza alla struttura

O2

VLSEGEWQLVLV . . .Sequenza Struttura Funzione

Che informazioni offre la struttura?

• Conformazione dei siti attivi e di legame

• Orientazione dei residui conservati

• Interpretazione di meccanismi

• Visualizzazione di cavità

• Calcolo di potenziale elettrostatico

• …

Esempio

• FtsZ – divisione cellulare in procarioti, mitocondri e cloroplasti.

• Tubulina – componente strutturale dei microtubuli – comunicazione intracellulare e divisione cellulare.

• FtsZ e Tubulina hanno bassa similarità di sequenza e non sembrerebbero omologhe.

FtsZ e tubulina sono omologhe?

• Proteine che hanno conservato la struttura tridimensionale possono derivare da un progenitore comune anche se la divergenza della sequenza non permette più di riconoscere l’omologia.

Burns, R., Nature 391:121-123Picture from E. Nogales

Un altro esempio

• α-lattalbumina e lisozima possiedono:– Stesso fold– Moderata similarità– Diversa funzione

ALA

PRO

TRP

up-and-down barrel

greek key

jelly-roll

Esempi di folding:

Domìni

Struttura quaternaria

Cristallografia a raggi X

• Ottenere cristalli della proteina– 0.3-1.0 mm– Le singole molecole sono ordinate in modo

periodico, ripetitivo.

• La struttura è determinata dai dati di diffrazione.

Diffrazione a raggi X

Image from http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html

Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.

• Le proteine devono cristallizzare– Grande quantità– Solubili

• Accesso a radiazione adatta

• Tempo di calcolo per risolvere la struttura

Cristallografia a raggi X

InstrumentationInstrumentation

or synchrotron X-raysor synchrotron X-rays

InstrumentationInstrumentation

ESRF - GrenobleESRF - Grenoble

InstrumentationInstrumentation

Elettra - Trieste Elettra - Trieste

Dalla densità elettronica al modello strutturale

+ =

Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D

• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.

• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.

Risoluzione

Campo magnetico

NOE (Nuclear Overhauser Effect)

NMR

Il campo magnetico

Magnete a 400 MHzMagnete a 900 MHz

Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M €

n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)

• Proteine in soluzione

• Limite di dimensione ~ 40 kDa

• Proteine stabili a lungo

• Marcatura con 15N, 13C, 2H.

• Strumentazione molto costosa

• Tempo per assegnare le risonanze

Regions of the 1H NMR Spectrumare Further Dispersed by the 3D Fold

What would the unfolded protein look like?

Resolve Peaks By Multi-D NMR

A BONUSregions in 2D spectra provide protein fingerprints

If 2D cross peaks overlap go to 3D or 4D …..

Conformational Ensemble Representing an NMR Structure

C

N

Pro e contro

X-ray

• Richiede cristalli, problematico

• Non ha limiti (teorici) di grandezza

• Piú preciso

• Risoluzione

• Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida

• Una “soluzione“

NMR

• Possibile in soluzione, più semplice

• Limitato a proteine fino a circa 300 residui

• Meno preciso

• Numero di vincoli

• Struttura nativa in soluzione, flessibile

• Molti modelli

X-ray NMR

Protein Data Bank (PDB)

• URL: http://www.rcsb.org/pdb/

• Coordinate 3-D di strutture proteiche

• Formato unico

• Tutte le strutture risolte con i raggi X e NMR

• Più vecchia della maggior parte degli altri database

• Strutturata male a causa dello sviluppo storico

Il Protein Data Bank

Crescita del PDB

Motivi strutturali depositati ogni anno

Superfamiglie depositate ogni anno

Formato PDB I

HEADER ONCOGENE PROTEIN 06-JUN-91 121P 121P 2

COMPND H-RAS P21 PROTEIN COMPLEX WITH GUANOSINE-5'-[B,G-METHYLENE] 121P 3

COMPND 2 TRIPHOSPHATE 121P 4

SOURCE HUMAN (HOMO SAPIENS) CELLULAR HARVEY-RAS GENE TRUNCATED AND 121P 5

SOURCE 2 EXPRESSED IN (ESCHERICHIA COLI) 121P 6

AUTHOR U.KRENGEL,K.SCHEFFZEK,A.SCHERER,W.KABSCH,A.WITTINGHOFER, 121P 7

AUTHOR 2 E.F.PAI 121P 8

...

REMARK 1 121P 17

REMARK 1 REFERENCE 1 121P 18

REMARK 1 AUTH U.KRENGEL,I.SCHLICHTING,A.SCHEIDIG,M.FRECH,J.JOHN, 121P 19

REMARK 1 AUTH 2 A.LAUTWEIN,F.WITTINGHOFER,W.KABSCH,E.F.PAI 121P 20

REMARK 1 TITL THE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF P21 IN THE 121P 21

REMARK 1 TITL 2 CATALYTICALLY ACTIVE CONFORMATION AND ANALYSIS OF 121P 22

REMARK 1 TITL 3 ONCOGENIC MUTANTS 121P 23

REMARK 1 REF NATO ASI SER.,SER.A V. 220 183 1991 121P 24

REMARK 1 REFN ASTM NALSDJ US ISSN 0161-0449 2002 121P 25

...

SEQRES 1 166 MET THR GLU TYR LYS LEU VAL VAL VAL GLY ALA GLY GLY 121P 56

SEQRES 2 166 VAL GLY LYS SER ALA LEU THR ILE GLN LEU ILE GLN ASN 121P 57

SEQRES 3 166 HIS PHE VAL ASP GLU TYR ASP PRO THR ILE GLU ASP SER 121P 58

...

Formato PDB IIHELIX 1 A1 LYS 16 GLN 25 1 121P 80HELIX 2 A2 SER 65 THR 74 1 121P 81...SHEET 1 S 6 GLU 37 ILE 46 0 121P 85SHEET 2 S 6 GLU 49 THR 58 -1 O LEU 53 N LYS 42 121P 86SHEET 3 S 6 THR 2 VAL 9 1 N LEU 6 O ASP 54 121P 87...TURN 1 T1 ALA 11 VAL 14 121P 91TURN 2 T2 ILE 46 GLU 49 121P 92TURN 3 T3 ALA 83 ASN 86 121P 93...ATOM 1 N MET 1 -7.176 32.630 -6.655 1.00 14.06 121P 104ATOM 2 CA MET 1 -5.913 31.928 -6.676 1.00 17.27 121P 105ATOM 3 C MET 1 -5.903 30.860 -5.600 1.00 16.41 121P 106ATOM 4 O MET 1 -6.703 30.881 -4.654 1.00 16.12 121P 107ATOM 5 CB MET 1 -4.712 32.869 -6.415 1.00 17.94 121P 108ATOM 6 CG MET 1 -4.594 33.420 -4.990 1.00 19.41 121P 109ATOM 7 SD MET 1 -3.193 34.558 -4.899 1.00 21.82 121P 110ATOM 8 CE MET 1 -4.325 35.886 -4.618 1.00 23.68 121P 111ATOM 9 N THR 2 -4.966 29.934 -5.760 1.00 15.08 121P 112ATOM 10 CA THR 2 -4.759 28.930 -4.751 1.00 16.71 121P 113ATOM 11 C THR 2 -4.312 29.597 -3.441 1.00 16.63 121P 114...HETATM 1324 PG GTO 167 5.150 32.173 22.030 1.00 11.69 121P1427HETATM 1325 O1G GTO 167 4.768 32.597 23.390 1.00 13.29 121P1428HETATM 1326 O2G GTO 167 4.164 32.683 21.069 1.00 12.61 121P1429HETATM 1327 O3G GTO 167 4.834 30.641 22.025 1.00 13.18 121P1430...

X Y Z B-factor

ATOM 1 CA GLU 225 -0.900 -1.002 39.233 1.00 70.00 1HXN 170ATOM 2 C GLU 225 -0.185 0.146 39.970 1.00 70.00 1HXN 171ATOM 3 O GLU 225 -0.514 1.329 39.758 1.00 70.00 1HXN 172ATOM 4 N SER 226 0.788 -0.203 40.823 1.00 70.00 1HXN 173ATOM 5 CA SER 226 1.534 0.805 41.594 1.00 70.00 1HXN 174ATOM 6 C SER 226 2.231 1.806 40.681 1.00 68.89 1HXN 175ATOM 7 O SER 226 1.883 1.952 39.514 1.00 70.00 1HXN 176ATOM 8 CB SER 226 2.572 0.130 42.515 1.00 70.00 1HXN 177ATOM 9 OG SER 226 3.237 -0.941 41.848 1.00 70.00 1HXN 178ATOM 10 N THR 227 3.242 2.478 41.223 1.00 65.51 1HXN 179ATOM 11 CA THR 227 3.989 3.417 40.410 1.00 70.00 1HXN 180ATOM 12 C THR 227 4.274 2.705 39.080 1.00 56.25 1HXN 181ATOM 13 O THR 227 4.179 3.296 38.022 1.00 44.63 1HXN 182ATOM 14 CB THR 227 5.354 3.797 41.074 1.00 70.00 1HXN 183ATOM 15 OG1 THR 227 5.114 4.682 42.172 1.00 70.00 1HXN 184ATOM 16 CG2 THR 227 6.256 4.492 40.065 1.00 70.00 1HXN 185